一种重组鱼精蛋白专用编码基因和制备方法

1.本发明涉及生物基因工程领域，具体涉及一种重组鱼精蛋白专用编码基因及其利用该编码基因制备重组鱼精蛋白的方法。


背景技术：

2.成熟雄鱼的精巢组织称鱼精，因具有异味，多被废弃或作废料。鱼精中含有鱼精蛋白 (protamine,pro)，鱼精蛋白也称精蛋白，氨基酸组成的种类和数量不同因鱼种类不同而不同，是一种由30
‑
50个氨基酸组成的多聚阳离子肽，以精氨酸为主，存在各类雄鱼成熟精巢组织与带负电的dna紧密结合。自1937年mcclean等报道了鱼精蛋白能够抑制伤寒埃氏杆菌的生长、miller等发现鱼精蛋白能够抑制多种好氧菌和厌氧菌的呼吸代谢从而影响其成长繁殖之后，鱼精蛋白的抑菌作用才受到人们的广泛关注。鱼精蛋白有较好的抑菌作用，对黄色葡萄球菌、酵母菌、霉菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、四链球菌均表现为抑制效果，现在普遍认为鱼精蛋白抑菌活性是由其分子中存在着大量精氨酸，精氨酸中的正电荷胍基与细胞壁肽聚糖的负电荷产生静电作用，尽管鱼精蛋白的长度、蛋白肽和二级结构不同，但它们均能与细胞膜特异性结合，使细胞膜形成通道或者大孔径，导致细胞内化合物外流。鱼精蛋白通过破坏细胞膜结构，破坏能量代谢相关的电子传递系统和物质转运系统，从而导致整个细胞不能正常运行。作为化学防腐剂的替代品逐渐出现在食品添加剂行列。鱼精蛋白作为绿色防腐剂用于食品行业，由于高蛋白食品在传统的储藏运输过程中，温度的波动容易造成反复冻融，滋生大量微生物导致腐败变质，对其质地和口感影响较大。鱼精蛋白具有较好的保鲜作用，为高蛋白产品保鲜上的应用提供新技术。鱼精蛋白作为肝素唯一拮抗剂，在体外循环手术中能较好的使肝素失去抗凝血作用，在没有肝素的抗凝血特性情况下特别有效。


技术实现要素：

3.本发明的主要目的，在于提供一种重组鱼精蛋白专用编码基因cygbm
‑
8pro，该编码基因的碱基序列如seq id no：9所示。
4.本发明的另一目的，在于提供一种重组鱼精蛋白专用编码基因制备重组鱼精蛋白的方法，包括如下步骤：
5.(1)采用重叠pcr方法将细胞珠蛋白cygb突变获得细胞珠蛋白突变体cygbm；
6.(2)利用细胞珠蛋白突变体cygbm和人工合成的鱼精蛋白pro基因，采用同尾酶bamhi、 bglii不断连接，使最终鱼精蛋白编码基因长度为初始长度7
‑
9倍，与载体pet22b连接后热激转化入bl21感受态，获得工程菌bl21
‑
pet22b
‑
cygbm
‑
8pro；
7.(3)挑取经验证正确的工程菌bl21
‑
pet22b
‑
cygbm
‑
8pro，筛选高表达量菌株；
8.(4)挑取(3)筛选出的高表达量菌株于培养基培养，收集菌体；
9.(5)将步骤(4)收集到的菌体依次采用包涵体裂解液、洗涤液和溶解液处理，得到含有目的蛋白的溶解液；
cygbm
‑
8pro进行cnbr裂解，具体地：将纯化后的融合蛋白cygbm
‑
8pro，置于通风橱中，并于通风橱中加入浓度为0.2m的浓盐酸终、终浓度为50mg/ml的cnbr，避光室温裂解24h，之后加入等体积的ddh2o灭活cnbr；然后采用流速为3ml/min的g
‑
25分子筛进行脱盐纯化，即得所述重组鱼精蛋白，且脱盐纯化采用的平衡液和洗脱液均为去离子水。
18.6.根据权利要求一种编码基因制备鱼精蛋白的方法，其特征在于：所述lb培养基：10g/ltryptone,5g/l yeast extarct,10g/l nacl；乳糖培养基：12g/l tryptone,15g/l yeast extarct,3g/l kh2po4,7g/l k2hpo4,2.5g/l nacl,2g/l葡糖糖，0.7g/l乳糖，0.27g/l mgso4。
19.本发明的有益效果在于：细胞珠蛋白(cytoglobin，cygb)是珠蛋白家族中新的一员， 2001年因其和肝星状细胞一起协同作用而被发现，2002年将其命名为细胞珠蛋白。因cygb 蛋白在大肠杆菌中表达量极大，本发明借助cygb蛋白来实现目的蛋白的高效表达。本发明将cygb内部的甲硫氨酸对应的密码子atg全部突变为异亮氨酸对应的密码子atc(起始密码子除外)获得cygbm；后续纯化过程中再用cnbr切割cygb
‑
鱼精蛋白中的甲硫氨酸位点，以裂解出鱼精蛋白。同时，为增加鱼精蛋白的拷贝数，利用同尾酶bamhi、bglii不断连接，使最终鱼精蛋白编码基因长度为初始长度7
‑
9倍(优选为8倍)，构建了cygbm
‑
8pro专用编码基因。因此，本发明提供了一种鱼精蛋白专用编码基因并揭露了利用该编码基因制备融合鱼精蛋白的方法，且该编码基因能够有效的制备所得融合鱼精蛋白，经cnbr裂解易于实现重组鱼精蛋白的大量制备，且所获得的重组鱼精蛋白具有抑菌效果。
附图说明
20.下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
21.图1是本发明中重叠延伸pcr定点突变cygb流程图
22.图2是本发明中pet22b
‑
cygbm
‑
8pro质粒的构建流程图
23.图3是本发明中g
‑
25葡聚糖柱分离纯化
24.图4是本发明中肝素琼脂糖凝胶柱分离纯化
25.图5是本发明中cm阳离子琼脂糖凝胶柱分离纯化
26.图6是本发明中不同浓度重组鱼精蛋白的抑菌活性
27.图7是本发明中重组鱼精蛋白处理虾储存期间ph值变化曲线图
28.图8为本发明中重组鱼精蛋白处理虾储存期间tvb
‑
n值变化曲线图。
具体实施方式
29.下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。以下各实施例中所采用的分子生物学实验技术包括pcr扩增、质粒提取、质粒转化、酶切等都采用常规的方法。实施例1鱼精蛋白专用编码基因的构建
30.1.1 pet22b
‑
cygbm质粒的构建(构建过程如图1所示)
31.将cygb内部的甲硫氨酸对应的密码子atg全部突变为异亮氨酸对应的密码子atc(起始密码子除外)获得cygbm。设计引物：根据cygb的序列以及要突变的位点，设计了8条引物，引物序列如下：
32.seq id no.1:5
’‑
aacatatggagaaagtgccaggcgag
‑3’
33.seq id no.2:5
’‑
ggcccagatagcctgcaccgccttcc
‑3’
34.seq id no.3:5
’‑
cggtgcaggctatctgggcccggctc
‑3’
35.seq id no.4:5
’‑
ctccaggggatcttcgatgtgcttgaactggc
‑3’
36.seq id no.5:5
’‑
cacatcgaagatcccctggagatcgagcggagc
‑3’
37.seq id no.6:5
’‑
gagggccccgatgactcggcaggcgtgc
‑3’
38.seq id no.7:5
’‑
gccgagtcatcggggccctcaacac
‑3’
39.seq id no.8:5
’‑
caggatcccggccccgaagagggcagtg
‑3’
40.以实验室保存的质粒pet22b
‑
cygb为模板(cygb来自hepg2细胞)，以seq id no.1为上游和以seq id no.6为下游，pcr得片段1
‑
6。以seq id no.7为上游和以seq id no.8为下游，pcr得片段7
‑
8。跑核酸电泳后，回收纯化片段1
‑
6和7
‑
8。以回收得到的片段1
‑
6和 7
‑
8为模板，以seq id no.1为上游和以seq id no.8为下游，pcr得片段(1
‑
8)67。跑核酸电泳后，回收纯化片段(1
‑
8)67。以回收得到的片段(1
‑
8)67模板，以seq id no.1为上游和以seq id no.4为下游，pcr得片段1
‑
4。以seq id no.5为上游和以seq id no.8为下游，pcr得片段5
‑
8。跑核酸电泳后，回收纯化片段1
‑
4和5
‑
8。以回收得到的片段1
‑
4和5
‑
8 为模板，以seq id no.1为上游和以seq id no.8为下游，pcr得片段(1
‑
8)45。跑核酸电泳后，回收纯化片段(1
‑
8)45。以回收得到的片段(1
‑
8)45模板，以seq id no.1为上游和以seq id no.2为下游，pcr得片段1
‑
2。以seq id no.3为上游和以seq id no.8为下游， pcr得片段3
‑
8。跑核酸电泳后，回收纯化片段1
‑
2和3
‑
8。以回收得到的片段1
‑
2和3
‑
8为模板，以seq id no.1为上游和以seq id no.8为下游，pcr得片段(1
‑
8)23，即cygbm。cygbm和pet22b用ndei/ecori双酶切，目的片段进行凝胶回收后连接，构建pet22b
‑
cygbm (构建过程如图1所示)。将质粒pet22b
‑
cygbm与bl21感受态混合，42℃热激转化，37℃ 100μl/ml(amp
+
)lb平板培养20小时,挑选单克隆菌落经pcr法和双酶切法筛选，阳性克隆子命名为工程菌bl21
‑
pet22b
‑
cygbm。
41.其中，pcr反应体系为(体系总体积为50μl)：ddh 2 037μl，10
×
pyrobest buffer 5μl， 5μm上游引物1.3μl，5μm下游引物1.3μl，dntps 4μl，模板质粒pet22b
‑
cygb 1μl， pyrobest 0.3μl。pcr反应程序：94℃预变性4min；94℃变性45s，60℃退火30s，72℃延伸1min10s，循环30次；72℃10min；4℃保存。酶切体系(体系总体积为10μl)： 10
×
h buffer 1μl；cygbm片段或pet22b质粒8.4μl；nde i 0.3μl；xho i 0.3μl。酶切条件：37℃水浴4～5h。酶连体系(体系总体积为10μl)：10
×
ligase buffer 1μl； pet22b 1μl，cygbm 7μl；t4dna ligase1μl。反应条件:16℃酶连过夜(14h)，用热激转化法把重组质粒转入到e.coli dh5α菌感受态中进行筛选。
42.1.2工程菌bl21
‑
pet22b
‑
cygbm
‑
8pro
43.pet22b
‑
cygbm质粒由实验室前期构建并保存。鱼精蛋白(protamine，pro)基因由上海生工生物工程有限公司合成，上海生工生物工程有限公司将合成的鱼精蛋白基因插入puc57常规克隆载体中，得到puc57
‑
pro质粒。puc57
‑
pro和pet22b质粒经ndei/ecori双酶切,将pro 与pet22b连接，构建pet22b
‑
pro。pet22b
‑
pro用ndei/bamhi和ndei/bglii双酶切，目的片段进行凝胶回收后连接，构建pet22b
‑
2pro。pet22b
‑
2pro用ndei/bamhi和ndei/bglii双酶切，目的片段进行凝胶回收后连接，构建pet22b
‑
4pro。pet22b
‑
4pro用ndei/bamhi和 ndei/bglii双酶切，目的片段进行凝胶回收后连接，构建pet22b
‑
8pro。pet22b
‑
cygbm和 pet22b
‑
8pro用ndei/bamhi和ndei/bglii双酶切，目的片段进行凝胶回收后连接，构建 pet22b
‑
cygbm
‑
8pro(构建过程如图2所示)。将质粒pet22b
‑
cygbm
‑
8pro与bl21感受态混合，42℃热激转化，37℃100μl/ml(amp
+
)lb平板培养20小时,挑选单克隆菌落经pcr法和双酶切法筛选，阳性克隆子命名为工程菌bl21
‑
pet22b
‑
cygbm
‑
8pro。
44.其中，pcr反应体系(体系总体积为20μl)：ddh2o 14.4μl、10
×
pcr buffer 2μl、2.5μm引物t7 1μl、2.5μm引物t7 ter 1μl、dntp 1μl、rtaq酶0.3μl、模板0.3μl，且模板为单菌落(即pet22b
‑
cygbm
‑
8pro质粒经42℃热激转化入dh5α感受态中所得的单菌落)。pcr反应程序：94℃预变性4min；94℃变性45s，46℃退火30s，72℃延伸1min30s，循环25次；72℃10min；4℃保存。上述：引物t7：taatacgactcactatagg(seq id no：4)；引物t7 ter：gctagttattgctcagcgg(seq id no：5)。双酶切鉴定体系(体系总体积为10μl)：10
×
hbuffer 1μl；表达载体pet22b
‑
cygb
‑
pro 8.4μl；nde i 0.3μl；xho i0.3μl。酶切条件：37℃水浴4～5h。酶连体系(体系总体积为10μl)：10
×
ligase buffer1μl；pet22b 1μl，cygbm 7μl；t4dna ligase1μl。反应条件:16℃酶连过夜(14h)，用热激转化法把重组质粒转入到e.coli dh5α菌感受态中进行筛选。
45.实施例2鱼精蛋白专用编码基因制备鱼精蛋白
46.利用实施例1构建获得的鱼精蛋白专用编码基因制备鱼精蛋白的方法，其包括如下具体操作：
47.(1)挑取实施例1构建的工程菌bl21
‑
pet22b
‑
cygbm
‑
8pro，于100μl/ml(amp
+
)lb培养基培养16h，以1：100体积比接入乳糖培养基诱导30h，筛选高表达量菌株。高表达量菌株分别在31℃、33℃、35℃、37℃、39℃进行乳糖诱导表达30h，探究温度对蛋白诱导表达影响。高表达量菌株分别以2.5％、5％、7.5％、10％、12.5％的接种量进行乳糖诱导表达30h，探究接种量对蛋白诱导表达影响。
48.(2)挑取(1)筛选出表达量最高菌株于100μl/ml(amp+)lb培养基培养16h，按7.5％接种量接入乳糖诱导培养基中，37℃诱导培养30h，乳糖诱导菌液于4℃，10000rpm离心20min，收集菌体，弃上清，将沉淀储存在
‑
80℃；
49.其中，lb培养基：10g/l tryptone，5g/l yeast extarct，10g/l nacl；乳糖诱导培养基：15g/ltryptone，12g/l yeast extarct，3g/l nah2po4
·
2h2o，7g/l k2hpo4
·
3h2o，2.5g/lnacl， 0.2％葡萄糖，2.1mm乳糖，0.05％mgso4
·
7h2o。
50.(3)将步骤(2)收集到的菌体沉淀并称取菌体沉淀重量，将收集到菌体沉淀经
‑
80℃和4℃反复冻融3、4次，以1：10的比例加入包涵体破菌液，冰中悬浮菌体，冰浴超声，功率200w， 5s超声，5s间歇，30个循环后，冰箱4℃存放20min，再按以上条件超声，如此重复3～4次。 4℃，10000rpm离心20min，弃上清，将沉淀称重，按3倍体积量加入包涵体洗涤液，重悬沉淀，冰中摇动洗涤10min，4℃，10000rpm，离心20min。如此重复3、4次。将最后一次洗涤离心沉淀称重，加入适当包涵体溶解液，重悬沉淀，冰浴平缓摇动1h后4℃冰箱放置过夜以充分溶解。4℃，10000rpm，离心20min，弃沉淀，保留上清，冰箱4℃保存。
51.其中，所述菌体裂解液：1.22g tris
‑
hcl、5.85g nacl、0.075g edta、3.3ml 30％曲拉通 x100，加入150ml超纯水溶解，调ph至8.0，定容至200ml。0.22μm滤膜过滤，4℃保存。包涵体洗涤液：称取3.1g tris
‑
hcl、14.63g nacl、0.186g edta、8.3ml 30％曲拉通x100、60.2g尿素，加入400ml超纯水溶解，调ph至8.0，定容至500ml。0.22μm 滤膜过滤，4℃保存。
包涵体溶解液：称取3.1g tris
‑
hcl、14.63g nacl、0.186g edta、242.5 g尿素，加入400ml超纯水溶解，调ph至8.0，定容至500ml。0.22μm滤膜过滤，现用现配。
52.(4)将溶解液经sephadex g
‑
25初步去杂，所用洗脱液为20mm tris
‑
hcl(ph8.0)(如图3 所示)。接收液再经肝素琼脂糖凝胶层析柱纯化，依次用50mm nacl
‑
20mm tris
‑
hcl(ph8.0)、 0.2m nacl
‑
20mm tris
‑
hcl(ph8.0)、0.5m nacl
‑
20mm tris
‑
hcl(ph8.0)、1m nacl
‑
20mmtris
‑
hcl(ph8.0)、1.5m nacl
‑
20mm tris
‑
hcl(ph8.0)缓冲液依次洗脱(如图4所示)。将含目的蛋白接收液再经cm阳离子琼脂糖凝胶层析柱分离纯化，50mm nacl
‑
20mm tris
‑
hcl (ph8.0)、0.2m nacl
‑
20mm tris
‑
hcl(ph8.0)、0.5m nacl
‑
20mm tris
‑
hcl(ph8.0)、1mnacl
‑
20mm tris
‑
hcl(ph8.0)、1.5m nacl
‑
20mm tris
‑
hcl(ph8.0)缓冲液依次洗脱，将最终含有目的蛋白cygbm
‑
8pro洗脱液经超滤管脱盐(如图5所示)。
53.其中，所述sephadex g
‑
25层析条件为：binding buffer和elution buffer均为20mm tris，ph8.0。所述肝素琼脂糖凝胶层析柱条件为：binding buffer为20mm tris，ph 8.0，elution buffer 50mmnacl，20mm tris，ph8.0；0.2m nacl，20mm tris，ph8.0；0.5m nacl，20mm tris，ph8.0； 1m nacl，20mm tris，ph8.0；1.5m nacl，20mm tris，ph8.0。所述cm阳离子琼脂糖凝胶层析柱条件为：binding buffer为20mm tris，ph8.0，elution buffer为50mm nacl，20mm tris， ph8.0；0.2m nacl，20mm tris，ph8.0；0.5m nacl，20mm tris，ph8.0；1m nacl，20mm tris， ph8.0；1.5m nacl，20mm tris，ph8.0。
54.(5)将步骤(4)所得纯化后的融合蛋白cygbm
‑
8pro进行cnbr裂解，具体地：将纯化后的融合蛋白cygbm
‑
8pro，置于通风橱中，并于通风橱中加入浓度为0.2m的浓盐酸终、终浓度为50mg/ml的cnbr，避光室温裂解24h，之后加入等体积的ddh2o灭活cnbr；然后采用流速为3ml/min的g
‑
25分子筛进行脱盐纯化，即得所述重组鱼精蛋白，且脱盐纯化采用的平衡液和洗脱液均为去离子水。
55.实施例3所得鱼精蛋白的抑菌活性验证
56.实施例2所得鱼精蛋白的抑菌活性，具体方法为：用不同浓度(338μg/ml、169μg/ml、 84.5μg/ml、42.25μg/ml、21.12μg/ml、10.563μg/ml、5.28μg/ml、2.64μg/ml)检测纯化的重组鱼精蛋白溶液对大肠杆菌的抑菌活性(培养温度37℃、转速220rpm)，纯化的重组鱼精蛋白浓度越高，抑菌活性越强，从而证明了重组鱼精蛋白具有抑菌活性(如图6所示)。
57.实施例4所得鱼精蛋白在虾储存的应用
58.实施例2所得鱼精蛋白在虾储存的应用，具体方法为：
59.(1)tvb
‑
n值测定方法：称取经21.12μg/ml重组鱼精蛋白浸润处理、未处理的虾尾5g，用干净剪刀将其剪烂细碎，放入放入盛有50ml三角瓶，加入50ml去离子水，搅匀不时振荡，浸渍30min后过滤，留取滤液冰箱4℃储存备用，储存时间不宜过久。将盛有10ml 2％硼酸溶液的烧杯中加入5
‑
6滴指示液置于冷凝管下端，并将冷凝管下端插入到烧杯吸收液液面以下。吸取样品滤液于蒸馏瓶内，加入5ml 1％氧化镁，迅速加上塞子，密闭封紧，并在冷静管外端包上棉花，加热蒸馏30min停止蒸馏，吸收液用0.0100n盐酸标准溶液滴定，待终点为蓝紫色停止滴定。记录好盐酸标准溶液用量。同时做空白实验，根据盐酸标准溶液的用量计算的挥发性盐基氮的含量。
60.(2)ph值测定方法：称取经21.12μg/ml重组鱼精蛋白浸润处理、未处理的虾尾5g，将其剪碎放入研钵，将样品研成肉泥，加入50ml蒸馏水，充分搅拌后过滤取滤液，ph计测其
ph。
61.(3)每24h测经鱼精蛋白处理、未处理的ph、tvb
‑
n值，一般ph值＞7、tvb
‑
n值＞20mg/100g 不可食用。鱼精蛋白处理样品比未经处理样品在4℃储存时间更长(如图7和8所示)。
62.seq id no.1:5
’‑
aacatatggagaaagtgccaggcgag
‑3’
63.seq id no.2:5
’‑
ggcccagatagcctgcaccgccttcc
‑3’
64.seq id no.3:5
’‑
cggtgcaggctatctgggcccggctc
‑3’
65.seq id no.4:5
’‑
ctccaggggatcttcgatgtgcttgaactggc
‑3’
66.seq id no.5:5
’‑
cacatcgaagatcccctggagatcgagcggagc
‑3’
67.seq id no.6:5
’‑
gagggccccgatgactcggcaggcgtgc
‑3’
68.seq id no.7:5
’‑
gccgagtcatcggggccctcaacac
‑3’
69.seq id no.8:5
’‑
caggatcccggccccgaagagggcagtg
‑3’
70.seq id no.9(cygbm
‑
8pro)：
71.catatggagaaagtgccaggcgagatcgagatcgagcgcagggagcggagcgaggagctgtccgaggcggagaggaaggc ggtgcaggctatctgggcccggctctatgccaactgcgaggacgtgggggtggccatcctggtgaggttctttgtgaact tcccctcggccaagcagtacttcagccagttcaagcacatcgaggatcccctggagatcgagcggagcccccagctgcgg aagcacgcctgccgagtcatcggggccctcaacactgtcgtggagaacctgcatgaccccgacaaggtgtcctctgtgct cgcccttgtggggaaagcccacgccctcaagcacaaggtggaaccggtgtacttcaagatcctctctggggtcattctgg aggtggtcgccgaggaatttgccagtgacttcccacctgagacgcagagagcctgggccaagctgcgtggcctcatctac agccacgtgaccgctgcctacaaggaagtgggctgggtgcagcaggtccccaacgccaccaccccaccggccacactgcc ctcttcggggccgagatccatgcctcgtcgcagacgctcttcatctcgtccggttcgccgaagacgtcgtcctcgtgtca gtcgcagacgtcgtcgtcgcggtggaagacgccgtcgaagatccatgcctcgtcgcagacgctcttcatctcgtccggtt cgccgaagacgtcgtcctcgtgtcagtcgcagacgtcgtcgtcgcggtggaagacgccgtcgaagatccatgcctcgtcg cagacgctcttcatctcgtccggttcgccgaagacgtcgtcctcgtgtcagtcgcagacgtcgtcgtcgcggtggaagac gccgtcgaagatccatgcctcgtcgcagacgctcttcatctcgtccggttcgccgaagacgtcgtcctcgtgtcagtcgc agacgtcgtcgtcgcggtggaagacgccgtcgaagatccatgcctcgtcgcagacgctcttcatctcgtccggttcgccg aagacgtcgtcctcgtgtcagtcgcagacgtcgtcgtcgcggtggaagacgccgtcgaagatcc atgcctcgtcgcagacgctcttcatctcgtccggttcgccgaagacgtcgtcctcgtgtcagtcgcagacgtcgtcgtcg cggtggaagacgccgtcgaagatccatgcctcgtcgcagacgctcttcatctcgtccggttcgccgaagacgtcgtcctc gtgtcagtcgcagacgtcgtcgtcgcggtggaagacgccgtcgaagatccatgcctcgtcgcagacgctcttcatctcgt ccggttcgccgaagacgtcgtcctcgtgtcagtcgcagacgtcgtcgtcgcggtggaagacgccgtcgataagaattc 。