一种合成抗癌药物中间体的重组大肠杆菌及其构建方法和应用与流程

文档序号：25521519发布日期：2021-06-18 20:09阅读：201来源：国知局

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种重组大肠杆菌及其构建方法和应用，尤其涉及一种合成抗癌药物中间体的重组大肠杆菌及其构建方法和应用。

背景技术：

癌症严重威胁人类健康，其诱发因素往往源于信号通路中激酶的异常活化。另外，自身免疫病、神经退行病等常见高发慢性病也与激酶异常密切相关。2001年，第一个激酶抑制剂类药物格列卫(gleevec)在美获批上市，开启了癌症靶向治疗新时代，疗效显著优于化疗。截至2019年底，fda共批准了52个激酶抑制剂。虽然数量较多，但由于癌症种类繁多、涉及的异常激酶众多且变异类型多样、以及使用后耐药等因素，癌症在临床上仍存在重大未满足的治疗需求。另外，这些上市药物仅靶向大约25个激酶，仅占人体518个激酶中的5％，尚有大量激酶暂未成药。因此，这类药物研发空间巨大。

抗肿瘤新药主要来源于天然产物类似物。因此，有效合成天然产物类似物的创新技术对于新药发现来说至关重要。天然产物往往结构复杂，含有多个手性中心。相对于化学合成，因具有严格的区域和立体选择性，生物合成更有优势。尤其是合成生物学原理与技术的日益成熟，使得天然产物类似物的有效合成易于实现。

双吲哚生物碱是一类含有两个吲哚基团的天然产物，代表化合物为具有抗肿瘤活性的星孢菌素(staurosporine)和蝴蝶霉素(rebeccamycin)。星孢菌素是一种来源于放线菌的天然产物，具有广谱强效的激酶抑制活性。据不完全统计，星孢菌素能够有效抑制200多种人体激酶，多个激酶的半抑制浓度(ic50)能够达到nm级别。蝴蝶霉素也是一种来源于放线菌的天然产物，具有强效的拓扑异构酶和激酶抑制活性。开发双吲哚生物碱类似物的有效合成技术，是促成这类化合物广泛成药的关键因素。

星孢菌素的生物合成基因簇dna序列在2002年被测定，天然合成酶系被初步识别。随后，多个天然合成酶如stao、stad、stap、stac等的催化活性在体外生化实验中得到证实，式i显示了星孢菌素的生物合成途径，其中r基团表示＝o或者＝nh，两者可逆。

蝴蝶霉素的生物合成基因簇dna序列也在2002年被测定，天然合成酶系被初步识别，式ii显示了蝴蝶霉素的生物合成途径，其中r基团表示＝o或者＝nh，两者可逆。

对比式i和式ii可知，星孢菌素与蝴蝶霉素的生物合成途径极其相似，其中，stao与rebo系同工酶，stad与rebd系同工酶，stap与rebp系同工酶，但stac与rebc非同工酶，stac催化k252c的合成，而rebc催化1,11-二氯-arcyriaflavina的合成。

基于已鉴定的星孢菌素和蝴蝶霉素的生物合成途径酶系，研究人员在异源宿主白色链霉菌(streptomycesalbus)体内实现了多个双吲哚生物碱类似物的生物合成，例如，以色氨酸为起始使用酶组合rebo，rebd，rebp和stac实现了k252c的合成，以色氨酸为起始使用酶组合rebo，rebd，rebp和rebc实现了arcyriaflavina的合成，然而，上述组合均在白色链霉菌中表达，且产量均未知。

因此，提供一种合成星孢菌素和蝴蝶霉素中间体的生物合成路径和生产菌株对于提高星孢菌素和蝴蝶霉素的产量，以及对抗癌药物的筛选和研发而言具有重要的意义。

技术实现要素：

针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种合成抗癌药物中间体的重组大肠杆菌及其构建方法和应用。所述重组大肠杆菌能够表达合成抗癌药物中间体的酶组合，所述酶组合能够催化原料l-色氨酸合成相应的药物中间体，进而能够为抗癌药物的筛选和研发提供广阔的应用前景。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供一种重组质粒，所述重组质粒携带编码l-色氨酸氧化酶、cpa合成酶和两种单加氧酶的核苷酸序列；

其中，所述l-色氨酸氧化酶为vioa，所述cpa合成酶为viob。

本发明中，所述重组质粒能够表达紫色杆菌素(violacein)、星孢菌素和蝴蝶霉素生物合成途径中的l-色氨酸氧化酶、cpa合成酶以及单加氧酶；并且，所述l-色氨酸氧化酶为vioa，所述cpa合成酶为viob，相较于天然合成酶系中的stao/rebo与stad/rebd，本发明中所用的紫色杆菌素生物合成途径中的vioa与viob具有更高的合成效率，能够高效合成cpa；另外，相较于stac，本发明中所用的spcc具有更高的合成效率，能够高效合成k252c；同时，所述质粒上含有两种单加氧酶，所述单加氧酶相互配合，能够完成cpa的氧化，得到目标产物k252c和arcyriaflavina。

作为本发明优选的技术方案，所述两种单加氧酶为rebp和spcc的组合或rebp和rebc的组合。

本发明中，所述vioa来源于紫色杆菌(chromobacteriumviolaceum)，氨基酸序列长度为418aa，genbank编号为aad51808.1；

本发明中，所述viob来源于紫色杆菌(chromobacteriumviolaceum)，氨基酸序列长度为998aa，genbank编号为aad51809.1；

本发明中，所述rebp来源于扁豆气孔菌(lentzeaaerocolonigenes)，氨基酸序列长度为397aa，genbank编号为aan01211.1；

本发明中，所述spcc来源于三链链霉菌(streptomycessanyensis)，氨基酸序列长度为542aa，genbank编号为agl96582.1；

本发明中，所述rebc来源于扁豆气孔菌(lentzeaaerocolonigenes)，氨基酸序列长度为529aa，genbank编号为aan01210.1。

优选地，所述重组质粒携带编码l-色氨酸氧化酶vioa、cpa合成酶viob、单加氧酶rebp和单加氧酶spcc的核苷酸序列；或者，

所述重组质粒携带编码l-色氨酸氧化酶vioa、cpa合成酶viob、单加氧酶rebp和单加氧酶rebc的核苷酸序列。

本发明中，所述酶组合vioa、viob、rebp和spcc，与酶组合vioa、viob、rebp和rebc，构建在同一个质粒上，四种酶虽然来源不同，但是相互之间不会造成影响，均能够正常的执行其生理功能和催化活性，且相互之间存在一定的配合作用，vioa和viob将原料l-色氨酸氧化并合成cpa，由于cpa的合成效率较高，会使整个生物合成路径进一步向下游进行，rebp和spcc继续催化cpa形成k252c，rebp和rebc则继续催化合成arcyriaflavina；因此，将所述酶组合构建在一个目标质粒上并导入宿主细胞，若宿主细胞能够自发合成l-色氨酸，则所得重组的宿主细胞则能够高效合成抗癌药物中间体k252c或arcyriaflavina。

作为本发明优选的技术方案，所述重组质粒为大肠杆菌表达质粒。

优选地，所述大肠杆菌表达质粒包括petduet系列、pacycduet系列、prsfduet系列、pcoladuet或pcdfduet系列表达载体中的任意一种，优选为pcdfduet系列表达载体。

本发明中，所述质粒可以选择目前已知的商业化质粒，无需对商业化质粒进行进一步的改造即可达到本发明所述的生物合成药物中间体的目的；同样，所述质粒也可选择经过改造的质粒，在符合质粒构建原则的情况下，所述酶组合也能够正常表达目标酶蛋白。

作为本发明优选的技术方案，所述重组质粒上，编码l-色氨酸氧化酶的核苷酸序列和编码cpa合成酶的核苷酸序列相连，编码两个单加氧酶的核苷酸序列相连。

优选地，所述核苷酸序列之间通过核糖体结合位点相连。

本发明中，所述编码l-色氨酸氧化酶vioa的核苷酸序列和编码cpa合成酶viob的核苷酸序列通过核糖体结合位点相连，得到seqidno.1所示的核苷酸序列；编码两个单加氧酶rebp和spcc的核苷酸序列相连，得到seqidno.2所示的核苷酸序列；编码两个单加氧酶rebp和rebc的核苷酸序列相连，得到seqidno.3所示的核苷酸序列。

第二方面，本发明提供一种重组大肠杆菌，所述重组大肠杆菌包含至少一个拷贝的如第一方面所述的重组质粒。

作为本发明优选的技术方案，所述重组大肠杆菌的抗癌药物中间体的产量不低于10μm。

优选地，所述抗癌药物中间体包括k252c和/或arcyriaflavina。

作为本发明优选的技术方案，所述重组大肠杆菌为含有所述重组质粒的商业化大肠杆菌和/或经人工改造的大肠杆菌。

本发明中，所述大肠杆菌的类型不受限制，即所述重组质粒在转入的宿主大肠杆菌中能够正常实现表达功能即可，在本发明中，假设采用petduet系列的表达载体，则可选择的宿主包括大肠杆菌bl21(de3)，而不能采用大肠杆菌dh5α。

优选地，所述重组大肠杆菌为含有所述重组质粒的大肠杆菌bl21(de3)。

大肠杆菌是一种常见的模式生物，其原核表达体系能够高效表达本发明所述的酶组合。本发明中，若采用未经改造的大肠杆菌，所得抗癌药物中间体的产量不低于10μm；若选择能够高效生产l-色氨酸的大肠杆菌，所得中间体的产量将进一步得到提升。

第三方面，本发明还提供一种如第二方面所述的重组大肠杆菌的制备方法，所述制备方法包括：

将如第一方面所述的重组质粒通过电转化或者化学转化的方法转入大肠杆菌，得到所述重组大肠杆菌。

作为本发明优选的技术方案，所述重组质粒的构建方法包括：

将合成的编码l-色氨酸氧化酶、cpa合成酶和至少两种单加氧酶的核苷酸序列通过酶切、连接的方式插入大肠杆菌表达质粒，得到所述重组质粒。

优选地，所述酶切的方式为双酶切。

优选地，所述双酶切的位点组合包括酶切位点ncoi和bamhi的组合和/或酶切位点ndei和xhoi的组合。

第四方面，本发明还提供了如第一方面所述的重组质粒或如第二方面所述的重组大肠杆菌在制备抗癌药物或抗癌药物中间体中的应用。

优选地，所述抗癌药物包括星孢菌素和/或蝴蝶霉素。

本发明所述的数值范围不仅包括上述列举的点值，还包括没有列举出的上述数值范围之间的任意的点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

(1)本发明构建了一种重组质粒，所述重组质粒表达l-色氨酸氧化酶、cpa合成酶和两种单加氧酶，该重组质粒构建的生物合成路径能够以l-色氨酸为原料，表达合成抗癌药物中间体；将所述重组质粒转入大肠杆菌中，能够在大肠杆菌中高效合成抗癌药物中间体，且相对于链霉菌而言，大肠杆菌是实验室和工业上最常用的宿主菌株，其遗传操作与发酵技术均十分成熟且操作简单；

(2)本发明中，所述酶组合vioa和viob的合成效率较高，其合成活性远高于天然合成体系中stao/rebo和stad/rebd的活性，同时，所述酶组合中用到spcc的合成效率也显著高于stac的活性，因此，本发明构建的重组大肠杆菌bl21(de3)/pcdfduet-1_vioaviobrebpspcc及bl21(de3)/pcdfduet-1_vioaviobrebprebc，分别表达酶组合vioa、viob、rebp和spcc，以及酶组合vioa、viob、rebp和rebc，其能够分别有效合成k252c及arcyriaflavina；通过发酵培养所述重组大肠杆菌，可快速、方便、低成本获得大量k252c及arcyriaflavina，其均具有强效的激酶抑制活性；因此，所述重组大肠杆菌在抗癌药物中间体的制备、抗癌药物的筛选和研发等领域具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为实施例2中所得产物的lc/ms检测图谱，其中i图为发酵液萃取样品在290nm处的紫外吸收图谱，ii图为发酵液萃取样品中质荷比(m/z)为312的离子图谱。

图2为实施例2中lc/ms检测图谱中k252c紫外吸收峰所对应的全波长扫描图谱。

图3为实施例3中所得产物的lc/ms检测图谱，其中i图为发酵液萃取样品在316nm处的紫外吸收图谱，ii图为发酵液萃取样品质荷比(m/z)为326的离子图谱。

图4为实施例3中lc/ms检测图谱中arcyriaflavina紫外吸收峰所对应峰的全波长扫描图谱。

具体实施方式

下面结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但下述的实例仅仅是本发明的简易例子，并不代表或限制本发明的权利保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。

以下实施例中，若无特殊说明，所有的试剂及耗材均购自本领域常规试剂厂商；若无特殊说明，所用的实验方法和技术手段均为本领域常规的方法和手段。

实施例1

本实施例用于制备重组质粒pcdfduet-1_vioaviobrebpspcc和pcdfduet-1_vioaviobrebprebc。

所述重组质粒按照如下方法进行构建：

(1)根据大肠杆菌密码子偏好性，设计编码蛋白vioa、viob、rebp、spcc和rebc的核苷酸序列；

其中，所述五个酶蛋白的genbank数据库编号见表1：

表1

(2)将编码vioa和viob的核苷酸片段组合得到如seqidno.1所示的核苷酸序列，其中两基因之间有核糖体结合位点，上下游分别携带ncoi和bamhi酶切位点；

其中，所述核糖体结合位点的核苷酸序列为：

accaacaaggaccatagatt(seqidno.4)；

将编码rebp和spcc的核苷酸片段组合得到如seqidno.2所示的核苷酸序列，其中两基因之间有核糖体结合位点，上下游分别携带ndei和xhoi酶切位点；

其中，所述核糖体结合位点的核苷酸序列为：

attaaagaggagaaattaact(seqidno.5)；

同样的，将编码rebp和rebc的核苷酸片段组合得到如seqidno.3所示的核苷酸序列，其中两基因之间有核糖体结合位点(位点序列为seqidno.5所示的核苷酸序列)，上下游分别携带ndei和xhoi酶切位点；

设计上述核苷酸序列seqidno.1～3后，委托基因合成公司合成。

(3)seqidno.1所示的核苷酸序列经ncoi和bamhi双酶切后，插入经相同酶切处理的商品化载体pcdfduet-1，得到中间质粒pcdfduet-1_vioaviob；

再将seqidno.2和seqidno.3分别经ndei和xhoi双酶切后，插入经相同酶切处理的中间质粒pcdfduet-1_vioaviob，得到表达质粒pcdfduet-1_vioaviobrebpspcc和pcdfduet-1_vioaviobrebprebc。

实施例2

本实施例中使用重组质粒pcdfduet-1_vioaviobrebpspcc构建重组大肠杆菌，并对所得重组大肠杆菌进行试管发酵及产物收集。

具体步骤如下：

(1)将实施例1中获得的质粒pcdfduet-1_vioaviobrebpspcc转入大肠杆菌bl21(de3)，挑取单克隆接种至含2mllb培养基的试管中，37℃，200rpm振荡培养；

(2)待菌液od600生长至0.6～0.8(多试管同时培养)时，加入0.4mmiptg诱导酶蛋白表达，温度降至20℃，振荡培养24h；

(3)发酵结束后，金属浴85℃加热15min；

(4)冷却至室温25℃，加入1倍体积的乙酸乙酯充分混匀进行萃取，37℃，200rpm，30min后离心收集有机相上清，并重复一次；

(5)将收集到的有机相上清合并后，在40℃蒸干，加入50μldmso溶解后进行lc/ms检测。

所述大肠杆菌中k252c的合成路径如式iii所示：

lc/ms检测结果如图1所示，发酵液萃取样品(i图)在3.527min出现了k252c的紫外吸收峰，该峰对应的离子即[m+1]的质/荷比(m/z)为312(ii图)，该峰对应的全波长扫描结果如图2所示；

菌株bl21(de3)/pcdfduet-1_vioaviobrebpspcc成功合成了k252c，其保留时间，[m+1]离子的质/荷比(m/z)，全波长扫描图均与标准品一致；

根据k252c的浓度标准曲线，发酵液中浓度为13μm。

实施例3

与实施例2的区别在于，本实施例中，将质粒pcdfduet-1_vioaviobrebpspcc替换为质粒pcdfduet-1_vioaviobrebprebc，其余步骤与实施例3相同；

所述大肠杆菌中arcyriaflavina的合成路径如式iv所示：

lc/ms检测结果如图3所示，发酵液萃取样品(i图)在3.867min出现了arcyriaflavina的紫外吸收峰，该峰对应的离子即[m+1]的质/荷比(m/z)为326(ii图)，该峰对应的全波长扫描结果如图4所示；

菌株bl21(de3)/pcdfduet-1_vioaviobrebprebc成功合成了arcyriaflavina，其保留时间，[m+1]离子的质/荷比(m/z)，全波长扫描图亦均与标准品一致。

根据arcyriaflavina的浓度标准曲线，发酵液中浓度为96μm。

作为对比，本发明中还构建了质粒pcdfduet-1_staostadstapstac和质粒pcdfduet-1_staostadstapspcc以合成k252c；构建质粒pcdfduet-1_reborebdrebprebc以合成arcyriaflavina；

再通过相同的方法得到重组大肠杆菌后发酵，所得产物的量明显较实施例2和实施例3低，具体数据如表2所示：

表2

由上表2可知，本发明中构建的大肠杆菌的产物浓度明显高于其他酶组合的产物浓度；且由pcdfduet-1_vioaviobrebpspcc与pcdfduet-1_staostadstapstac比较可知，本发明所述的酶组合产量优于天然路径中的酶组合；同样，pcdfduet-1_vioaviobrebprebc与pcdfduet-1_reborebdrebprebc也证明了该结论。

综上所示，本发明中构建的含有酶组合vioa、viob、rebp和spcc，以及酶组合vioa、viob、rebp和rebc的重组大肠杆菌，能够高效合成星孢菌素和蝴蝶霉素的中间体，为抗癌药物的筛选和研发提供广阔的应用前景。

申请人声明，以上所述仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，所属技术领域的技术人员应该明了，任何属于本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

序列表

<110>百缮药业（苏州）有限公司

<120>一种合成抗癌药物中间体的重组大肠杆菌及其构建方法和应用

<130>20210309

<160>5

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<210>1

<211>4274

<212>dna

<213>人工合成()

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