本发明涉及手性拆分
技术领域：
，具体而言，涉及一种异丁酸酯类化合物的手性拆分方法。
背景技术：
：绝大多数的药物由手性分子构成，两种手性分子可能具有明显不同的生物活性。药物分子必须与受体(起反应的物质)分子几何结构匹配，才能起到应有的药效。因此，往往两种异构体中仅有一种是有效的，另一种无效甚至有害。杂环取代的异丁酸酯衍生物是一类结构较为简单，用途广泛的一类化合物，其某些化合物是目前实验及临床阶段的许多新药中间体。文献(bioorganicandmedicinalchemistryletters,2015,vol.25,#3,p.668-672)中报道手性吡唑异丁酸衍生物的化学合成方法，反应过程涉及到碱水解、手性试剂拆分、柱层析纯化分离等过程，此方法步骤长，手性试剂较难筛选，价格昂贵，经济性差，极大地限制了手性吡唑异丁酸衍生物的工业大规模化生产。而色谱拆分法则需要使用昂贵的特殊固定相，成本太高，操作也较为复杂。技术实现要素：本发明的主要目的在于提供一种异丁酸酯类化合物的手性拆分方法，以解决现有技术中异丁酸酯类化合物手性拆分成本高、操作复杂的问题。为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种异丁酸酯类化合物的手性拆分方法，该异丁酸酯类化合物为外消旋异丁酸酯类化合物，具有如下结构通式其中r1选自：取代或未取代的吡啶、取代或未取代的吡唑、取代或未取代的嘧啶酮、取代或未取代的4-羟基喹啉、取代或未取代的喹唑啉、取代或未取代的喹唑啉酮中的任意一种，r2选自c1～c7的取代或未取代的烷基、c6～c10的取代或未取代的芳基，手性拆分方法包括：步骤s1，采用水解酶对外消旋异丁酸酯类化合物进行水解处理，得到水解后体系，上述水解酶为来源于thermomycessp.、rhizomucormiehei、bacillussp.的水解酶，上述水解酶为20000l脂肪酶、tl100l脂肪酶、asym-503023脂肪酶中的任意一种；步骤s2，将水解后体系中酸和未被水解的异丁酸酯类化合物分离。进一步地，上述r1选自中的任意一种，其中r3为h、甲基、卤素或烷氧基，r2为乙基、丁基、丙基、异丁基、苯基、苄基中的任意一种。进一步地，上述烷氧基选自甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、异丁氧基、仲丁氧基和叔丁氧基中的任意一种。进一步地，上述水解酶用量为0.005～2.0g/g外消旋异丁酸酯类化合物。进一步地，上述水解酶用量为0.005～0.50g/g外消旋异丁酸酯类化合物。进一步地，上述步骤s1包括：将异丁酸酯类化合物、促溶剂、水解酶和缓冲溶液混合形成水解反应体系；将水解反应体系保温处理进行水解反应，得到水解后体系。进一步地，上述缓冲溶液选自磷酸盐缓冲溶液、乙酸-乙酸盐缓冲溶液、三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液。进一步地，上述缓冲溶液的ph值为5.0～9.0。进一步地，上述促溶剂选自乙酸乙酯、二甲基亚砜、聚乙二醇、甲醇、乙醇、乙腈、甲基叔丁基醚、正庚烷、正己烷、二氯甲烷、四氢呋喃、正丁醇中的任意一种或多种。进一步地，上述促溶剂为乙酸乙酯、四氢呋喃、甲基叔丁基醚、乙醇或异丙醇。进一步地，上述水解反应的温度为10～50℃。进一步地，上述水解反应的温度为20～40℃。进一步地，上述水解反应的温度为25～35℃。进一步地，上述水解反应的时间为8～120h。进一步地，上述水解反应的时间为8～24h。进一步地，上述步骤s2包括：对水解后体系进行萃取、相分离，得到含有异丁酸酯类化合物的第一有机相和含有水解产物的第一水相；调节第一水相的ph值至3以下，萃取第一水相，相分离得到第二有机相和第二水相，浓缩第二有机相，得到水解产物。应用本发明的技术方案，利用水解酶选择性水解外消旋的异丁酸酯类化合物，获得单一构型的异丁酸酯衍生物或者对应的水解酸。该方法所用的水解酶稳定性好，对应体选择性好，与其他拆分技术相比，本发明中的技术反应条件温和，原料及催化剂易得且成本低，操作简单，对环境友好，适合工业化生产。具体实施方式需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将结合实施例来详细说明本发明。术语“取代”意思是在一个特定的原子上一个或更多的氢被指定的基团所替代，其中取代所用的取代基可以为本领域常用的取代基，比如卤素、烷基、羟基、硝基、烷氧基等，如果指定的原子的正常化合价在现有的情况下没有超出，那么取代后结果是一个稳定的化合物。如本申请
背景技术：
所分析的，现有技术中的手性的杂环取代的异丁酸酯衍生物或者对应的酸，需要手性试剂拆分或者色谱分离法分离，其中手性试剂较难筛选，价格昂贵，经济性差；色谱拆分法需要使用昂贵的特殊固定相，成本太高，操作也较为复杂。为了降低成本、简化操作，本申请提供了一种异丁酸酯类化合物的手性拆分方法，该异丁酸酯类化合物具有如下结构通式其中r1选自：取代或未取代的吡啶、取代或未取代的吡唑、取代或未取代的嘧啶酮、取代或未取代的4-羟基喹啉、取代或未取代的喹唑啉、取代或未取代的喹唑啉酮中的任意一种，r2选自c1～c7的取代或未取代的烷基、c6～c10的取代或未取代的芳基，异丁酸酯类化合物中具有外消旋异丁酸酯类化合物，手性拆分方法包括：步骤s1，采用水解酶对外消旋异丁酸酯类化合物进行水解处理，得到水解后体系，上述水解酶为来源于thermomycessp.、rhizomucormiehei、bacillussp.的水解酶，所述水解酶为20000l脂肪酶、tl100l脂肪酶、asym-503023脂肪酶中的任意一种；步骤s2，分离出水解后体系中未被水解的异丁酸酯类化合物。该方法利用水解酶选择性水解外消旋的异丁酸酯类化合物，获得单一构型的异丁酸酯衍生物或者对应的水解酸。该方法所用的水解酶稳定性好，对应体选择性好，与其他拆分技术相比，本发明中的技术反应条件温和，原料及催化剂易得且成本低，操作简单，对环境友好，适合工业化生产。用于本申请的水解酶均为商品化酶，本申请对当前100多种商品化酶进行筛选，发现当水解酶为来源于thermomyces.sp、rhizomucormiehei、bacillussp.的水解酶时，手性拆分效果更突出。在对水解酶进行选择时，由于水解酶的种类繁多，比如水解酶又包含脂肪酶、蛋白酶、淀粉酶等多种，即使是来源于上述菌属的水解酶，因具体菌种的差异、序列的不同、是否经过突变、突变位点的变化等等，都会导致水解酶的活性不同，在本申请在对来源于thermomyces.sp、rhizomucormiehei、bacillussp.的野生酶、对野生酶突变以及商品酶进行对比后，即使本申请发明人付出的大量努力，其手性拆分效果也并不是特别理想，反而发现水解酶为20000l脂肪酶、tl100l脂肪酶、asym-503023脂肪酶这三种脂肪酶中的任意一种时，能够有效满足拆分要求。上述诺维信提供的20000l脂肪酶为来自于rhizomucormiehei的脂肪酶，诺维信提供的tl100l脂肪酶为来自于thermomycessp.的脂肪酶，天津凯莱英提供的asym-503023脂肪酶为来自于bacillussp.的脂肪酶。从酶的催化活性推断具有上述结构通式的异丁酸酯类化合物都可以采用本申请的水解酶水解催化实现手性拆分，尤其是当结构通式中的取代基做出以下选择时，其拆分效率尤其显著，比如r1选自中的任意一种，其中r3为h、甲基、卤素或烷氧基，r2为乙基、丁基、丙基、异丁基、苯基、苄基中的任意一种。上述卤素为氟、氯、溴和碘，优选氟、氯和溴，“烷氧基”是指烷基醚基(o-烷基)，烷氧基的非限定性实施例包括甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、异丁氧基、仲丁氧基和叔丁氧基等。水解酶水解对象主要为外消旋异丁酸酯类化合物，因此其用量可以根据外消旋异丁酸酯类化合物的含量来选择，为了提高水解酶的利用率以及水解催化效率，优选上述水解酶用量为0.005～2.0g/g外消旋异丁酸酯类化合物；更优选为0.005～0.50g/g外消旋异丁酸酯类化合物。本申请的水解只需要将水解酶和异丁酸酯类化合物溶解在溶剂中进行接触催化水解，为了提高水解效率，在一种实施例中，上述步骤s1包括：将异丁酸酯类化合物、促溶剂、水解酶和缓冲溶液混合形成水解反应体系；将水解反应体系保温处理进行水解反应，得到水解后体系。将异丁酸酯类化合物、促溶剂、水解酶混合形成均一的反应体系，并且采用缓冲溶液为水解反应体系提供适于水解酶活性的ph值环境，然后在水解酶合适的温度下进行水解反应，进而尽可能实现水解酶的高活性发挥。添加异丁酸酯类化合物时，可以先将异丁酸酯类化合物溶解于促溶剂中形成溶液，然后将该异丁酸酯类化合物溶液与水解酶和缓冲溶液混合。形成上述促溶剂可以采用任何对异丁酸酯类化合物具有高溶解性的有机溶剂，比如乙酸乙酯、二甲基亚砜、聚乙二醇、甲醇、乙醇、乙腈、甲基叔丁基醚、正庚烷、正己烷、二氯甲烷、四氢呋喃、正丁醇等其他本领域常用的试剂，上述促溶剂可以提高异丁酸酯类化合物的转化率和/或产物e.e.值。而且，不同类型的溶剂，对转化率和产物e.e.值影响也不同。优选上述促溶剂为乙酸乙酯、四氢呋喃、甲基叔丁基醚、乙醇或异丙醇，从而提高转化率和产物e.e.值。用于本申请的缓冲溶液可以采用酶常用的缓冲溶液，为了节约成本，优选上述缓冲溶液选自磷酸盐缓冲溶液、乙酸-乙酸盐缓冲溶液、三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液，优选缓冲溶液的ph值为5.0～9.0。上述磷酸盐缓冲溶液可以为本领域常用的磷酸钾缓冲溶液、磷酸钠缓冲溶液等。在反应过程中，随着水解的进行，水解反应体系的ph值发生变化，为了维持水解酶的高活性，优选在水解反应过程中维持水解反应体系的ph值为7.0～8.0，优选采用磷酸、乙酸、盐酸调节水解反应体系的ph值。本申请的水解反应温度可以在水解酶活性发挥的温度范围内进行选择，为了尽可能使水解酶具有高活性，优选上述水解反应的温度为10～50℃，优选为20～40℃，进一步优选为25～35℃。由于水解酶催化的水解反应相对温和，因此为了提高水解转化率，可以适当延长水解反应时间，并且可以根据底物中外消旋体的含量来选择更合适的水解反应时间，优选上述水解反应的时间为8～120h，优选为8～24h。在本申请另一种实施例中，上述步骤s2包括：对水解后体系进行萃取、相分离，得到含有异丁酸酯类化合物的第一有机相和和含有水解产物的第一水相；调节第一水相的ph值至3以下萃取第一水相，相分离得到第二有机相和第二水相，浓缩第二有机相，得到水解产物。在完成水解后，所得水解后体系中物质具有不同的溶解性，因此采用上述萃取传统方式即可完成分离。其中水解后体系萃取所用萃取剂和第一水相萃取所用的萃取剂可以是相同的萃取剂。以下将结合实施例和对比例，进一步说明本申请的有益效果。本申请实施例所用的rhizomucormiehei酶液为诺维信提供的20000l脂肪酶；thermomycessp.酶液为诺维信提供的tl100l，bacillussp.冻干粉制剂为天津凯莱英提供的asym-503023脂肪酶。实施例110ml的反应瓶中，将0.1g底物酯加入5ml0.3m磷酸钾缓冲液中，调ph为7.0～7.5，加入水解酶0.005～0.1g(冻干粉制剂或酶液，具体见表1)形成水解反应体系，控制水解反应体系ph为7.0～7.5，30℃±3℃恒温搅拌一定时间，得到水解后体系。取100μl水解后体系用900μl50％乙腈终止反应，充分震荡混匀后，8000rpm离心1min，得到上清水相和有机固相，上清水相用氮气吹干后，溶于乙醇，hplc检测转化率及手性，下列底物分别筛选了水解酶100种(此100种水解酶均是来自商业化酶，文献报道的已知序列人工合成或上述序列经过人工突变得到)，经hplc检测转化率及手性，绝大多数的水解酶的反应体系中剩余大量原料，没有产品生成。表1示出了检测到有产品生成的体系且产物e.e.值>90％。表1实施例2(1)投料：向100ml反应瓶中，加入水解酶thermomyces.sp0.5g，30ml三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液(300mm，ph＝9.0)，搅拌，酶溶解于三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液中；(2)加底物：向上述反应瓶中计入1g主原料搅拌，体系ph＝9.0；(3)反应：体系于30℃反应，搅拌反应24h，用1nnaoh维持体系ph至9.0；(4)后处理：反应毕体系加入20ml乙腈，搅拌30min然后经硅藻土垫过滤，所得有机相体系用碳酸氢钠溶液调ph至8～9，加入20ml乙酸乙酯萃取三次，水相用0.5m盐酸调ph至2～3，产物析出，控制产物温度在40～45℃进行浓缩，过滤，得产物经检测其纯度99％，e.e.值85.97％。实施例3(1)投料：向100ml反应瓶中，加入水解酶thermomyces.sp0.05g，25ml磷酸钾缓冲液(100mm，ph＝7.5)，搅拌，酶溶解于磷酸钾缓冲液中；加入2.5ml乙酸乙酯(2)加底物：向上述反应瓶中加入1g主原料搅拌，用1nnaoh维持体系ph至7.5；(3)反应：体系于40℃反应，搅拌反应120h，用1nnaoh维持体系ph至7.5；(4)后处理：取100μl体系用900μl50％乙腈终止反应，充分震荡混匀后，以8000rpm转速离心1min，所得上清液相用氮气吹干后，溶于乙醇，hplc检测转化率为45.67％，产物为e.e.值为99.5％。实施例4：(1)投料：向250ml反应瓶中，加入水解酶rhizomucormiehei0.5g，50ml磷酸钾缓冲液(100mm，ph＝7.5)，搅拌，酶溶解于磷酸钾缓冲液中；(2)加底物：向上述反应瓶中，1g主原料搅拌，用1nnaoh维持体系ph至7.5；(3)反应：体系于50℃反应，搅拌反应12h，用1nnaoh维持体系ph至7.5(4)后处理：取100μl体系用900μl50％乙腈终止反应，充分震荡混匀后，以8000rpm转速离心1min，所得上清液相用氮气吹干后，溶于乙醇，hplc检测转化率为63.25％，剩余底物为e.e.值为96.98％。实施例5：(1)投料：向100ml反应瓶中，加入水解酶bacillussp0.1g，10ml磷酸钾缓冲液(100mm，ph＝7.0)，搅拌，酶溶解于磷酸钾缓冲液中；(2)加底物：向100ml反应瓶中，1g主原料搅拌，用0.5nnaoh维持体系ph至7.0；(3)反应：体系于25℃反应，搅拌反应24h，用1nnaoh维持体系ph至7.0(4)后处理：反应毕体系加入20ml乙腈，搅拌30min然后经硅藻土垫过滤，所得有机相体系用碳酸氢钠溶液调ph至8～9，加入20ml乙酸乙酯萃取三次，得到含有剩余底物的有机相；水相用0.5m盐酸调ph至2～3，加入20ml乙酸乙酯萃取三次，将三次萃取得到的有机相浓缩，控制有机相温度在40～45℃进行浓缩，得产物经检测其收率32.11％，e.e.值98.69％。实施例6：(1)投料：向100ml反应瓶中，加入水解酶bacillussp0.1g，40ml乙酸-乙酸铵缓冲液(100mm，ph＝6.0)，搅拌，酶溶解于乙酸-乙酸铵缓冲液中；(2)加底物：向上述反应瓶中，1g主原料搅拌，体系ph6.0；(3)反应：体系于25℃反应，搅拌反应24h，用1nnaoh维持体系ph至6.0；(4)后处理：取100μl体系用900μl50％乙腈终止反应，充分震荡混匀后，以8000rpm转速离心1min，所得上清液相用氮气吹干后，溶于乙醇，hplc检测转化率为37.35％，产物为e.e.值为97.63％。实施例7：(1)投料：向100ml反应瓶中，加入水解酶bacillussp1g，20ml磷酸钾缓冲液(100mm，ph＝7.5)，搅拌，酶溶解于磷酸钾缓冲液中；(2)加底物：向100ml反应瓶中，1g主原料搅拌，用0.5nnaoh维持体系ph至7.5；(3)反应：体系于20℃反应，搅拌反应8h，用1nnaoh维持体系ph至7.5；(4)后处理：取100μl体系用900μl50％乙腈终止反应，充分震荡混匀后，以8000rpm转速离心1min，所得上清液相用氮气吹干后，溶于乙醇，hplc检测转化率为33.73％，产物为e.e.值为85.35％。实施例8：(1)投料：向100ml反应瓶中，加入水解酶thermomyces.sp2g，30ml乙酸-乙酸钠缓冲液(100mm，ph＝5.0)，搅拌，酶溶解于乙酸-乙酸钠缓冲液中；(2)加底物：向100ml反应瓶中，1g主原料搅拌，用0.5nnaoh维持体系ph至5.0；(3)反应：体系于30℃反应，搅拌反应8h，用1nnaoh维持体系ph至5.0；(4)后处理：取100μl体系用900μl50％乙腈终止反应，充分震荡混匀后，以8000rpm转速离心1min，所得上清液相用氮气吹干后，溶于乙醇，hplc检测转化率为18.52％，产物为e.e.值为96.65％。实施例9：(1)投料：向100ml反应瓶中，加入水解酶thermomyces.sp2g，30ml磷酸钾缓冲液(100mm，ph＝7.5)，搅拌，酶溶解于磷酸钾缓冲液中；(2)加底物：向100ml反应瓶中，1g主原料搅拌，用0.5nnaoh维持体系ph至7.5；(3)反应：体系于10℃反应，搅拌反应40h，用1nnaoh维持体系ph至7.5；(4)后处理：取100μl体系用90μl50％乙腈终止反应，充分震荡混匀后，以8000rpm转速离心1min，所得上清液相用氮气吹干后，溶于乙醇，hplc检测转化率为26.79％，产物为e.e.值为95.26％。实施例10：(1)投料：向100ml反应瓶中，加入水解酶bacillussp0.2g，50ml磷酸钾缓冲液(100mm，ph＝7.5)，搅拌，酶溶解于磷酸钾缓冲液中；(2)加底物：向100ml反应瓶中，加入溶于1.5mldmso的1g主原料搅拌，用0.5nnaoh维持体系ph至7.5；(3)反应：体系于30℃反应，搅拌反应8h，用1nnaoh维持体系ph至7.5；(4)后处理：取100μl体系用900μl50％乙腈终止反应，充分震荡混匀后，以8000rpm转速离心1min，所得上清液相用氮气吹干后，溶于乙醇，hplc检测转化率为30.59％，产物为e.e.值为96.57％。实施例11：(1)投料：向100ml反应瓶中，加入水解酶bacillussp0.2g，50ml磷酸钾缓冲液(100mm，ph＝7.5)，搅拌，酶溶解于磷酸钾缓冲液中；(2)加底物：向100ml反应瓶中，加入溶于1.5mldmso的1g主原料搅拌，用0.5nnaoh维持体系ph至7.5；(3)反应：体系于50℃反应，搅拌反应8h，用1nnaoh维持体系ph至7.5；(4)后处理：取100μl体系用900μl50％乙腈终止反应，充分震荡混匀后，以8000rpm转速离心1min，所得上清液相用氮气吹干后，溶于乙醇，hplc检测转化率为40.97％，产物为e.e.值为95.64％。实施例12：(1)投料：向100ml反应瓶中，加入水解酶bacillussp0.2g，50ml磷酸钾缓冲液(100mm，ph＝7.5)，搅拌，酶溶解于磷酸钾缓冲液中；(2)加底物：向100ml反应瓶中，加入溶于1.5mldmso的1g主原料搅拌，用0.5nnaoh维持体系ph至7.5；(3)反应：体系于20℃反应，搅拌反应8h，用1nnaoh维持体系ph至7.5；(4)后处理：取100μl体系用900μl50％乙腈终止反应，充分震荡混匀后，以8000rpm转速离心1min，所得上清液相用氮气吹干后，溶于乙醇，hplc检测转化率为26.43％，产物为e.e.值为95.88％。实施例13：(1)投料：向100ml反应瓶中，加入水解酶bacillussp0.2g，30ml磷酸钾缓冲液(100mm，ph＝7.5)，搅拌，酶溶解于磷酸钾缓冲液中；(2)加底物：向100ml反应瓶中，1g主原料搅拌，用0.5nnaoh维持体系ph至7.5；(3)反应：体系于40℃反应，搅拌反应8h，用1nnaoh维持体系ph至7.5；(4)后处理：取100μl体系用900μl50％乙腈终止反应，充分震荡混匀后，以8000rpm转速离心1min，所得上清液相用氮气吹干后，溶于乙醇，hplc检测转化率为35.45％，产物为e.e.值为96.79％。实施例14：(1)投料：向100ml反应瓶中，加入水解酶thermomyces.sp0.5g，50mltris-cl缓冲液(100mm，ph＝7.5)，搅拌，酶溶解于tris-cl缓冲液中；(2)加底物：向150ml反应瓶中，加入1g主原料搅拌，用0.5nnaoh维持体系ph至7.5；(3)反应：体系于30℃反应，搅拌反应16h，用1nnaoh维持体系ph至7.5；(4)取样：取100μl体系用900μl50％乙腈终止反应，充分震荡混匀后，以8000rpm转速离心1min，所得上清液相用氮气吹干后，溶于乙醇，产物为结果见下表。另外，在加底物时将1g主原料溶于表2中的促溶剂中加入，测试相应的转化率和产物e.e.值，记录在表2中。表2促溶剂转化率产物e.e值无30.59％95.88％乙酸乙酯39.93％99.67％四氢呋喃32.82％96.52％异丙醇36.86％94.77％乙醇40.42％96.66％甲醇32.75％93.56％二甲基亚砜35.50％97.73％乙腈31.27％95.68％正庚烷48.57％85.75％正己烷47.64％88.05％甲基叔丁基醚37.42％96.53％以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。当前第1页12