一种芥子酰糖酯类化合物及其制备方法和应用

本发明涉及抗衰老剂技术领域，具体涉及一种芥子酰糖酯类化合物及其制备方法和应用。

背景技术：

莱菔子(raphanussativusl)为十字花科植物萝卜的干燥成熟种子，主产于我国的河北、河南、浙江、湖北、四川等省。莱菔子归肺、脾、胃经，性平，味辛、甘，具有消食除胀，降气化痰的功效，用于饮食停滞，脘腹胀痛，大便秘结，积滞泻痢，痰壅喘咳。莱菔子含有多种化学成分，包括硫苷、生物碱类、挥发油类、脂肪酸类、黄酮类、芥子酰糖酯类、多糖和蛋白类等，其中，芥子酰糖酯类成分是近期新发现的莱菔子中的特征性成分，可以作为莱菔子重要的化学分类标记。

高血压是心脑血管病最重要的危险因素之一，血管内皮细胞衰老是高血压的重要病理基础，莱菔子中的芥子碱是降压的活性成分成为研究的热点，莱菔子中的芥子碱等水溶性生物碱发挥降压的机制是通过发挥血管内皮细胞的保护作用体现的。芥子酰糖酯类化合物具有与芥子碱相同的芥子酰基母核，但是关于芥子酰糖脂类成分的活性主要集中于脑保护等活性研究，对于抗内皮细胞衰老而发挥降压作用暂时无报道。

技术实现要素：

鉴于此，本发明的目的在于提供一种芥子酰糖酯类化合物及其制备方法和应用，本发明提供的芥子酰糖酯类化合物具有明显的抗衰老活性。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种芥子酰糖酯类化合物，具有式i所示的结构：

本发明提供了上述技术方案所述芥子酰糖酯类化合物的制备方法，包括以下步骤：

(1)利用第一溶剂对莱菔子粉进行脱脂，得到脱脂莱菔子；所述第一溶剂包括石油醚或正己烷；

(2)利用第一甲醇水溶液对所述脱脂莱菔子进行提取，将所得粗提取物溶解于水中，得到粗提取物水溶液；

(3)利用第二溶剂对所述粗提取物水溶液进行第一萃取，利用第三溶剂对所得粗萃取物进行第二萃取，得到萃取物；

所述第二溶剂包括石油醚或正己烷；

所述第三溶剂包括乙酸乙酯或二氯甲烷；

(4)将所述萃取物进行第一柱色谱分离，得到组分c；

所述第一柱色谱分离采用梯度洗脱，所述梯度洗脱采用的洗脱剂为第二甲醇水溶液；所述第二甲醇水溶液中甲醇的体积分数为10～90％；

(5)将所述组分c进行第二柱色谱分离，得到组分c3；

所述第二柱色谱分离采用梯度洗脱，所述梯度洗脱采用的洗脱剂为第三甲醇水溶液；所述第三甲醇水溶液中甲醇的体积分数依次为40％、50％和60％；

(6)将所述组分c3进行液相色谱纯化，得到芥子酰糖酯类化合物；

所述液相色谱纯化采用的流动相为第四甲醇水溶液，所述第四甲醇水溶液中甲醇的体积分数为55％。

优选的，所述脱脂的温度为60～90℃。

优选的，所述脱脂的次数为3次；莱菔子和单次脱脂用第一溶剂的质量比为1:3。

优选的，所述第一甲醇水溶液中甲醇的体积分数为70％。

优选的，所述提取的次数为3次，所述莱菔子与单次提取用第一甲醇水溶液的质量比为1:10。

优选的，所述提取的温度为室温，所述提取的时间为15天。

优选的，所述粗提取物的质量和水的体积之比为392.8g:1l。

优选的，所述第一萃取的次数为3次，所述粗提取物水溶液和单次第一萃取用第二溶剂的体积比为1:1。

本发明还提供了上述技术方案所述的芥子酰糖酯类化合物或上述技术方案所述制备方法得到的芥子酰糖酯类化合物在抗衰老和制备降压药中的应用。

本发明提供了一种芥子酰糖酯类化合物，具有式i所示的结构。本发明提供的芥子酰糖酯类化合物具有明显的抗衰老活性，如实施例结果所示，血管紧张素(angⅱ)诱导的细胞的细胞存活率为58.51％，加入具有式i所示结构的芥子酰糖酯类化合物后，angⅱ诱导的细胞的细胞存活率为高达80.77％，细胞增殖了38.04％，说明本发明提供的芥子酰糖酯类化合物能够对angⅱ诱导的细胞产生明显的增殖作用；芥子酰糖酯类化合物对β-半乳糖苷酶(β-gal)的衰老阳性率由正常的80.67％可降低到57.89％具有显著性意义，表明本发明提供的芥子酰糖酯类化合物具有抗huvecs衰老活性。

本发明提供的制备方法，以莱菔子作为制备原料，操作简单，制备条件温和，原料来源广，生产成本低。

附图说明

图1为实施例1制备的芥子酰糖酯类化合物的氢谱图；

图2为实施例1制备的芥子酰糖酯类化合物的碳谱图；

图3为实施例1制备的芥子酰糖酯类化合物的质谱图

图4为实施例1制备的芥子酰糖酯类化合物的hmbc谱图；

图5为实施例1制备的芥子酰糖酯类化合物的hsqc谱图；

图6为不同质量浓度的芥子酰糖酯类化合物对细胞存活率的影响图；

图7为β-半乳糖苷酶染色实验结果图，其中，a为control组，b为angⅱ组，c为angⅱ+6.25μg/ml化合物i组，d为angⅱ+12.5μg/ml化合物i组，e为angⅱ+25μg/ml化合物i组，f为各组细胞染色阳性率。

具体实施方式

本发明提供了一种芥子酰糖酯类化合物，具有式i所示的结构：

本发明提供了上述技术方案所述芥子酰糖酯类化合物的制备方法，包括以下步骤：

(1)利用第一溶剂对莱菔子粉进行脱脂，得到脱脂莱菔子；所述第一溶剂包括石油醚或正己烷；

(2)利用第一甲醇水溶液对所述脱脂莱菔子进行提取，将所得粗提取物溶解于水中，得到粗提取物水溶液；

(3)利用第二溶剂对所述粗提取物水溶液进行第一萃取，利用第三溶剂对所得粗萃取物进行第二萃取，得到萃取物；

所述第二溶剂包括石油醚或正己烷；

所述第三溶剂包括乙酸乙酯或二氯甲烷；

(4)将所述萃取物进行第一柱色谱分离，得到组分c；

所述第一柱色谱分离采用梯度洗脱，所述梯度洗脱采用的洗脱剂为第二甲醇水溶液；所述第二甲醇水溶液中甲醇的体积分数为10～90％。

(5)将所述组分c进行第二柱色谱分离，得到组分c3；

所述第二柱色谱分离采用梯度洗脱，所述梯度洗脱采用的洗脱剂为第三甲醇水溶液；所述第三甲醇水溶液中甲醇的体积分数依次为40％、50％和60％；

(6)将所述组分c3进行液相色谱纯化，得到芥子酰糖酯类化合物；

所述液相色谱纯化采用的流动相为第四甲醇水溶液，所述第四甲醇水溶液中甲醇的体积分数为55％。

在本发明中，若无特殊说明，所有的原料组分均为本领域技术人员熟知的市售商品。

本发明利用第一溶剂对莱菔子粉进行脱脂，得到脱脂莱菔子。在本发明中，所述第一溶剂包括石油醚或正己烷。在本发明中，所述莱菔子粉优选由莱菔子粉碎得到；本发明对于所述粉碎的方式没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的粉碎方式即可；所述莱菔子粉的粒径优选为80～120目。在本发明中，所述脱脂的次数优选为3次；所述莱菔子和单次脱脂用第一溶剂的质量比优选为1:3。在本发明中，所述脱脂的温度优选为60～90℃，更优选为70～80℃。所述脱脂后，本发明优选还包括将所述脱脂的体系中的第一溶剂去除，得到脱脂莱菔子。在本发明中，所述去除的方式优选为过滤。所述脱脂后本发明优选还包括将所述脱脂后的产物进行干燥；所述干燥的方式优选为挥发。

得到脱脂莱菔子后，本发明利用第一甲醇水溶液对所述脱脂莱菔子进行提取，将所得粗提取物溶解于水中，得到粗提取物水溶液。在本发明中，所述第一甲醇水溶液中甲醇的体积分数优选为70％。在本发明中，所述提取的次数优选为3次；所述莱菔子与单次提取用第一甲醇水溶液的质量比优选为1:10。在本发明中，所述提取的温度优选为室温，所述提取的时间优选为15天。所述提取后，本发明优选还包括将所述提取得到的提取液合并后浓缩，得到粗提取物。本发明对于所述浓缩的方式没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的浓缩方式将溶剂去除即可。在本发明中，所述粗提取物的质量和水的体积之比优选为392.8g:1l。

得到粗提取物水溶液后，本发明利用第二溶剂对所述粗提取物水溶液进行第一萃取，利用第三溶剂对所得粗萃取物进行第二萃取，得到萃取物。

在本发明中，所述第二溶剂包括石油醚或正己烷。在本发明中，所述第一萃取的次数优选为3次，所述粗提取物水溶液和单次第一萃取用第二溶剂的体积比优选为1:1。在本发明中，所述萃取优选在分液漏斗中进行；本发明对于所述分液漏斗的大小没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的分液漏斗即可，在本发明的实施例中，所述分液漏斗的容积优选为5l。所述第一萃取后，本发明优选还包括合并第一萃取的萃取相后浓缩，得到粗萃取物。本发明对于所述浓缩的方式没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的浓缩方式将第二溶剂去除即可。

在本发明中，所述第三溶剂包括乙酸乙酯或二氯甲烷。在本发明中，所述粗萃取物的质量与所述第三溶剂的体积之比优选为1g：(2.5～3)ml，更优选为1g：(2.6～2.8)l。所述第二萃取后，本发明优选还包括将所述萃取相进行浓缩，得到萃取物。本发明对于所述浓缩的方式没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的浓缩方式将溶剂去除即可。

得到萃取物后，本发明将所述萃取物进行第一柱色谱分离，得到组分c。在本发明中，所述第一柱色谱分离采用梯度洗脱，所述梯度洗脱采用的洗脱剂为第二甲醇水溶液；所述第二甲醇水溶液中甲醇的体积分数为10～90％。在本发明中，所述梯度洗脱采用的洗脱剂依次优选为10％甲醇水溶液、30％甲醇水溶液、50％甲醇水溶液、70％甲醇水溶液和90％甲醇水溶液；所述第一柱色谱分离过程中依次得到组分a、组分b、组分c、组分d和组分e。在本发明中，所述第一柱色谱分离采用的色谱柱优选为聚酰胺柱。

得到组分c后，本发明将所述组分c进行第二柱色谱分离，得到组分c3。在本发明中，所述第二柱色谱分离采用梯度洗脱，所述梯度洗脱采用的洗脱剂为第三甲醇水溶液；所述第三甲醇水溶液中甲醇的体积分数依次为40％、50％和60％；所述第二柱色谱分离依次得到组分c1、组分c2和组分c3。在本发明中，所述第二柱色谱分离采用的色谱柱优选为聚酰胺柱。

得到组分c3后，本发明将所述组分c3进行液相色谱纯化，得到芥子酰糖酯类化合物。在本发明中，所述液相色谱纯化采用的流动相为第四甲醇水溶液，所述第四甲醇水溶液中甲醇的体积分数为55％；所述流动相的流速优选为3ml/min。在本发明中，所述液相色谱纯化的次数优选为3～4次。

本发明还提供了上述技术方案所述的芥子酰糖酯类化合物或上述技术方案所述制备方法得到的芥子酰糖酯类化合物在抗衰老和制备降压药中的应用。

在本发明中，所述抗衰老优选为抗血管内皮细胞衰老。在本发明中，所述应用过程中芥子酰糖酯类化合物的添加浓度优选为1～200μg/ml，进一步优选为5～150μg/ml，更优选为12.5～100μg/ml，最优选为25～50μg/ml。

下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

(1)取1.1kg粉碎后的莱菔子(粒径为80～120目)，加入3.3kg石油醚在70℃条件下进行脱脂，挥发干石油醚，得到脱脂莱菔子；

(2)在所得脱脂莱菔子中加入体积分数为70％的甲醇水溶液进行对提取，提取次数为3次，单次提取加入的甲醇水溶液的质量为11kg，合并3次提取的提取液后浓缩，得到785.6g粗提取物；将所得粗提取物溶解于2l蒸馏水中，得到粗提取物水溶液；

(3)将所述粗提取物水溶液置于5l分液漏斗中，加入正己烷萃取3次，单次萃取加入的正己烷的体积为2l，合并3次萃取的萃取相后浓缩，得到165.11g粗萃取物；在所得粗萃取物中加入2l乙酸乙酯进行萃取，浓缩萃取相，得到25.79g萃取物；

(4)将23g所述萃取物进行第一柱色谱分离，得到组分a、组分b、组分c、组分d和组分e；

其中，第一柱色谱分离采用梯度洗脱，采用洗脱剂为第二甲醇水溶液；所述第二甲醇水溶液中甲醇的体积分数为10～90％；梯度洗脱采用的洗脱剂依次为10％甲醇水溶液、30％甲醇水溶液、50％甲醇水溶液、70％甲醇水溶液和90％甲醇水溶液；

(5)将所述组分c进行第二柱色谱分离，得到组分c1、组分c2和组分c3；

其中，第二柱色谱分离采用梯度洗脱，采用的洗脱剂为第三甲醇水溶液；所述第三甲醇水溶液中甲醇的体积分数依次为40％、50％和60％；

(6)将所述组分c3进行液相色谱纯化4次，得到芥子酰糖酯类化合物(黄色无定形粉末，2.5mg，简写为化合物i)；

所述液相色谱纯化采用的流动相为体积分数为55％的甲醇水溶液，流速为3ml/min。

本实施例制备的芥子酰糖酯类化合物的氢谱图如图1所示，碳谱图如图2所示，质谱图如图3所示，hmbc谱图如图4所示，hsqc谱图如图5所示。本实施例制备的芥子酰糖酯类化合物的结构鉴定结果如下：

¹hnmr(600mhz,dmso)δ7.58(1h,d,j＝15.8hz,h-7'),7.54(1h,d,j＝15.8hz,h-7),7.50(1h,d,j＝15.8hz,h-7”),7.28(1h,d,j＝1.6hz,h-2'),7.15(1h,dd,j＝8.3,1.6hz,h-6'),6.99(2h,s,h-2,6),6.98(2h,s,h-2”,6”),6.79(1h,d,j＝8.3hz,h-6'),6.58(1h,d,j＝15.8hz,h-8),6.49(1h,d,j＝15.8hz,h-8”),6.40(1h,d,j＝15.8hz,h-8'),5.70(1h,d,j＝7.2hz,fru-3),5.57(1h,dd,j＝12.9,5.9hz,fru-4),5.28(1h,t,j＝4.5hz,glc-1),4.47(1h,d,j＝10.9hz,glc-6a),4.21(1h,dt,j＝10.9,6.3hz,glc-6b),4.16–4.08(2h,m,glc-5,fru-5),3.81(3h,s,3'-och3),3.79(6h,s,2,6-och3),3.74(s,6h,2”,6”-och3),3.68–3.64(2h,m,fru-6),3.53(2h,dd,m,fru-1),3.46–3.25(1h,m,glc-3),3.25–3.15(2h,m,glc-2,4)。

¹³cnmr(151mhz,dmso)δ167.34(c-9),166.24(c-9”),165.74(c-9'),150.15(c-4'),148.50(c-3,c-5),148.45(c-3”,c-5”),148.41(c-3'),146.82(c-7”),146.55(c-7'),145.85(c-7),139.16(c-4),138.91(c-4”),125.73(c-6'),124.80(c-1),124.49(c-1”),123.64(c-1'),116.03(c-8),115.44(c-5'),115.19(c-8),114.31(c-8”),114.06(c-8'),111.95(c-2'),106.76(c-2,c-6),106.69(c-2”,6”),104.59(fru-2),92.15(glc-1),81.42(fru-5),75.78(fru-4),75.62(fru-3),73.39(glc-3),71.77(glc-2),71.24(glc-5),70.44(glc-4),64.38(glc-6),63.15(fru-1),62.71(fru-6),56.49(c-2,6,2”,6”),56.11(c-5”)。

ei-ms测得分子离子峰为[m-h]^-929.2728，结合碳谱氢谱数据推测分子式为c44h50o22。谱图信号在低场区有三组相关氢信号，δh7.58(1h,d,j＝15.8hz)和6.40(1h,d,j＝15.8hz)、7.54(1h,d,j＝15.8hz)和6.58(1h,d,j＝15.8hz)、7.50(1h,d,j＝15.8hz)和6.49(1h,d,j＝15.8hz)，根据耦合常数的大小，判断为反式烯氢，此外，其化学位移值较普通的烯氢高，提示该烯氢连有吸电子集团，为典型的α、β不饱和羰基结构。同时，δh6.99(2h,s)和6.98(2h,s)两组含有两个氢的单峰，提示分子中含有对称结构，结合甲氧基信号δh3.79(6h,s)，3.74(s,6h)，推测出分子中含有两个相同的连甲氧基的1,3,4,5-四取代苯环片段。δh7.28(1h,d,j＝1.6hz)，7.15(1h,dd,j＝8.3,1.6hz)，6.79(1h,d,j＝8.3hz)以及甲氧基信号3.81(3h,s)，推测出分子中含有一个连有甲氧基的1,3,4-三取代苯环片段。¹³cnmr(151mhz,dmso)谱中显示了18个芳香碳信号，δc150.15,148.50×2,148.45×2,148.41,139.16,138.91,125.73,124.80,124.49,123.64,115.44,111.95,106.76×2,106.69×2；三组α、β不饱和羰基结构δc167.34,166.24,165.74,146.82,146.55,145.85,116.03,114.31,114.06；以及苯环上的甲氧基信号56.49×6、56.11。通过hmbc谱发现δh6.99、6.98分别与δc116.03、114.31相关；δh7.54、7.50分别与δc124.80、124.49相关，提示两组α、β不饱和羰基结构与1,3,4,5-四取代苯环片段相连。δh7.28、7.15与δc146.55相关，δh7.58与δc123.64相关，提示第三组α、β不饱和羰基结构与1,3,4-三取代苯环片段相连。综上，根据莱菔子中的化学成分特点以及氢谱碳谱信息，推断该化合物包含两个芥子酰基和一个阿魏酰基片段，芥子酰基和阿魏酰基片段的数据与文献(段礼新.中药复方三子养亲汤及其味药莱菔子物质基础的研究[d].沈阳药科大学,2007)报道一致。

此外，在δh5.70-3.15区间有14个连氧碳氢信号，同时碳谱在δc104.59-62.71区间有12个连氧碳信号，推测该化合物有两个糖结构。hsqc谱中，δh5.28(1h,t,j＝4.5hz)与δc92.15直接相关，根据耦合常数及化学位移推测δh5.28为端基氢信号，根据h-hcosy判断氢氢之间的连接方式结合碳谱，推断出其中一个糖为葡萄糖；hmbc谱中，δh5.28与104.59相关，结合δc81.42,75.78,75.6263.15,62.71，推断出该糖为果糖。葡萄糖的苷键构型，通过端基氢的耦合常数5.28(1h,t,j＝4.5hz)来确定为α构型。

综上，该结构包含两个芥子酰基，一个阿魏酰基、一个葡萄糖和一个果糖组成。hmbc谱中，δh4.47和4.21与δc167.34相关，δh5.70与δc165.74相关，δh5.57与δc166.24相关，从而判断出芥子酰基分别连到葡萄糖的6位，果糖的4位，阿魏酰基连到果糖的3位，表明，成功制备得到具有式i所示结构的芥子酰糖酯类化合物。

其中，glc-1代表葡萄糖上的1位，glc-6代表葡萄糖上的6位，fru-1代表果糖上的1位，fru-4代表果糖上的4位。

测试例1

(1)化合物的抗huvecs衰老活性浓度筛选

将huvecs细胞(8000个/孔)接种于96孔板中，每孔加入100μl的细胞悬浮液，置于37℃，在5v/v％co2、饱和湿度的培养箱内培养12h。芥子酰糖酯类化合物配制为终浓度为200μg/ml的供试液，加入①～⑩组的物质处理细胞，培养1h后加入angⅱ，24h后，每孔加入10μlcck-8，继续培养1h，用酶标仪在450nm波长处测定吸光值，以药物(加化合物i)组与对照组od值百分比代表细胞增殖，结果如图6和表1所示。

其中，分组：①control(不加特殊处理因素)；②model(angii)；③angii+200μg/ml化合物i；④angii+100μg/ml化合物i；⑤angii+50μg/ml化合物i；⑥angii+25μg/ml化合物i；⑦angii+12.5μg/ml化合物i；⑧angii+6.25μg/ml化合物i；⑨angii+3.125μg/ml化合物i；⑩angii+1.5625μg/ml化合物i；各组中angii的浓度均为1×10^-5mol/ml。

所有实验数据均采用统计软件graphpadprism进行统计分析，并以均数±标准差(x±s)表示，组间差异采用单因素方差分析或t检验进行分析，以p<0.05认为差异有统计学意义。

表1实施例1制备的芥子酰糖酯类化合物对angⅱ诱导的细胞产生增殖结果

angⅱ组与control组比较，^##p＜0.01；angⅱ组与各浓度组比较，^**p＜0.01。

由图6和表1可知，angⅱ诱导的细胞的细胞存活率为58.51％，加入实施例1制备的芥子酰糖酯类化合物后，细胞存活率为高达80.77％，细胞增殖了38.04％，说明本发明提供的芥子酰糖酯类化合物能够对angⅱ诱导的细胞产生明显的增殖作用。

(2)β-半乳糖苷酶(β-gal)染色实验检测huvecs衰老

收集步骤(1)中control(不加特殊处理因素)、model(angii)、angii+6.25μg/ml化合物i、angii+12.5μg/ml化合物i、angii+25μg/ml化合物i和angii+50μg/ml化合物i组对数生长期的huvecs细胞，接种于6孔板上，每孔1.5ml，细胞贴壁并融合约70～80％后，吸弃原培养基，分别加化合物及angⅱ干预24h；

取聚丙烯容器，配制β-半乳糖苷酶染色工作液：β-半乳糖苷酶染色液a10μl，β-半乳糖苷酶染色液b10μl，β-半乳糖苷酶染色液c930μl，x-gal溶液50μl；

吸弃6孔板中的原培养基，每孔加入1mlpbs清洗培养板中各孔2次，每孔加入1mlβ-半乳糖苷酶染色固定液，室温固定15min；

去除染色固定液，每孔加入1mlβ-半乳糖苷酶染色工作液，用保鲜膜将6孔板封好，不含co2的37℃干燥培养箱中避光过夜37℃孵育；

将孔中染色溶液弃去，每孔加入1mlpbs，200倍视野倒置相差显微镜下观察细胞的着色情况，每孔随机选取3个视野，利用imagej软件统计视野内阳性染色的细胞数占细胞总数的比例，测试结果如表2和图7所示，图2中，a为control组，b为angⅱ组，c为angⅱ+6.25μg/ml化合物i组，d为angⅱ+12.5μg/ml化合物i组，e为angⅱ+25μg/ml化合物i组，f为各组细胞染色阳性率。

其中，所有实验数据均采用统计软件graphpadprism进行统计分析，并以均数±标准差(x±s)表示，组间差异采用单因素方差分析或t检验进行分析，以p<0.05认为差异有统计学意义。

由图7和表2可知，芥子酰糖酯类化合物对β-半乳糖苷酶(β-gal)的衰老阳性率由正常的80.67％可降低到50.56％，具有显著性意义，表明本发明提供的芥子酰糖酯类化合物具有抗huvecs衰老活性。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。