转录因子ZHX2在NK细胞调控中的应用

本发明属于功能基因组学和生物医药技术领域，具体涉及转录因子zhx2在nk细胞调控中的应用。

背景技术：

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

自然杀伤(nk)细胞是固有免疫系统的重要组成部分，作为机体抗癌、抗病毒的第一道防线。活化的nk细胞不仅可以通过杀伤功能发挥杀伤肿瘤及病毒感染细胞的功能，还可以通过分泌细胞因子等方式，调节其他免疫细胞的特异性及非特异性免疫。作为连接固有免疫与适应性免疫的桥梁，nk细胞的活化、功能，对于机体的免疫调控至关重要。nk细胞功能的发挥，依赖于表面受体活化及效应因子的表达。目前对于nk细胞受体功能的研究较多，但是至今有关于nk细胞效应分子表达调控的机制，尤其是转录因子参与nk细胞效应功能的机制尚未得到阐明。

zhx2(zincfingersandhomeoboxes2)是一种广泛表达于脊椎动物体内的、具有多个特殊结构域的核内转录因子。已有文献报道zhx2在b细胞早期发育过程中起到关键作用，并且参与巨噬细胞的极化过程。但是发明人发现，zhx2对于nk细胞功能调控的具体功能尚未见报道，属于新的功能未知蛋白。

技术实现要素：

针对现有技术存在的不足，本发明提供转录因子zhx2在nk细胞调控中的应用，本发明以nk细胞的功能实验为基础，阐述转录因子zhx2在nk细胞中的功能。对于zhx2具体功能的研究，不仅能揭示这个基因在nk细胞中发挥的调控功能，而且为进一步了解nk细胞发育和功能调控奠定基础，因此具有良好的实际应用之价值。

具体的，本发明涉及以下技术方案：

本发明的第一个方面，提供转录因子zhx2在nk细胞调控中的应用。

本发明通过研究发现，转录因子zhx2可以通过下调nk细胞表面重要的活化性受体nkg2d的表达，抑制nk细胞的脱颗粒能力及细胞因子的分泌，从而实现对nk细胞杀伤功能的抑制作用。

其中，转录因子zhx2可以为人源或非人源，优选为人源。

本发明的第二个方面，提供促进转录因子zhx2基因及其表达产物和/或活性提高的物质在如下a1)-a7)任意一种或多种中的应用：

a1)抑制nk细胞细胞因子的表达或制备抑制nk细胞细胞因子表达的产品；

a2)抑制nk细胞效应分子的表达或制备抑制nk细胞效应分子表达的产品；

a3)抑制nk细胞表面活化受体nkg2d的表达或制备抑制nk细胞表面活化受体nkg2d表达的产品；

a4)促进nk细胞表面抑制性受体nkg2a的表达或制备促进nk细胞表面抑制性受体nkg2a表达的产品；

a5)抑制nk细胞的脱颗粒能力或制备抑制nk细胞脱颗粒能力的产品；

a6)抑制nk细胞的杀伤能力或制备抑制nk细胞杀伤能力的产品；

a7)构建nk细胞杀伤能力细胞研究模型。

本发明的第三个方面，提供一种组合物，其活性成分包括所述促进转录因子zhx2基因及其表达产物和/或活性提高的物质和其他抑制nk细胞杀伤能力的物质。

本发明的第四个方面，提供抑制转录因子zhx2基因及其表达产物和/或活性降低的物质在如下b1)-b7)任意一种或多种中的应用：

b1)促进nk细胞细胞因子的表达或制备促进nk细胞细胞因子表达的产品；

b2)促进nk细胞效应分子的表达或制备促进nk细胞效应分子表达的产品；

b3)促进nk细胞表面活化受体nkg2d的表达或制备促进nk细胞表面活化受体nkg2d表达的产品；

b4)抑制nk细胞表面抑制性受体nkg2a的表达或制备抑制nk细胞表面抑制性受体nkg2a表达的产品；

b5)促进nk细胞的脱颗粒能力或制备促进nk细胞脱颗粒能力的产品；

b6)促进nk细胞的杀伤能力或制备促进nk细胞杀伤能力的产品；

b7)抗肿瘤和/或抗自身免疫病或制备抗肿瘤和/或抗自身免疫病的产品。

本发明的第五个方面，提供一种组合物，其活性成分包括所述抑制转录因子zhx2基因及其表达产物和/或活性降低的物质和其他促进nk细胞杀伤能力的物质。

以上一个或多个技术方案的有益技术效果：

上述技术方案通过利用分子克隆方法构建zhx2基因真核表达载体，通过电转方式将zhx2过表达质粒转入nk细胞，建立nk-zhx2过表达细胞株。应用mtt法、流式细胞术、real-timepcr技术分别对nk细胞的增殖、杀伤、脱颗粒能力以及活化/抑制性受体、细胞因子和杀伤颗粒的表达水平进行检测。此外，通过zhx2小干扰质粒电转的方式，构建干扰zhx2表达的nk92细胞系，通过干扰zhx2在nk细胞中的表达，反向验证zhx2对nk细胞功能的影响。通过流式细胞术检测nk-zhx2干扰细胞株中，nk细胞杀伤、脱颗粒能力、细胞因子和杀伤颗粒的表达水平。研究zhx2对nk细胞功能的调节作用。

通过试验研究表明，zhx2基因可以通过下调nk细胞表面重要的活化性受体nkg2d的表达，抑制nk细胞的脱颗粒能力及细胞因子的分泌，实现对nk细胞杀伤功能的抑制。因此可以用于对人类自身免疫疾病和肿瘤的基因诊断和基因治疗，还可以针对zhx2基因进行新药设计与开发。因此具有良好的实际应用之价值。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1为本发明实施例中pcdna3.0-zhx2-ha载体构建模式图。

图2为本发明实施例中将载体转入nk细胞系中，zhx2基因的过表达情况。pcdna3.0表述nk细胞转染了空载体pcdna3.0的对照组；pczhx2表示转染表达载体pcdna3.0-zhx2-ha的实验组。

a.westernblot。b.realtime-qpcr。

图3为本发明实施例中用cfse法检测zhx2过表达后，nk细胞的增殖情况。a.cfse流式典型图。b.cfse统计分析图。

图4为本发明实施例中用mtt法检测zhx2过表达后，nk细胞对靶细胞k562的杀伤能力。

a.nk92细胞系对靶细胞k562杀伤。b.nkl细胞系对靶细胞k562杀伤。

图5为本发明实施例中zhx2过表达后，nk细胞的脱颗粒能力。

a.nk92细胞系对靶细胞k562杀伤。b.nkl细胞系对靶细胞k562杀伤。

图6为本发明实施例中流式细胞术检测zhx2过表达后，nk92细胞表面杀伤性受体表达情况。

a.nkg2d统计分析图。b.nkg2a统计分析图。

图7为本发明实施例中real-timepcr检测zhx2过表达后，nk92细胞表面杀伤相关受体nkg2d、aslmrna表达情况，其中，a.nkg2d。b.nkg2a。c.fasl。

图8为本发明实施例中real-timepcr检测zhx2过表达后，nk92细胞抗肿瘤细胞因子tnf-a，ifn-γ，杀伤相关分子perforin、granzymeb的mrna表达情况。

图9为本发明实施例中流式细胞术检测zhx2过表达后，nk92细胞活化后细胞因子tnf-a，ifn-γ，杀伤相关分子perforin、granzymeb的蛋白水平。

a.使用pma及离子霉素活化nk细胞：流式直方图(上)，统计分析图(下)。

b.使用k562细胞系活化nk细胞：流式直方图(上)，统计分析图(下)。

图10为本发明实施例中将小干扰片段转入nk细胞系中，zhx2基因的过表达情况。

sinc表述nk细胞转染了无关sirna对照对照组；sizhx2表示转染zhx2干扰sirna的实验组。

图11为本发明实施例中zhx2小干扰后，nk细胞的脱颗粒能力。

图12为本发明实施例中流式细胞术检测干扰zhx2表达后，nk92细胞活化后细胞因子tnf-a，ifn-γ，杀伤相关分子perforin、granzymeb的蛋白水平；其中，左侧图为使用pma及离子霉素活化nk细胞；右侧图为使用k562细胞系活化nk细胞。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

结合具体实例对本发明作进一步的说明，以下实例仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。如果实施例中未注明的实验具体条件，通常按照常规条件，或按照销售公司所推荐的条件；实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过商业途径购买得到。

如前所述，目前zhx2对于nk细胞功能调控的具体功能尚未见报道，属于新的功能未知蛋白。

有鉴于此，本发明的一个具体实施方式中，提供转录因子zhx2在nk细胞调控中的应用。

本发明通过研究发现，转录因子zhx2可以通过下调nk细胞表面重要的活化性受体nkg2d的表达，抑制nk细胞的脱颗粒能力及细胞因子的分泌，从而实现对nk细胞杀伤功能的抑制作用。

其中，转录因子zhx2可以为人源或非人源，优选为人源。

本发明的又一具体实施方式中，提供促进转录因子zhx2基因及其表达产物和/或活性提高的物质在如下a1)-a7)任意一种或多种中的应用：

a1)抑制nk细胞细胞因子的表达或制备抑制nk细胞细胞因子表达的产品；

a2)抑制nk细胞效应分子的表达或制备抑制nk细胞细胞因子表达的产品；

a3)抑制nk细胞表面活化受体nkg2d的表达或制备抑制nk细胞表面活化受体nkg2d表达的产品；

a4)促进nk细胞表面抑制性受体nkg2a的表达或制备促进nk细胞表面抑制性受体nkg2a表达的产品；

a5)抑制nk细胞的脱颗粒能力或制备抑制nk细胞脱颗粒能力的产品；

a6)抑制nk细胞的杀伤能力或制备抑制nk细胞杀伤能力的产品；

a7)构建nk细胞杀伤能力细胞研究模型。

本发明的又一具体实施方式中，所述a1)中，所述细胞因子包括但不限于ifn-γ和tnf-a；

本发明的又一具体实施方式中，所述a2)中，所述效应分子包括但不限于穿孔素(perforin)和颗粒酶b(granzymeb)；

本发明的又一具体实施方式中，促进zhx2基因及其表达产物和/或活性升高的物质包括但不限于提高zhx2基因表达水平的物质，包括采用基于基因特异性mimics技术上调zhx2基因表达和/或促进其活性的物质；如人工合成zhx2的短发夹rna(shorthairpinrna，shrna)或上调zhx2基因表达的启动子、过表达载体或者慢病毒；同时也包括化合物类促进剂。

本发明的又一具体实施方式中，构建zhx2基因过表达载体所需引物序列如seqidno.1-seqidno.2所示序列。

本发明的又一具体实施方式中，所述产品可以为药物或者实验试剂，所述试验试剂可供基础研究使用。

本发明的又一具体实施方式中，提供一种组合物，其活性成分包括所述促进转录因子zhx2基因及其表达产物和/或活性提高的物质和其他抑制nk细胞杀伤能力的物质。

本发明的又一具体实施方式中，促进zhx2基因及其表达产物和/或活性升高的物质包括但不限于提高zhx2基因表达水平的物质，包括采用基于基因特异性mimics技术上调zhx2基因表达和/或促进其活性的物质；如人工合成zhx2的短发夹rna(shorthairpinrna，shrna)或上调zhx2基因表达的启动子、过表达载体或者慢病毒；同时也包括化合物类促进剂。

本发明的又一具体实施方式中，构建zhx2基因过表达载体所需引物序列如seqidno.1seqidno.2所示序列。

本发明的又一具体实施方式中，提供抑制转录因子zhx2基因及其表达产物和/或活性降低的物质在如下b1)-b7)任意一种或多种中的应用：

b1)促进nk细胞细胞因子的表达或制备促进nk细胞细胞因子表达的产品；

b2)促进nk细胞效应分子的表达或制备促进nk细胞效应分子表达的产品；

b3)促进nk细胞表面活化受体nkg2d的表达或制备促进nk细胞表面活化受体nkg2d表达的产品；

b4)抑制nk细胞表面抑制性受体nkg2a的表达或制备抑制nk细胞表面抑制性受体nkg2a表达的产品；

b5)促进nk细胞的脱颗粒能力或制备促进nk细胞脱颗粒能力的产品；

b6)促进nk细胞的杀伤能力或制备促进nk细胞杀伤能力的产品；

b7)抗肿瘤和/或抗自身免疫病或制备抗肿瘤和/或抗自身免疫病的产品。

本发明的又一具体实施方式中，所述b1)中，所述细胞因子包括但不限于ifn-γ和tnf-a；

本发明的又一具体实施方式中，所述b2)中，所述效应分子包括但不限于穿孔素(perforin)和颗粒酶b(granzymeb)；

本发明的又一具体实施方式中，所述抑制转录因子zhx2基因及其表达产物和/或活性降低的物质包括但不限于针对zhx2基因的rna干扰分子或反义寡核苷酸、小分子抑制剂、sirna，实施慢病毒感染或基因敲除的物质以及针对转录因子zhx2本身或其上下游分子的特异性抗体，如抗转录因子zhx2抗体。

本发明的又一具体实施方式中，所述sirna具有如seqidno.3-seqidno.6所示序列。

本发明的又一具体实施方式中，所述产品可以为药物或者实验试剂，所述试验试剂可供基础研究使用。

本发明的又一具体实施方式中，提供一种组合物，其活性成分包括所述抑制转录因子zhx2基因及其表达产物和/或活性降低的物质和其他促进nk细胞杀伤能力的物质。

本发明的又一具体实施方式中，所述抑制转录因子zhx2基因及其表达产物和/或活性降低的物质包括但不限于针对zhx2基因的rna干扰分子或反义寡核苷酸、小分子抑制剂、sirna，实施慢病毒感染或基因敲除的物质以及针对转录因子zhx2本身或其上下游分子的特异性抗体，如抗转录因子zhx2抗体。

本发明的又一具体实施方式中，所述sirna具有如seqidno.3-seqidno.6所示序列。

以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例

1、zhx2过表达质粒合成及载体构建。

使用tiangen公司的trizol试剂提取nk92细胞的rna，通过thermo公司的逆转录试剂盒逆转录获得cdna。使用thermo公司的高保真taq酶扩增zhx2全长cdna，引物序列：zhx2-f：gaagatctgccaccatggctagcaaacgaaaatcta(seqidno.1)；zhx2-r：cgacgcgtctaagcgtagtctggtacgtcgt(seqidno.2)，引物标签为ha-tag，位于蛋白c端。pcr产物凝胶回收后，通过限制性内切酶bglii和mlui将全长片段切下，凝胶回收后将产物连接到pcdna3.0-ha载体上，经测序验证，即得到zhx2基因过表达载体pcdna3.0-zhx2-ha，序列如图所示(图1)。

2、westernblot鉴定zhx2表达载体在hek293中的表达情况。

将步骤(1)制得zhx2过表达载体pcdna-zhx2通过电转仪转入nk92细胞中，24小时后提取细胞总蛋白及rna，通过sds-page和westernblot，检测ha-zhx2蛋白表达情况(图2)，通过实时定量qpcr，检测zhx2在mrna水平上的表达情况(图2)。

3、zhx2基因小干扰片段的构建：zhx2干扰sirna(zhx2-1674及2360)及无关sirna对照(nc)由上海吉玛公司合成。

序列如下：

zhx2-1674-f：gcagaacuggaucggcuaatt(seqidno.3)

zhx2-1674-r：uuagccgauccaguucugctt(seqidno.4)

zhx2-2360-f：cgaggagycgagcguugtgtt(seqidno.5)

zhx2-2360-r：cacaacgcucgacuccucgtt(seqidno.6)

nc-f：uucuccgaacgugucacgutt(seqidno.7)

nc-r：acgugacacguucggagaatt(seqidno.8)

4、westernblot鉴定zhx2在nk92细胞中的干扰效率。

将步骤(3)制得zhx2小干扰片段通过电转仪转入nk92细胞中，24小时后提取细胞总蛋白，通过sds-page和westernblot，检测zhx2蛋白表达情况(图10)。

经检测上述在nk细胞中电转zhx2小干扰序列后，nk细胞对靶细胞k562细胞的杀伤能力显著上升(图11)。

经检测上述在nk细胞中电转zhx2小干扰序列后，nk细胞表达细胞因子tnf-a和ifn-γ，效应分子granzymeb和perforin的蛋白水平显著上升(图12)。

5、rna提取及real-timepcr检测基因mrna表达水平。

使用tiangen公司的trizol试剂提取各组nk细胞的总rna，使用thermo公司逆转录试剂盒通过逆转录酶合成cdna。获得cdna后进行如下pcr反应。real-timepcr反应体系为20μl，含有sybrgreenmix10μl，cdna1μl，上下游引物各1μl，ddh2o7μl。使用bio-red公司的pcr仪进行检测。得到各基因的相对表达强度。如图6，7所示，nk细胞过表达zhx2后，其活化受体nkg2d和杀伤功能相关受体faslmrna水平表达降低，细胞因子ifn-γ、tnf-a和杀伤相关分子perforin，granzymeb的mrna水平表达降低。

6、cfse法检测细胞增殖。

将各组nk细胞离心收集，于1mlpbs体系中使用10mmcfse于37℃孵箱中避光染色15分钟。染色结束后于冰上终止染色反应5分钟。加入5倍体积pbs，1200转5分钟离心，弃上清。重复清洗三次后计数，将细胞接入12孔细胞培养板中。37℃，5％co2条件下培养三天。通过流式细胞术检测细胞增殖。如图3所示。由图3可以看出，zhx2在nk细胞中过表达后不影响nk细胞的增殖能力。

7、mtt法检测nk细胞杀伤能力。

将靶细胞k562接入96孔培养板中，1×10⁵/孔。收集各组nk细胞，以效靶比(e:t)为5：1的比例加入靶细胞中。设置只加效应细胞和只加靶细胞的对照组。将靶细胞和效应细胞培养4小时后，加入20μlmtt(50ug/ml)/孔，继续培养0.5小时。计算杀伤率。

8、流式细胞术检测nk细胞杀伤能力

将靶细胞k562离心收集，于1mlpbs体系中使用10mmcfse于37℃孵箱中避光染色15分钟。染色结束后于冰上终止染色反应5分钟。加入5倍体积pbs，1200转5分钟离心，弃上清。重复清洗三次后计数，将细胞接入96孔培养板中，1×10⁵/孔。

收集各组nk细胞，分别以效靶比(e:t)为2.5：1；5：1；10：1的比例加入靶细胞中。设置只加效应细胞和只加靶细胞的对照组。将靶细胞和效应细胞培养4小时后，收集细胞于流式管中，每管加入1μlpi染料，室温避光染色15分钟后，通过流式细胞术检测nk细胞对靶细胞k562的杀伤率。

9、流式细胞术检测nk细胞表面受体及胞内分子表达。

表面受体标记：收集各组nk细胞，经pbs缓冲液洗涤两次，使用100μlpbs缓冲液重悬细胞，分别加入1μl流式抗体(nkg2d、nkg2a)，混匀，4℃避光孵育30分钟，经pbs缓冲液洗涤两次后，通过流式细胞术检测各个分子的表达情况。如图6、7所示。由图6、7可以看出，zhx2在nk细胞中过表达后，nk细胞表面活化性受体nkg2d表达下降。由图6可以看出，nk细胞表面抑制性受体nkg2a在过表达zhx2后表达显著上升。因此，zhx2很有可能是通过影响nk细胞的活化，从而影响nk细胞对靶细胞的杀伤能力。

胞内分子标记：各组nk细胞按照相同浓度接入12孔板，2×10⁶/孔，加入丙二醇甲醚醋酸酯(pma)50ng/ml和离子霉素10ng/ml进行活化，培养1小时后加入bfa在培养4小时。收集细胞，pbs缓冲液洗涤两次，去除pbs缓冲液，用200μl多聚甲醛固定液固定细胞，4℃孵育30分钟。使用穿膜液洗涤细胞后，使用100μl穿膜液重悬细胞，加入1μl流式抗体(ifn、tnf-a、perforin、granzymeb)4℃孵育1小时，使用pbs缓冲液洗涤细胞两次后，通过流式细胞术检测nk细胞胞内分子的表达情况。如图8，9所示。由图8，9可以看出，zhx2在nk细胞中过表达后，nk细胞分泌细胞因子ifn-γ、tnf-a，杀伤性分子perforin、granzymeb的能力明显降低。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

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<110>山东大学

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