一种人γ-干扰素病毒载体及其应用的制作方法

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种人γ-干扰素病毒载体及其应用。

背景技术：

干扰素(interferons，ifns)是多功能细胞因子家族成员之一，是一类高活性、多功能的分泌型糖蛋白，具有抗增殖、抗病毒、免疫调节和抗肿瘤等作用。根据其基因序列、染色体定位和受体特异性等特点可分为i型、ii型和iii型ifns。其中，ii型干扰素只有1种，即ifnγ。ifnγ的细胞表面受体为ifngr(interferongammareceptor)，由ifngr1和ifngr2两个亚基组成。ifnγ主要由浆细胞样树突细胞(plasmacytoiddendriticcells，pdc)生成。在抗肿瘤方面发挥重要作用的为i型和ii型ifns，而ii型ifns相比于i型ifns毒副作用较小，在抗病毒和抗肿瘤方面具有更广泛的应用前景。

ifnγ主要通过与细胞表面受体的结合，诱导病毒感染细胞产生多种抗病毒蛋白，使细胞内产生抗病毒状态而发挥抗病毒作用，其抗病毒作用是非特异性的。ifnγ主要的效应分子有双链rna依赖的蛋白激酶r(double-strandedrnadependentproteinkinase，pkr)、mx、2’-5’寡腺苷酸合成酶(2’-5’oas)/核糖核酸酶l(rnasel)系统等。pkr是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，在与dsrna结合后被激活，活化的pkr可使蛋白合成起始因子eif-2及核因子抑制因子ikb磷酸化，从而抑制病毒和细胞蛋白的合成，起到抗病毒的作用；mx能够通过干扰某些负链病毒核酸片段向细胞内转运及某些病毒蛋白的功能而抑制病毒的增殖；2’-5’寡腺苷酸合成酶能够使atp聚合为2’-5’寡腺苷酸，激活核糖核酸酶l降解ssrna，从而干扰病毒复制。近年来还发现一些其他的干扰素诱导基因(interferon-stimulatedgenes，isgs)，如p56、p54、phospholipidscramblase1、trail/apo2l、isg12、gbp1、isg20、xaf1、nos等，它们通过不同的抗病毒机制而发挥抗病毒作用，如nos使半胱氨酸、酪氨酸亚硝基化，从而干扰病毒蛋白二硫键的形成；isg20能够特异性地降解病毒rna。在诱导效应因子表达的同时，由于ifnγ能够提高细胞表面mhc分子的表达，增强免疫活性细胞对病原体的杀伤作用，从而协同促进了机体对病毒感染细胞的杀灭，而使机体处于抗病毒状态。虽然各种类型的干扰素均能介导细胞对病毒感染的反应，但ifnγ的免疫调节活性在协调免疫反应和确定机体长期的抗病毒状态中发挥更为重要的作用。

另一方面，ifnγ还能够通过多种机制发挥复杂的抗肿瘤作用，比如①通过抑制肿瘤细胞增殖、诱导凋亡，发挥直接的抗肿瘤作用；②通过抑制肿瘤血管生成，发挥间接的抗肿瘤作用；③通过激活机体免疫系统杀伤肿瘤细胞，发挥间接的抗肿瘤作用。

专利cn1552850a公开了一种重组人γ-干扰素腺病毒，通过基因重组技术使人γ-干扰素基因与腺病毒载体发生重组，利用复制缺陷型腺病毒载体将γ-干扰素引入机体组织细胞使人γ-干扰素蛋白在体内稳定表达，但所述重组人γ-干扰素腺病毒抗病毒作用较弱。

专利cn108064176a公开了一种用于治疗肿瘤疾病的含有rna的组合物，所述的含有rna的组合物包括γ-干扰素。

因此，亟需开发一种抗病毒与肿瘤治疗效果更好的人γ-干扰素病毒载体。

技术实现要素：

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种人γ-干扰素病毒载体及其应用。本发明通过对人γ-干扰素序列进行优化，制备人γ-干扰素病毒载体，提升了其抗病毒与抗肿瘤的功能，从而更好的预防和/或治疗相关疾病。

为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：

一方面，本发明提供了一种人γ-干扰素病毒载体，所述的人γ-干扰素病毒载体包括病毒载体和融合基因。

具体地，所述的融合基因包括信号肽和人γ-干扰素核心结构域，所述的信号肽和人γ-干扰素核心结构域串联。

进一步具体地，所述的信号肽为分泌型蛋白的信号肽。

优选地，所述的信号肽为tpa信号肽、il-2信号肽、ifn-γ信号肽、tgf-β信号肽、gm-csf信号肽、cd5信号肽或migg2a信号肽中的一种或多种，进一步优选为tpa信号肽，所述的tpa信号肽序列为seqidno:1所示的氨基酸序列。

进一步具体地，所述的人γ-干扰素核心结构域为人γ-干扰素功能区域的截短体(第24-157号氨基酸)，所述的人γ-干扰素核心结构域的序列为seqidno:2所示的氨基酸序列。

进一步具体地，所述的融合基因序列经密码子偏好性、5'区域、dna重复序列、mrna二级结构、gc含量、sd序列等参数优化后得到，所述的融合基因的核苷酸序列为seqidno:3所示的序列。

具体地，所述的病毒载体为腺病毒载体、腺相关病毒载体、sv40病毒载体、反转录病毒载体、单纯疱疹病毒载体或痘苗病毒载体。

进一步具体地，所述的腺病毒载体为缺失型腺病毒载体，优选为辅助病毒载体，所述的辅助病毒载体移除了所有的腺病毒基因，仅仅保留了病毒基因的itr和包装信号，显著降低其免疫原性，安全性更高。

本发明所述的病毒载体不仅限于上述所列举的载体，能够用于基因递送的病毒载体均可应用于本发明。

另一方面，本发明提供了一种宿主细胞，所述的宿主细胞包含上述人γ-干扰素病毒载体。

具体地，所述的宿主细胞为细菌、酵母或动物细胞。

又一方面，本发明提供了一种抗病毒或抗肿瘤产品，所述的抗病毒或抗肿瘤产品包含上述人γ-干扰素病毒载体或宿主细胞。

具体地，所述的病毒包括但不限于乙肝病毒、丙肝病毒或水疱性口炎病毒，优选为水疱性口炎病毒。

具体地，所述的肿瘤包括但不限于前列腺癌、胰腺癌、胃癌、食管癌、结直肠癌、鼻咽癌、舌癌、喉癌、甲状腺癌、膀胱癌、睾丸癌、头颈癌、骨肉瘤、皮肤癌、间皮瘤、软组织肉瘤、宫颈癌、肝癌、卵巢癌、肺癌、黑色素瘤或肾细胞癌，优选为肝癌。

具体地，所述的产品为独立试剂、试剂盒、疫苗、药物或药物组合物。

进一步具体地，所述的药物或药物组合物还包含任选的药学上可接受的载体。

进一步具体地，所述的药学上可接受的载体包括但不限于：稀释剂、赋形剂、填充剂、润湿剂、崩解剂、矫味剂和粘合剂。

又一方面，本发明提供了上述人γ-干扰素病毒载体或宿主细胞在制备抗病毒或抗肿瘤产品中的应用。

在某些实施例中，本发明通过将改造后的人γ-干扰素的表达元件导入到病毒载体中，携带人γ-干扰素的病毒载体感染宿主细胞并在细胞内表达人γ-干扰素，从而达到杀伤病毒及抑制肿瘤的作用。

在某些实施例中，本发明中携带改造后人γ-干扰素表达元件的腺病毒载体在以moi100感染细胞72小时后，表达量约为150.51ng/ml，且用细胞病变抑制法检测细胞上清中γ-干扰素的效价，约为8014iu/ml。同等条件下，携带野生型人γ-干扰素的腺病毒载体在细胞中72小时的表达量约为64.43ng/ml，生物学效价约为2013iu/ml。

与现有技术相比，本发明的积极和有益效果在于：

(1)本发明中的人γ-干扰素的表达元件相比于现有技术设计更加精简，仅保留人γ-干扰素的核心序列，因此本发明中的人γ-干扰素表达元件序列长度更短，有利于提高人γ-干扰素载体的转导效率。

(2)本发明提供了一种优化的人γ-干扰素病毒载体。所述的人γ-干扰素病毒载体在宿主细胞内具有更好的表达活性，且表达的人γ-干扰素生物学活性更高，具有更强的抗病毒活性及抗肿瘤活性，可用于病毒性疾病或肿瘤的治疗和/或预防。

附图说明

图1为人γ-干扰素腺病毒抑制肿瘤细胞(hepg2)增殖率检测结果图。

图2为人γ-干扰素腺病毒促进肿瘤细胞(hepg2)凋亡率检测结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，下述实施例不用于限制本发明，仅用于说明本发明。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1人γ-干扰素病毒载体

将信号肽序列与选定的人γ-干扰素截短体序列经过对密码子偏好性、5'区域、dna重复序列、mrna二级结构、gc含量、sd序列等参数优化后得到融合基因的核苷酸序列，并合成基因，优化后的人γ-干扰素融合基因核苷酸序列如seqidno:3所示。

将优化后的人γ-干扰素融合基因与pdc316质粒(microbixbiosystem)构建重组质粒。通过pcr扩增，胶回收，酶切，连接，转化，提取质粒后进行pcr、酶切和测序鉴定，测序正确的质粒为重组人γ-干扰素穿梭载体。

将重组人γ-干扰素穿梭载体质粒与腺病毒包装辅助质粒(pbhg)共转染hek293a细胞，收获病毒，并对病毒进行扩增与纯化。

对比例1

按照实施例1的步骤，将融合基因替换为野生型人γ-干扰素全长基因(seqidno:4)，制备得到重组腺病毒。

实验例1人γ-干扰素表达活性测定

以每孔80000个细胞的密度铺6孔板，置37℃，5％co2培养箱培养20h后，弃培养液。用moi值分别为100的重组腺病毒(实施例1与对比例1)及100moiad/lacz(作为腺病毒空载体对照)转染wish细胞，病毒用无血清的dmem培养液稀释，3个复孔，37℃、5％co2条件下培养2h。弃病毒液，每孔加入含5％新生牛血清的dmem培养液，继续培养。吸取各孔细胞培养上清液于离心管中，4000rpm离心10min。取每孔的其中一份供试品稀释200倍后利用人γ干扰素检测试剂盒进行检测。检测结果见下表1。

表1

由表1可知，本发明优化后的人γ-干扰素腺病毒的干扰素表达量，明显高于对比例1，约为其2-2.36倍。

实验例2人γ-干扰素生物学活性测定

根据《中国药典》2020年版通则3523：干扰素生物学活性测定法检测本发明制备得到的人γ-干扰素病毒的生物学活性。

具体检测步骤如下：

标准品溶液的制备：取人干扰素生物学活性测定的国家标准品，按说明书复溶后，用测定培养液稀释成每1ml含1000iu。在96孔细胞培养板中，做4倍系列稀释，共8个稀释度，每个稀释度做2孔。在无菌条件下操作。

供试品溶液的制备：将供试品按标示量溶解后，用测定培养液稀释成每lml约含1000iu。在96孔细胞培养板中，做4倍系列稀释，共8个稀释度，每个稀释度做2孔。在无菌条件下操作。

使wish细胞在培养基中贴壁生长。按1:2-4传代，每周2-3次，于完全培养液中生长。取培养的细胞弃去培养液，用pbs洗2次后消化和收集细胞，用完全培养液配制成每1ml含2.5-3.5×10⁵个细胞的细胞悬液，接种于96孔细胞培养板中，每孔100μl，于37℃、5％co2条件下培养4-6h；将配制完成的标准品溶液和供试品溶液移入接种wish细胞的培养板中，每孔加入100μl，于37℃、5％co2条件下培养18-24h；弃去细胞培养板中的上清液，将保存的水泡性口炎病毒(vsv，-70℃保存)用攻毒培养液稀释至约100ccid50，每孔100μl，于37℃、5％co2条件下培养24h(镜检标准品溶液的50％病变点在1iu/ml)；然后弃去细胞培养板中的上清液，每孔加入染色液50μl，室温放置30min后，用流水小心冲去染色液，并吸干残留水分，每孔加入脱色液100μl，室温放置3-5min。混匀后，用酶标仪以630nm为参比波长，在波长570nm处测定吸光度，对应干扰素对wish细胞的保护效应曲线，以此测定干扰素生物学活性。检测结果如下表2所示。

表2

由表2可知，本发明中人γ-干扰素腺病毒的干扰素生物学效价，明显高于对比例1。同等条件下，本发明上清中干扰素的生物学效价为对比例的2.84-3.98倍，而表达活性仅为其2-2.36倍。该结果表明，本发明在提高干扰素表达量的同时，也提高了表达产物的抗病毒能力。综上而言，本发明优化后的人γ-干扰素腺病毒能够更好地保护宿主细胞不受病毒侵染。

实验例3抑制肿瘤细胞增殖效果

hepg2细胞系是肝癌的经典细胞系，为了验证本品对于肿瘤的抑制作用，本实验例通过mtt法检测细胞的增殖情况。

以每孔2000个细胞的密度铺96孔板，置37℃，5％co2培养箱培养20h后，弃培养液。用moi值分别为100及50的重组腺病毒(实施例1与对比例1)及100moiad/lacz(作为腺病毒空载体对照)转染hepg2细胞，病毒用无血清的dmem培养液稀释，每株细胞每个moi浓度六复孔，另设六孔加入无血清的dmem培养液(100μl/孔)作为阴性对照，37℃、5％co2条件下培养2h。弃病毒液，每孔加入含5％新生牛血清的dmem培养液，继续培养72h。小心吸去上清，每孔加入含1mg/mlmtt的含5％新生牛血清的dmem培养液100μl，置37℃继续培养4h。吸去孔内培养液，每孔加入150μl二甲基亚砜，室温，置摇床上低速振荡10min。用酶标仪以630nm为参比波长、在570nm处测定各孔吸光度，实验重复三次。检测结果如图1所示。

由图1可知，优化后的人γ-干扰素腺病毒抑制hepg2细胞增殖的效果明显优于野生型人γ-干扰素腺病毒。

实验例4促进肿瘤细胞凋亡效果

为了验证本品对于肿瘤的抑制作用，本实验例通过流式细胞法检测肿瘤细胞的凋亡情况。

以每孔30000个细胞的密度铺6孔板，置37℃，5％co2培养箱培养20h后，弃培养液。用moi值分别为100及50的重组腺病毒(实施例1与对比例1)及100moiad/lacz(作为腺病毒空载体对照)转染hepg2细胞，病毒用无血清的dmem培养液稀释，每株细胞每个moi浓度3个复孔，另设六孔加入无血清的dmem培养液(100μl/孔)作为阴性对照，37℃、5％co2条件下培养2h。弃病毒液，每孔加入含5％新生牛血清的dmem培养液，继续培养72h。收集悬浮及贴壁细胞，冰pbs洗涤2次。将细胞重悬于100μl1×bindingbuffer中，加入10μlfitc-annexin-v和20μl7-aad。避光冰浴15min后，每个样品加入385μl1×bindingbuffer。立即采用coulterepicsaltraflowcytomete进行凋亡细胞检测。检测结果如图2所示。

由图2可知，优化后的人γ-干扰素腺病毒诱导hepg2细胞凋亡的效果明显优于野生型人γ-干扰素腺病毒。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110>广州达博生物制品有限公司

<120>一种人γ-干扰素病毒载体及其应用

<130>20210226

<160>4

<170>siposequencelisting1.0

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<213>人工序列(artificialsequence)

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