草莓炭疽病菌C·siamense特异性PCR检测引物及其检测方法与应用与流程

本发明涉及草莓炭疽病菌c·siamense特异性pcr检测引物及其检测方法，专用于草莓炭疽病菌快速、灵敏和特异的分子检测，同时可用于田间草莓炭疽病的早期诊断和病菌的检测和鉴定，属于农作物病害检测、鉴定及防治技术领域。

背景技术：

近年来，我国草莓产业发展迅速，为主产区带来了显著的经济效益和社会效益，但病害的发生对草莓的产量和品质造成了巨大的损失。其中，由胶孢炭疽菌复合种（colletotrichumgloeosporioides(penz.)penz.&sacc.）内的c•siamense引起的炭疽病（anthracnose）是目前草莓生产中极具威胁的重要病害之一，在我国江苏、浙江、上海、湖北等地均有该病普遍发生的报道。该病可以侵染草莓的各个部位，引起叶斑、芽腐、花腐等症状，当根颈被侵染时可导致整个草莓植株死亡，起初是叶片萎蔫下垂，后逐渐枯死。草莓整个生长期均可受该病危害，尤以育苗期和移栽初期发病最重。该病的致病菌可以菌丝体或分生孢子盘的形式生活或潜伏在植株上，种苗、土壤、植物残体及中间寄主均可成为感染源，若能检测及监测田间病原菌的感染源，将有助于此该病的预防及管控。

草莓炭疽病菌的传统检测主要依赖组织培养与形态鉴定，这种方法耗时长、程序繁琐、灵敏度低、经验依赖性强，从植物组织上培养出分生孢子通常需要5-7天的时间，检测的成功与否还受采样部位、消毒条件等影响，难以做到对及时、准确的监控。随着分子生物学技术的发展，利用真菌核糖体转录间隔区（internaltranscribedspacer，its）序列的种内保守性、种间可变性及多拷贝的特点，设计特异引物进行聚合酶链式反应（polymerasechainreaction，pcr）扩增，对病原菌进行快速检测和鉴定的技术已得到广泛应用。国内外已有研究人员利用its基因作为病原菌检测靶标，开发出了链格孢菌（alternariaalternaria）、苹果腐烂病菌（valsamalivar.mali）、尖孢镰刀菌（fusariumoxysporum）等不同病原菌的特异性检测引物，进行病原菌的快速、准确检测和鉴定，在草莓上也有尖孢炭疽菌（c.acutatumj.h.simmonds）、灰霉病菌（botrytiscinerea）、c.cingulata等病原菌分子快速检测研究，但目前，关于草莓炭疽病的另一种常见致病菌c•siamense，尚无相关特异、快速pcr检测报道。本发明通过对炭疽菌属（colletotrichum）的its序列进行比对分析，设计出一对可用于特异性检测c•siamense的引物，为草莓炭疽病的准确鉴定和快速检测提供技术和方法，有利于及早有效地采取防治措施。

技术实现要素：

本发明的目的是针对现有技术中对草莓炭疽病菌的检测和鉴定，主要基于形态学特征，方法耗时长、程序繁琐、经验性强、准确度低，难以做到对病害发生的及时检测，继而控制病原菌的传播、流行的问题，提供了一种草莓炭疽病菌特异性pcr检测引物及其检测方法，利用本发明所述的pcr检测引物和检测方法检测草莓炭疽病菌准确性高、特异性强、灵敏度高、易于操作、检测时间短且结果可靠。

技术方案：为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：

1.通过测定草莓炭疽病菌（colletotrichumsiamense）和草莓植株及生长介质中其它真菌的核糖体转录间隔区（its）序列，对草莓植株及生长环境中不同真菌的its序列进行比对分析，设计出对草莓炭疽病菌c•siamense具有特异性扩增的1对引物，其序列为：

上游引物cgint：5’-ggcctcccgcctccgggcgg-3’

下游引物cg478r：5’-tttacggcaagagtccctcc-3’

对草莓炭疽病菌特异性扩增出389bp的产物。

一种草莓c•siamense检测方法，包括以下步骤：

（1）从感染c•siamense的草莓组织中提取dna；

（2）以步骤（1）提取的dna为模板，利用cgint/cg478r这一对引物进行pcr扩增，第一轮取步骤（1）提取的dna原液做模板进行单重pcr扩增，第二轮取第一轮pcr产物作为pcr反应模板进行pcr扩增；

（3）取3μl步骤（2）的pcr扩增产物用琼脂糖凝胶进行电泳分离，电压为70-100v，然后于紫外灯下观察，根据扩增产物的有无及其片段大小对结果进行判断，如果能特异性地扩增出389bp的条带，即可判断检测草莓样品中存在c•siamense。

作为优选方案：草莓c•siamense检测方法，包括以下步骤：

（1）感染c•siamense的草莓叶片dna的提取检测草莓植株中c•siamense前，采用新型植物基因组提取试剂盒（天根，中国）提取总dna，方法参考说明书，取0.5μl作为pcr模板进行扩增。

（2）以步骤（1）提取的dna为模板，利用cgint/cg478r这一对引物进行pcr扩增。pcr反应体系10μl，包括5μlestaqmastermix（康为世纪，中国），0.5μldna模板（20ng/μl），正反向引物各0.25μl（10μm），10%甘油。扩增程序为：96^oc变性5min；96^oc变性30s，50^oc退火45s，72^oc延伸1min，30个循环；最后72^oc延伸7min。

（3）取步骤（2）的pcr扩增产物3.0μl用1.0%琼脂糖凝胶进行电泳分离，goldview染色，70-100v，40min后于紫外灯下观察，根据扩增产物的有无及其片段大小对结果进行判断，如果能特异性地扩增出约389bp的产物，即可判断所述的检测样品中存在c•siamense，否则所述的检测样品中不存在c•siamense。

本发明的关键技术是草莓炭疽病菌c•siamense高效特异性pcr检测引物的设计及其检测方法的建立。为了获得c•siamense的特异pcr检测引物序列，以发病草莓植株中分离到的c•siamense及草莓生长介质与植株中常见真菌为供试材料，采用新型植物基因组提取试剂盒（天根，中国）提取供试菌株基因组dna，具体方法参考说明书。以真菌核糖体基因转录间隔区（its）通用引物its5：5’-ggaagtaaaagtcgtaacaagg-3’和its4:5’-tcctccgcttattgatatgc-3’对供试菌株的its片段进行扩增，pcr反应体系50μl，包括25μlestaqmastermix（康为世纪，中国），2μldna模板（20ng/μl），正反向引物各1.25μl（10μm），10%甘油，不足部分用无菌超纯水补足。扩增程序为：96^oc变性5min；96^oc变性30s，50^oc退火45s，72^oc延伸1min，30个循环；最后72^oc延伸7min。将pcr扩增产物送至南京擎科生物科技有限公司进行测序，将测序得到的草莓炭疽病菌（c•siamense）的its序列与genbank中colletotrichum属20个不同种以及24个对照菌株的its基因序列进行同源性比较分析，根据c•siamense与其它种间的差异位点（在bioedit中比对），用primerprimer5软件设计了c•siamense的特异性引物，引物序列为：上游引物cgint：5’-ggcctcccgcctccgggcgg-3’，下游引物cg478r：5’-tttacggcaagagtccctcc-3’，引物合成由南京擎科生物科技有限公司完成。在已设计特异引物的基础上，通过pcr反应体系和扩增参数的优化，建立草莓炭疽病菌检测方法，以供试的草莓炭疽病菌及其它真菌的基因组dna为模板，对草莓炭疽病菌特异性引物cgint/cg478r的特异性进行验证，结果表明，引物cgint/cg478r只能特异性地从供试的3个草莓炭疽病菌dna中扩增出大小约为389bp的条带，而c.fructicola和其它真菌及阴性对照均无扩增条带。说明该对引物可以将c•siamense与草莓上其它真菌区分开来，具有特异性，可用于草莓炭疽病致病菌c•siamense的快速可靠检测和鉴定。

本发明与现有技术相比，具有以下的技术优势和有益效果：

1.特异性强、准确性高：本发明是根据真菌核糖体转录间隔区（internaltranscribedspacer，its）序列的种内保守性和种间可变性的特点，设计了对草莓炭疽病菌c•siamense具有特异扩增作用的pcr引物，并已经对草莓植株及生长介质中存在的病菌进行了检测验证，只有c•siamense和携带该病菌的草莓组织能特异性地扩增出一条389bp的电泳条带，说明本发明所涉及的引物具有很强的特异性和准确性。

2.灵敏度高：传统的病原菌检测方法是通过分离、纯化和形态学鉴定等步骤，这种方法的成功需要发病组织中积累到足够量的病原体才能成功。而应用本发明设计的特异引物（cgint/cg478r）进行两轮pcr扩增（巢式pcr）后，对草莓炭疽病菌c•siamense的检测灵敏度在dna水平上可达到10μl反应体系中含50fg模板dna，比常规pcr检测高10000倍。

3.实用性好：草莓炭疽病菌的快速检测，具有重要的实际应用价值。传统的草莓炭疽病菌的检测方法一般是在植株出现症状后，借助其发病症状，对病原菌进行分离、纯化、鉴定等一系列繁琐的过程，所需时间较长。而传统的方法由于不能在病害发病前期及时进行田间的病原菌动态监测和检测，时常延误了防治时机，进而需要提高药剂用量，增加用药频率，使病原菌产生了抗药性。本发明可对草莓组织中是否携带c•siamense进行检测，如果能特异性地扩增出389bp的电泳条带，说明植物组织中存在c•siamense，因此本发明可用于草莓炭疽病发病前的早期监测，为确定病害防治最佳时期和防治策略的制定提供科学依据，具有较好的实用性。

4.操作简便、快速：应用本发明的方法，对携带c•siamense的草莓组织进行dna提取、pcr扩增和常规的琼脂糖凝胶电泳后即可判定结果，整个检测过程操作简单，无需对病原菌进行分离培养，大大缩短了检测时间，一般可在6个小时内完成批量样品的检测。

附图说明

图1a和1b分别为利用特异引物cgint/cg478r特异检测草莓中c•siamense的单重pcr和巢式pcr扩增电泳图。图中：泳道m为dl2000marker，泳道1-3为c•siamense，4，c.gloeosporioides；5-6，fusariumoxysporum；7，cercosporacf.malloti；8，herbaspirillumrubrisubalbicans；9，bt-2；10，alternariaalternaria；11，leptosphaeriasp.；12，macrophominaphaseolina；13，hypoxylonsp.；14，plectosphaerellacucumerina；15，epicoccumsorqhinum；16，niqrosporaoryzae；17，ectophomamultirostrata；18，phyllostictacapitalensis；19，arthriniumrasikravindrae；20，penicilliummenonorum；21，fusariumtricinctum；22，talaromycespinophilus；23，mortierellawolfii；24，aspergillusfumigatus；25，penicilliumjanthinellum；26，fusariumavenaceum；27，nectriarigidiuscula；28，阴性对照。

图2a和2b分别为利用特异引物cgint/cg478r进行单重pcr和巢式pcr扩增检测草莓炭疽病菌c•siamense的灵敏度的电泳图。图中：泳道m为dl2000marker，泳道1-7模板dna浓度分别为10ng/μl、1ng/μl、100pg/μl、10pg/μl、1pg/μl、100fg/μl、10fg/μlg，泳道8为阴性对照。

图3为应用本发明设计的特异引物cgint/cg478r及巢式pcr检测方法对自然发病草莓组织的检测结果电泳图。图中：泳道m为dl2000marker，泳道2，6为健康草莓叶片，泳道3，4，5，7为自然发病的草莓叶片，泳道8阴性对照，泳道9为c•siamense纯培养提取的dna。

图4为应用本发明设计的特异引物cgint/cg478r及巢式pcr检测方法对人工接种发病的草莓组织的检测结果电泳图。图中：泳道m为dl2000marker，泳道1为阴性对照，泳道2-4为未接种c•siamense的草莓叶片，泳道5，6为人工接种5×10⁵个孢子/ml菌悬液的草莓叶片，泳道7，8，9为人工接种1×10⁵个孢子/ml菌悬液的草莓叶片，泳道10，11为人工接种1×10⁴个孢子/ml菌悬液的草莓叶片，泳道12，13为人工接种1×10³个孢子/ml菌悬液的草莓叶片，泳道14，15为人工接种1×10²个孢子/ml菌悬液的草莓叶片，泳道16为c•siamense纯培养提取的dna。

具体实施方式

以下结合具体实例对本发明作进一步阐述，但不用来限制本发明的范围。以下实例均按照常规实验条件，或以发明相关文献中所述的操作技术规程，或按照厂商所建议的实验条件。

实例1：pcr检测引物序列的设计及引物对草莓炭疽病菌的特异性扩增

1.引物的设计与合成

将本实验室所测序得到的3株草莓炭疽病菌（c•siamense）及草莓植株及生长介质中常见的24株真菌的its序列与genbank中colletotrichum属20个不同种的its基因序列进行比对分析，根据c•siamense与其它种间的差异位点（在bioedit中比对），用primerprimer5软件设计了c•siamense的特异性引物，引物序列为：上游引物cgint：5’-ggcctcccgcctccgggcgg-3’（millspr,sreenivasaprasads,brownae.1992.detectionanddifferentiationofcolletotrichumgloeosporioidesisolatesusingpcr.femsmicrobiologyletters,98,137-144.），下游引物cg478r：5’-tttacggcaagagtccctcc-3’（自行设计），引物合成由南京擎科生物科技有限公司完成。

2.供试菌株基因组dna的提取

采用新型植物基因组提取试剂盒（天根，中国）提取供试菌株基因组dna，具体方法参考说明书。得到的dna溶液，用nd-1000分光光度计（nanodrop技术股份有限公司）检测dna浓度并稀释至20ng/μl待用。

3.引物特异性pcr验证

以供试的c•siamense及其它真菌的基因组dna为模板，对草莓炭疽病菌c•siamense特异引物（上游引物cgint：5’-ggcctcccgcctccgggcgg-3’，下游引物cg478r：5’-tttacggcaagagtccctcc-3’）的特异性进行验证。pcr反应体系10μl，包括5μlestaqmastermix（康为世纪，中国），0.5μldna模板（20ng/μl），0.25μl引物（10μm），10%甘油，剩余部分用无菌双蒸水补足。扩增程序为：96^oc变性5min；96^oc变性30s，50^oc退火45s，72^oc延伸1min，30个循环；最后72^oc延伸7min。取3μlpcr产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，经goldview染色后于紫外灯下观察，根据dna条带的有无及大小对草莓炭疽病菌c•siamense特异引物的特异性进行验证。

4.引物特异性验证结果

pcr扩增结果表明（图1a和图1b），引物cgint/cg478r只能特异性地从供试的3个草莓炭疽病菌c•siamense的dna中扩增出大小约为389bp的条带（图1），而其它24种真菌及阴性对照均无扩增条带。说明该对引物可以将草莓炭疽病菌c•siamense与草莓植株及生长介质中的其他真菌区分开来，具有特异性，可用于草莓炭疽病菌c•siamense快速可靠的检测和鉴定。

实施例2：引物对草莓炭疽病菌c•siamense基因组dna的灵敏度检测

1.单重pcr扩增

用无菌超纯水对草莓炭疽病菌c•siamense基因组dna进行稀释，配制成10倍数量级的系列浓度（10ng/μl、1ng/μl、100pg/μl、10pg/μl、1pg/μl、100fg/μl、10fg/μlg）备用。使用本发明所述引物cgint/cg478r对不同系列浓度的基因组dna进行pcr扩增，评估该引物对草莓炭疽病菌基因组dna检测的灵敏性，反应体系和扩增程序如下：pcr反应体系10μl，包括5μlestaqmastermix（康为世纪，中国），0.5μldna模板，正反向引物各0.25μm（10μm），10%甘油，剩余部分用无菌双蒸水补足。扩增程序为：96^oc变性5min；96^oc变性30s，50^oc退火45s，72^oc延伸1min，30个循环；最后72^oc延伸7min。

2.巢式pcr扩增

以前述单重pcr扩增产物为模板进行第二轮扩增，引物、反应体系和扩增程序同前述。

单重pcr和巢式pcr灵敏度比较结果表明，当以本发明所述引物cgint/cg478r进行单重pcr扩增时，反应灵敏度可达到500pgdna10μl^-1（图2a）。进一步进行第二轮巢式pcr扩增，从电泳图可以看出巢式pcr的特异性扩增条带比单重pcr要亮得多，能够使原来看不到条带的样品产生可见条带（图2b），灵敏度达到50fgdna10^-1反应体系，比单重pcr要提高10000倍左右。

实施例3：发病植株中草莓炭疽病菌c•siamense的检测

发病叶片中草莓炭疽病菌c•siamensedna的提取，采用新型植物基因组提取试剂盒（天根，中国）提取总dna，方法参考说明书。第一轮取4.9μl提取的dna原液做模板进行单重pcr扩增，第二轮取0.5μl的第一轮pcr产物作为pcr反应模板利用本发明所述引物cgint/cg478r进行pcr扩增。pcr反应体系10μl，包括5μlestaqmastermix（康为世纪，中国），dna模板，0.25μl引物（10μm），剩余部分用无菌双蒸水补足。扩增程序为：96^oc变性5min；96^oc变性30s，50^oc退火45s，72^oc延伸1min，30个循环；最后72^oc延伸7min。结果检测：取pcr扩增产物3μl用1%琼脂糖凝胶电泳分离，用goldview染色对胶进行任瑟，电压为70-100v，电泳结束后于紫外灯下观察，根据扩增产物的有无及其片段大小对结果进行判断，如果能特异性地扩增出389bp的产物，即可判断发病组织中带有草莓炭疽病菌。检测结果表明，草莓炭疽病菌发病症状典型的叶片中可检测出草莓炭疽病菌c•siamense，人工接种5×10⁵个孢子/ml和1×10⁵个孢子/mlc•siamense菌悬液的草莓叶片及部分接种1×10⁴个孢子/ml菌悬液草莓叶片中可检测出c•siamense，接种浓度为1×10³个孢子/ml和1×10²个孢子/ml及未接种的草莓叶片中无特异性条带出现（图4）。人工接种进行致病力鉴定时，我们发现当接种浓度为1×10²个孢子/ml时草莓不发病，当接种浓度为1×10⁴个孢子/ml和1×10³个孢子/m时草莓叶片虽能表现症状，但只在接种部位产生很小的病斑，不会引起整片叶片枯萎。说明该套技术能用于草莓叶片中炭疽病菌的快速分子检测。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。