用于针对布鲁氏菌病的改进疫苗的改性细菌

本申请是申请日为2015年7月7日、申请号为“201580037525.5”、发明名称为“用于针对布鲁氏菌病的改进疫苗的改性细菌”的发明专利申请的分案申请。本发明涉及用作针对布鲁氏菌病的疫苗的布鲁氏菌(brucela)属的改性细菌。
背景技术：
：布鲁氏菌病是由布鲁氏菌引起的细菌性人畜共患病，布鲁氏菌是在反刍动物、猪(suid)、犬科动物、骆驼科动物和数种野生动物中表现为兼性细胞内寄生菌的革兰氏阴性菌属。这些细菌极度具有传染性，且人容易从动物及其产品中感染布鲁氏菌病。存在几种高度同源的布鲁氏菌种(moreno等,vet.microbiol.90,209-227,2002；chainetal.,infect.immun.73,8353-8361,2005)，其中牛布鲁氏菌(b.abortus)优选感染牛，羊布鲁氏菌(b.melitensis)优选感染绵羊和山羊，猪布鲁氏菌(b.suis)优选感染猪和野生动物。这三个种是人布鲁氏菌病的主要原因。绵羊也可以被绵羊附睾布鲁氏菌(b.ovis)感染。布鲁氏菌病是动物中流产和不育的主要原因，因此造成重大经济损失。在牛中，通常估计产量(肉、牛奶、扑杀成本)降低50％。全世界易感布鲁氏菌病的家畜数量估计为约4.000.000.000，其中该数量的少于20％在没有疾病的国家(匿名来源，2006)。全世界范围内，在欧盟边境南部和东部的国家(seimenis等,ann.ist.super.sanita.42,437-445,2006)和在低收入国家，布鲁氏菌的发病率非常高。在usa、欧盟地区北部和法国，在大量投资和多年的疫苗接种和扑杀后，已经成功消除牛病(bovinedisease)。已经证明羊布鲁氏菌感染更加棘手，主要是由于在半干旱地区的粗放型养殖条件下，动物管理困难。人布鲁氏菌病总是动物布鲁氏菌病的后果，且最常由羊布鲁氏菌引起。如果不治疗，人布鲁氏菌病导致严重的无效后果，且在约3％的病例中是致命的。由于在疾病流行的大多数国家的医疗服务不足，关于人类该疾病的全球发病率尚无可靠的数据。发病率数据变化非常大(从<0.01至>200每100,000)，反应了在虽然严重但缺乏特征性症状因而报道较少的疾病的认识上的困难(corbel,emerg.infect.dis.3,213-221,1997)。通常估计数据为500.000新病例/年(pappasetal.,lancetinfect.dis.6,91-99,2006)，来自其中实施诊断的近东和亚洲新兴经济体的最新数据证实该疾病在人类中的发病率非常高(例如，伊朗为15.000新病例/年，或中国北部的发病率为几乎1400病例/100000人)(匿名,iranianjournalofmicrobiology,5:183.1,2013)。因为所有这些情况，世界卫生组织已经将布鲁氏菌病分类为七大“被忽视的细菌性人畜共患病”，所述疾病是同时威胁人类健康并造成贫困持续的一类疾病。疫苗接种对控制并消除反刍动物的布鲁氏菌病至关重要(nicoletti,crcpress,bocaraton.,283-299,1990；garin-bastujietal.,vet.res.29,255-274,1998)。因为没有人疫苗，这也是减少人感染的最佳方法。疫苗牛布鲁氏菌s19和羊布鲁氏菌rev1对牛中的牛牛布鲁氏菌和山羊和绵羊中的羊布鲁氏菌有效。然而，这些传统的疫苗不提供100％的保护，对人是剧毒的，且在rev1的情况下，对链霉素(治疗布鲁氏菌病选择的抗生素之一)耐药(garin-bastuji等,vet.res.29,255-274,1998；arizaetal.,plos.med.4,e317,2007)。此外，它们在怀孕动物中是堕胎药。这个最后的缺点对疫苗rev1而言是非常明显的，且严重妨碍对世界上大多数地区的小型反刍动物的布鲁氏菌病控制而言所必需的大规模疫苗接种策略的应用((blasco和molina-flores,vet.clin.northam.foodanimpract.27:95–104,2011)。因此，需要开发更安全的且更有效的针对布鲁氏菌病的疫苗。在感染发作时，布鲁氏菌具有避免天然免疫检测的能力，从而延缓适应性细胞反应并使致病菌能够到达受保护的细胞内环境。该能力与天然免疫病原体识别受体(prr)不能鉴别布鲁氏菌表面分子有关，所述表面分子通常携带同源的病原体相关分子模式(pamp)(barquero-calvoe等,plosone2:e631,2007)，尤其是这些菌株的脂多糖(lps)。因此，这些布鲁氏菌分子是开发更有效疫苗的靶标。lps，革兰氏阴性菌表面最明显的携带pamp的分子之一，是由三个连续片段组成的糖脂：脂质a、核心寡糖和多糖o侧链(o-ps)。对比研究已经建立了布鲁氏菌脂质a在毒力中的明确作用(lapaque等,2005)。类似地，布鲁氏菌lpso-ps在毒力中至关重要，但它的移除产生过度衰减和不良疫苗(布鲁氏菌的r形式)(gonzález等,2008；barrio等,2009)。wo2011/033129公开了基于改性布鲁氏菌的针对布鲁氏菌病的新疫苗，所述改性布鲁氏菌携带编码参与合成lps核心的糖基转移酶的失活基因(wadc)。破坏wadc移除部分核心但不影响o-ps。已经发表了对牛布鲁氏菌的wadc突变体(babδwadc)的生物学性质分析(该菌株之前被conde-alvarez等,plospathog.,8(5),e1002675,2012描述为baδwadc)。babδwadc不能在骨髓源性巨噬细胞(bmdm)中繁殖，并在这些细胞中引发强烈的il-12反应，这引起保护性的th1反应。babδwadc提供的针对牛布鲁氏菌的保护与用s19疫苗获得的类似(conde-álvarez等,plospathog.,8(5),e1002675,2012)。因此，针对布鲁氏菌的babδwadc疫苗与s19同样有效，但携带比s19所描述的更少的突变。因此，babδwadc突变体代表在针对布鲁氏菌病的疫苗领域的极大进步，但仍然需要开发针对该疾病的具有更高功效的新的更安全的疫苗。发明简述发明人已经阐述了包含于糖酵解/糖异生和krebs循环通路的布鲁氏菌的一组代谢突变体，并用这些突变体之一作为针对布鲁氏菌病的疫苗。本发明的布鲁氏菌属的突变细菌携带编码参与合成lps核心的糖基转移酶的失活基因(babδwadc)和编码参与若干代谢通路(例如kreb循环和糖异生)的酶(丙酮酸磷酸二激酶(ppdk:orfbab1_0525；或同源物))的失活基因。因此，本发明涉及突变体babδwadcδppdk。发明人发现，这种babδwadcδppdk突变体显示正常的胞内运输，但它一旦到达复制环境，则显示细胞内增殖缺陷。基因ppdk和wadc的突变组合在布鲁氏菌病小鼠模型中产生针对布鲁氏菌病的高度有效的疫苗。因此，本发明涉及属于布鲁氏菌属的改性细菌，其携带包含以下的双突变：–失活的wadc基因，和–失活的ppdk基因。本发明还涉及针对人和/或动物的布鲁氏菌病的疫苗，其包含携带失活的wadc基因和失活的ppdk基因的所述属于布鲁氏菌属的改性细菌。发明详述本发明的一个方面涉及携带失活的wadc基因和失活的ppdk基因的布鲁氏菌属细菌。根据本发明，“失活的基因”是指编码非功能性蛋白或根本不编码蛋白的基因。根据本发明，可以通过本领域技术人员已知的各种方法使基因失活。使基因失活的方法的实例有敲除、尤其是通过定向诱变或同源重组，如conde-álvarezr.等,cellmicrobiol2006aug；8(8):1322-35所述。根据本发明的使基因失活的一个具体方法描述于实施例章节。“wadc”是指布鲁氏菌属的细菌(包括牛布鲁氏菌)的wadc基因。牛布鲁氏菌的wadc基因在wo2011/033129中描述为“bablpcc”，且其序列对应于该pct申请中的“seqidno：1”。wadc是布鲁氏菌中编码参与合成lps核心的糖基转移酶的基因。本发明的细菌携带失活的wadc基因。因此，与wo2011/033129示出的突变体babδwadc类似，本发明的细菌显示的lps缺少其核心的一部分，但保持完整的o链。该性质允许本发明的突变细菌引发比通常可获得/使用的针对布鲁氏菌的疫苗(s19、rev1)更强烈的保护性免疫反应。wadc的失活描述于wo2011/033129，在本申请中类似地进行。布鲁氏菌种中存在的wadc基因的实例包括以下显示的那些。布鲁氏菌种wadc基因id牛布鲁氏菌基因id:3788779羊布鲁氏菌基因id:1196220猪布鲁氏菌基因id:1167186绵羊附睾布鲁氏菌基因id:5203447鳍型布鲁氏菌(brucellapinnipedialis)基因id:10998034鲸型布鲁氏菌(brucellaceti)基因id:17713240田鼠布鲁氏菌(brucellamicroti)基因id:8321077犬布鲁氏菌(brucellacanis)基因id:5785277“ppdk”是指布鲁氏菌属的细菌(包括牛布鲁氏菌)的ppdk基因。ppdk是布鲁氏菌中编码参与代谢通路(例如kreb循环和糖异生)的酶(磷酸丙酮酸二激酶或丙酮酸磷酸二激酶(牛布鲁氏菌的ppdk:orfbab1_0525))的基因。ppdk是牛布鲁氏菌在培养的巨噬细胞中有效胞内增殖必需的(zú等,jbact,doi:10.1128/jb.01663-14)。布鲁氏菌种中存在的ppkk基因的实例包括以下显示的那些。根据本发明的细菌的wadc和ppdk是失活的。babδwadcδppdk突变体显示正常的胞内运输，仅在到达复制环境时显示细胞内增殖缺陷。发明人发现，基因ppdk和wadc的突变组合在balb/c小鼠中产生高度有效的疫苗。用babδwadcδppdk双突变体接种的小鼠针对病毒2308挑战的保护与用s19或babδwadc接种的那些相同，但与此相反，在挑战后两周在它们的脾中几乎不存在残余的疫苗(参见下表)。现有疫苗不能安全地对成年动物施用，因此它们在宿主中的延长持久期意味着疫苗诱导的流产和排乳的高风险。因此，babδwadcδppdk突变体显示的短期的持久性增加了布鲁氏菌病疫苗使用的安全性和动物年龄范围。此外，预期短的持久性降低新疫苗在血清学诊断试验中的干扰(这是传统疫苗例如s19和rev1的缺点)，因而将对解决diva问题作出贡献(参见以下)。下表示出balb/c小鼠中用babδwadc、babδwadcδppdk或牛布鲁氏菌s19接种获得的针对牛布鲁氏菌感染的保护。与用单个突变体babδwadc或babδppdk接种的小鼠获得的免疫反应相比，用根据本发明的改性细菌接种的小鼠显示更高的免疫反应。当向人或动物施用时，根据本发明的突变体引发若干炎性白细胞介素，尤其是il6、il12和tnfα的强烈释放。在根据本发明的细菌中ppdk和wadc基因突变的特定组合产生强烈的免疫反应，从而增强含有这种突变体的疫苗的功效。因此，发明人表明，出乎意料地，突变ppdk和wadc之间存在协同作用。在一个具体的实施方案中，本发明还涉及进一步包含能够容易区分本发明的突变体与野生型细菌的突变体的根据本发明的细菌。现有布鲁氏菌疫苗的一个主要缺点是通常称为“diva”的问题(感染动物和疫苗接种动物的区分)。最有效的布鲁氏菌病诊断测试是检测针对外膜lps的o-ps片段的抗体的那些。然而，与通过野生型菌株感染一样，用rev1或s19接种疫苗引发针对o-ps的抗体，其阻碍对感染动物和疫苗接种动物的区分。在生命的最初几个月对反刍动物进行结膜接种部分地解决该问题。然而，这与大规模疫苗接种计划不相符合。尽管已经提议使用不含o-ps的突变体(r突变体)作为解决方案，已经证明删除o-ps的疫苗与传统疫苗相比效率低得多(gonzález等,plosone3,e2760,2008；barrio等,vaccine,27(11):1741-9,2009)。布鲁氏菌s-lpso-多糖是n-甲酰-骨胺(perosamine)的均聚物，其仅以α(1-2)连接或以>4:1的比例的α(1-2)和α(1-3)连接的组合存在(perry和bundle,adamslg,ed.advancesinbrucellosisresearch.collegestation:texasa&muniversitypress,76-88,1990)。该o-多糖携带三个基本类型的重叠表位：c(所有化学类型的布鲁氏菌o-多糖共有)；m(存在于具有α(1-3)连接的那些o-多糖)和a(存在于不含α(1-3)连接或α(1-2)与α(1-3)连接的比例大于4:1的那些o-多糖)。在所有这些表位中，甲酰基起重要作用(bundle等,infectimmun.,57(9):2829-361989)。因此，本发明的进一步方面是提供引发免疫反应的根据本发明的布鲁氏菌突变体，其中针对改性细菌的lps的o-ps引发的抗体与针对野生型细菌的lps的o-ps引发的那些不同。因此，根据本发明的疫苗引发的抗体容易检测并与野生型细菌引发的抗体不同，从而允许区分疫苗接种动物和感染动物。为此目的，发明人在根据本发明的改性细菌的lps的o-ps上添加了抗原标签。这种添加通过在根据本发明的改性细菌中表达靶向o-ps的异源酶来实现。因此，在一个具体的实施方案中，根据本发明的细菌进一步表达用于酰化的异源酶，通常该异源酶将lps的o-ps酰化。更具体地，所述异源酶将o-ps的骨胺酰化。所述异源酶能够将不是甲酸基的酰基(通常是乙酰基)转移至o-ps；这种基团可以包括3-deoxi-l-glycerotetronyl、33-羟基丙酰基、s(+)2-羟基丙酰基和r(-)2-羟基丙酰基。因此，在一个具体的实施方案中，根据本发明的细菌可以表达作为n-乙酰转移酶的异源酶，通常，所述异源酶是n-乙酰转移酶(酶委员会编号2.3)。优选地，所述n-乙酰转移酶由大肠杆菌(e.coli)o:157:h7的wbdr基因(基因id:962088)表达。因此，在进一步的实施方案中，本发明的改性细菌是babδwadcδppdk::wbdr突变体。将异源基因引入细菌的方法是本领域技术人员熟知的。大肠杆菌o:157:h7o-ps仅在重复四糖中包含一个n-乙酰-骨胺单元，且仅与布鲁氏菌有较弱的交叉反应。在天然宿主中，仅在用杀死的细菌和freund佐剂接种的动物中明确观察到用大肠杆菌o:157:h7的wbdr基因进行标记，感染仅引发瞬时的igm抗体。根据本发明的修饰的布鲁氏菌-wbdr构建体显示在原始菌株中不存在的新表位，且在感染实验室动物时产生针对该新表位的抗体。然后，例如可以在elisa试验中检测这些根据本发明的布鲁氏菌-wbdr特异性抗体，所述elisa试验将是区分感染动物和疫苗接种动物的试验的可能形式之一。本发明还涉及根据本发明的细菌突变体的治疗应用。具体地，本发明涉及根据本发明的改性布鲁氏菌用作人体或动物体的疫苗。实际上，发明人已经表明，根据本发明的改性细菌可以用作活疫苗。因此，本发明涉及根据本发明的布鲁氏菌属的改性细菌用于针对由所述改性布鲁氏菌的野生型引起的疾病给人体或动物体接种疫苗的方法。在本发明的进一步方面，该疾病是布鲁氏菌病。本发明还涉及用于针对由布鲁氏菌属的细菌引起的疾病给受试者接种疫苗的方法，所述方法包括向需要的受试者施用治疗有效量的根据本发明的所述改性布鲁氏菌的步骤。在本发明的进一步方面，布鲁氏菌属的细菌选自牛布鲁氏菌、羊布鲁氏菌、猪布鲁氏菌、绵羊附睾布鲁氏菌、鳍型布鲁氏菌、鲸型布鲁氏菌、田鼠布鲁氏菌和犬布鲁氏菌。优选地，所述细菌选自牛布鲁氏菌、羊布鲁氏菌，更优选所述细菌是牛布鲁氏菌种。当根据本发明的细菌是牛布鲁氏菌种，它可以用作针对布鲁氏菌病的通用疫苗。“针对布鲁氏菌病的通用疫苗”是指针对布鲁氏菌属的所有细菌种均有效的疫苗。“有效”是指能够显著降低由布鲁氏菌属的细菌引起的随后感染。发明人发现，出乎意料地，包含根据本发明的改性细菌的疫苗可以用来针对属于布鲁氏菌属的所有细菌种给人或动物接种疫苗，其中所述改性细菌是牛布鲁氏菌种。如本文所用，“受试者”是指可以从施用本文所述的改性细菌受益的人或动物。在一个优选的实施方案中，受试者是选自牛、绵羊、山羊和猪的动物。下表示出不同种的布鲁氏菌和它们优选宿主的关联。之前所述的改性布鲁氏菌的“治疗有效量”是指以适用于任何医学治疗的合理收益/风险比治疗疾病的足够的量。本文所述的疫苗定义为生物试剂，其能够在已经递送疫苗的动物或人中提供保护反应，且不能够引起严重疾病。疫苗刺激针对引起疾病的病原体的抗体产生或细胞免疫；因此施用疫苗造成对疾病的免疫。如果需要，根据本发明的活疫苗可以包含佐剂。具有佐剂活性的合适化合物和组合物的实例是本领域熟知的。此外，疫苗可以引入用于药学或诊断应用的编码多肽的核酸序列，尤其是免疫调节剂例如淋巴因子、干扰素或细胞因子。根据本发明的疫苗可以通过常规方法制备，例如通常用于可商购的活的减活疫苗的那些。可以通过肌内、皮内、皮下或鼻内接种或通过注射，以有效保护受试者针对布鲁氏菌有毒菌株的挑战的量施用疫苗。考虑受试者的大小和体重，这个量可以根据待接种的受试者而变化。根据本发明的疫苗包含有效量的布鲁氏菌突变体作为活性成分，即将在接种疫苗的动物中针对有毒布鲁氏菌挑战诱导免疫的有效量的布鲁氏菌突变体。本文所述的免疫定义为，与没有接种疫苗的组相比，接种疫苗后在动物或人群中针对死亡率和/或临床症状诱导明显更高水平的保护。具体地，根据本发明的疫苗预防大部分接种疫苗的受试者出现疾病的临床症状和/或死亡。当为受试者提供活的细菌疫苗时，施用细菌的剂量将根据以下因素而变化：施用途径、受试者的种类、年龄、体重、身高、性别、总体医疗状况、既往病史等。通常，需要为接受者提供约105cfu/kg至108cfu/kg(受试者体重)的上述细菌的剂量，尽管可以施用更低或更高的剂量。除布鲁氏菌突变体(或所述的其变体)之外，本发明还可以包括包含能够针对另一种病菌诱导保护的疫苗菌株的组合疫苗。本发明的进一步的方面和优势将在以下附图和实施例中公开，其应当认为是说明性的，而不限制本申请的范围。附图说明图1：在感染后24h和48h，ba-亲本菌株和构建体菌株babδwadc,babδppdk、babδppdkprh001_ppdk、babδwadcδppdk和babδwadcδppdk::wbdr在bmdc中的细胞内复制。结果代表三个独立实验的平均值±标准误差，每个实验重复三次。图2：如流式细胞仪测量的，用ba-亲本、babδwadc,babδppdk、babδppdkprh001_ppdk、babδwadcδppdk和babδwadcδppdk::wbdr菌株感染后24h在bmdc中的激活分子cd40、cd80、cd86和mhcii的表面表达。结果代表平均中值强度±标准误差，且代表四个独立实验。图3：如elisa测量的，用ba-亲本、babδwadc,babδppdk、babδppdkprh001_ppdk、babδwadcδppdk和babδwadcδppdk::wbdr菌株感染后24h由bmdc释放的il-6、il-12、p70和tnf-α。结果代表四个独立实验。图4：如elisa测量的，用bm-亲本、bmδwadc,bmδwadcδppdk菌株感染后24h由bmdc释放的il-6、il-12和tnf-α。具体实施方式1)构建wadc突变体(babδwadc)babδwadc已经以具有失活的lpcc基因的突变体bablpcc的名称描述于wo2011/033129，在本发明中类似进行。2)构建在编码丙酮酸磷酸二激酶的基因ppdk中的突变体(babδppdk)如下通过在牛布鲁氏菌2308上的pcr重叠构建基因ppdk(orfbab1_0525；或同源物)的突变：使用引物ppdk-f1(5′-ctcccgattcatttttcacg-3′seqidno:1)和ppdk-r2(5′-tgctcatttcagccaggtt-3′seqidno:2)扩增包括ppdkorf的初始103bp以及ppdk起始密码子上游的185bp的288bp片段，并用引物ppdk-f3(5′-aacctggctgaaatgagcacgggtctcgactatgtgtcc-3′seqidno:3)和ppdk-r4(5′-tcaacgcatcaaagcagaag-3′seqidno:4)扩增包括ppdkorf的最后86bp和ppdk终止密码子下游的134bp的220bp。用引物ppdk-f1和ppdk-r4通过重叠pcr连接两个片段，并将含有等位基因缺失的获得的片段克隆入pcr2.1以产生pmzi-1，测序以确认阅读框被保留，再克隆入pjqkm以产生突变质粒pmzi-2。将该质粒引入牛布鲁氏菌2308，通过nal和蔗糖抗性和km灵敏性，并通过使用ppdk-f1和ppdk-r4的pcr(在babδppdk中扩增508bp的片段，在babppdk-同种回复突变株中扩增2983bp的片段)来选择缺失突变体(babδppdk)和通过等位基因交换产生的同种回复突变株。产生的突变造成93％的ppdkorf损失，用携带野生型基因的质粒进行互补(菌株babδppdkprh001_ppdk)证实，突变体的表型是由ppdk的缺失造成。3)构建根据本发明的双突变体：babδwadcδppdk为构建babδwadcδppdk双突变体，将突变质粒pmzi-2引入携带wadc突变的菌株babδwadc。等位基因交换后，如上所述使用引物ppdk-f1(seqidno:1)和ppdk-r4(seqidno:4)选择双突变体。类似地构建bmδwadcδppdk双突变体，但使用羊布鲁氏菌菌株。4)布鲁氏菌疫苗候选物的基因标记使用非整合型质粒，克隆编码在大肠杆菌o:157:h7的杂聚lpso-多糖中乙酰化骨胺的转移酶的wbdr(orfz3192)基因，并将携带该基因的质粒通过结合引入牛布鲁氏菌。1h-nmr分析表明，该构建体表达含有60％n-乙酰骨胺和40％甲酰骨胺的o-多糖。单克隆抗体分析表明，该构建体不含a表位，但保留c表位。此外，如实验室动物的免疫所表明，n-乙酰骨胺-n-甲酰骨胺多糖携带在野生型牛布鲁氏菌中不存在的新表位。为了克服任何可能的质粒不稳定性，将wbdr基因整合入牛布鲁氏菌疫苗候选物(babδwadc、babδppdk和babδwadcδppdk)的染色体。为此，使用mini-tn7，用自杀质粒puc18r6ktmini-tn7tkm(llobet等,antimicrobagentschemother.,53(1):298-302,2009)进行基因靶向的技术。该策略依赖位于基因glms(编码葡糖胺-6-磷酸合成酶)和recg(编码atp依赖型dna解旋酶)之间的基因间区域的区域中稳定的tn7插入(choi等,natmethods.,2(6):443-8,2005；andnatprotoc.,1(1):170-8,2006)。为了标记，借助于大肠杆菌hb101prk2013(其允许质粒的移动)，将牛布鲁氏菌构建体与供体大肠杆菌s17λpir(携带puc18r6ktmini-tn7tkm-pwbdr)和大肠杆菌sm10λpirptns2(其质粒编码tn7转运的信息)配对。在含有卡那霉素的培养基上选择其中发生整合的细菌(babδwadcδppdk::wbdr)。为了确保插入立即出现在glms的终止密码子之后，用对tn7末端特异性的寡核苷酸tn7r-tn7l，和glms-和recg-特异性的寡核苷酸进行pcr。为了确认发生tn7的单个插入，进行southern印迹分析。该标记方法也适用于其他构建体。细胞内增殖试验从6-8周龄的c57bl/6雌鼠的股骨分离骨髓细胞，并在去补充胎牛血清(eurobio,france)和gm-csf存在下如之前所述(inaba等,jexpmed,176:1693–1702,1992)将其分化为树突状细胞(bmdc)。通过以30:1的细菌：细胞比将细菌离心至分化细胞(4℃,400xg10分钟)，并于37℃孵育(5％co2)30分钟进行感染。然后，用培养基温和洗涤细胞以除去细胞外细菌，并在补充有50μg/ml庆大霉素的培养基中孵育1h以杀死任何残留的细胞外细菌。然后，将抗生素浓度降低至10μg/ml。为了监测布鲁氏菌的细胞内存活，在感染后24h和48h，用含有0.1％(体积/体积)tritonx-100的h2o裂解感染细胞，并在铺板于胰蛋白大豆琼脂(三次重复)以列举cfu之前对回收的裂解物进行系列稀释。用不同的布鲁氏菌野生型和突变菌株感染24小时后(参见以上)，在bmdc的上清液中根据制造商的说明(来自ebioscience的elisa试剂盒)通过酶联免疫吸附试验测定il-6、il-12、p70和tnf-α的水平。流式细胞仪用不同野生型和突变的布鲁氏菌菌株感染24h后(参见以上)，收集bmdc并在用3％多聚甲醛固定之前为了表面受体的表达立即染色。用全部来自biolegend的小鼠特异性的荧光-偶联抗体cd11c:pe-cy7(克隆n418),ia-ie:pe(mhcii类克隆m5/114.15.2)(pe)、cd86:fitc(克隆gl-1)、cd40:alexafluor647(克隆3/23)和cd80:pe-cy5(克隆16-10a1)标记细胞。然后用facscantoii(bectindickinson)对标记细胞进行多色血细胞计数，并用flowjo软件分析数据(在定量受体表达前首先控制(gateon)cd11c+群体)。图2-4表明，双突变体能够引发若干炎性白细胞介素，尤其是il-6、il-12和tnf-α的强烈释放。在根据本发明的细菌中ppdk和wadc基因突变的特定组合产生强烈的免疫反应，从而增强含有这种突变体的疫苗的功效。与简单的δwadc突变体(与所用菌株无关)相比，双突变体诱导明显更高的促炎性细胞因子的产生。图1进一步表明，在注射后48h，树突状细胞能够完全消除双突变体。当前第1页12