一株产酯香酿酒酵母菌及其应用的制作方法

1.本发明涉及酱油酿造技术领域，特别涉及一株产酯香酿酒酵母菌及其应用。


背景技术：

2.目前，酿造酱油或者豆酱等发酵食品，原料大多数采用脱脂大豆和麦麸，脱脂大豆的蒸煮多采用短时间高温连续蒸煮法，如加压0.5kg/cm2～1kg/cm2蒸煮20min的操作方法，压力越大、时间越长就会使戊糖变化成为易褐变戊糖和水溶性戊糖。蒸煮过程中所生成的易褐变戊糖和水溶性戊糖，将成为发酵过程中褐变反应的原料，脱脂大豆和麦麸中的蛋白质、易褐变戊糖和水溶性戊糖，在蒸煮时发生加热褐变反应，但所生成的色素不溶于酱醪，将变成与色泽无关的物质，因此强调原料处理时产生色素的方法是无益。并且，蒸煮温度过高或者时间过长，虽能增加色泽，但会降低大豆的营养价值和原料利用率，酯香风味不足，进而影响酱油成品的生产成本及营养价值。
3.为了提高发酵食品的色泽，可通过提高制曲温度、减少制醅用水量、提高发酵温度，延长发酵时间、翻搅酱醪以及供氧等工艺措施促进褐变反应的进行。然而，上述工艺措施加速褐变反应进行，不单是色素量上的增加，而且使褐变色素继续缩合生成色调发黑的高分子化合物，亦即向褐变更深程度进行，从感官上讲色调更深，缺乏红色感，甚至带有苦味、酸涩味，同时导致酱油酯香味不足，并且生产工艺控制成本较高。
4.为解决色泽欠佳、酯香风味不足的问题，传统上主要采用自培方式向酱醅中添加酵母菌，取得了一定的使用效果。但是，酵母菌菌种整体上性能良莠不齐、导致色泽及酯香风味改善有限。因此，寻找新的发酵菌株以提升酱油、发酵酱等发酵食品的色泽、酯香风味是十分必要的。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于选育一株酿酒酵母菌，该菌株可显著提高酱油或发酵酱等发酵食品中乙酸乙酯、乙酸异戊酯含量，并改善酱油或发酵酱等发酵食品的酯香风味，并且将该菌株应用在高盐稀态酱油发酵中，获得的酱油呈红褐色且有明显光泽，红色指数稳定，具有浓郁的酯香风味，滋味浓厚、鲜甜适口，从而有效的解决了发酵酱油红褐色泽较浅，光泽度不足、及酯香风味不足的问题。
6.本发明提供一株酿酒酵母菌(saccharomyces cerevisiae)zb434，其保藏编号为：gdmcc no:61362。
7.具体的菌株保藏信息如下：
8.保藏单位名称：广东省微生物菌种保藏中心，
9.保藏地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼，
10.保藏日期：2020年12月22日，
11.保藏编号：gdmcc no:61362。
12.本发明所述的酿酒酵母菌(saccharomyces cerevisiae)zb434是从佛山市海天
(高明)调味食品有限公司酱醪中，经过大量的复壮筛选、分离、纯化、诱变获得的。
13.本发明所述的酿酒酵母菌(saccharomyces cerevisiae)zb434的形态学特征如下：
14.将酿酒酵母菌(saccharomyces cerevisiae)zb434接种在麦芽汁琼脂平板上，在30℃条件下培养2天，菌落呈乳白色，表面平滑，不透明，不反光，边缘整齐，圆形，酿酒酵母菌(saccharomyces cerevisiae)zb434在麦芽汁琼脂平板上的菌落形态见图1。
15.将酿酒酵母菌(saccharomyces cerevisiae)zb434接种在麦芽汁液体培养基中，30℃条件下培养2天，菌体浑浊，无菌璞，不产膜，有酯香，无不良气味。菌体在显微镜下观察见图2，酵母细胞为球形或卵圆形。
16.本发明所述的酿酒酵母菌(saccharomyces cerevisiae)zb434的生理生化实验结果如下：
17.酿酒酵母菌(saccharomyces cerevisiae)zb434菌落重复分离纯化3次以上后分别进行糖类发酵试验、糖类同化试验、氮源同化试验、产酯试验及产酸试验。酿酒酵母菌(saccharomyces cerevisiae)zb434在麦芽糖、葡萄糖、蔗糖、果糖糖类发酵试验呈阳性，在淀粉、蜜二糖糖类发酵试验中呈阴性；酿酒酵母菌(saccharomyces cerevisiae)zb434在麦芽糖、葡萄糖、蔗糖、半乳糖糖类同化试验中呈阳性，在乳糖、淀粉糖类同化试验中呈阴性；酿酒酵母菌(saccharomyces cerevisiae)zb434在硫酸铵氮源同化试验中呈阳性，在硝酸钾氮源同化试验中呈阴性；酿酒酵母菌(saccharomyces cerevisiae)zb433在产酯试验中呈阳性，在产酸试验中呈阴性。
18.本发明所述的酿酒酵母菌(saccharomyces cerevisiae)zb434的优点至少包括以下1)至3)中的一项：
19.1)本发明提供的酿酒酵母菌(saccharomyces cerevisiae)zb434具有能够显著提升酱油或发酵酱等发酵食品中乙酸乙酯、乙酸异戊酯含量，并且能够显著提升酱油或发酵酱等发酵食品的酯香风味。
20.2)本发明的酿酒酵母菌(saccharomyces cerevisiae)zb434可以用于酱油、发酵酱等发酵食品的酿造，使得酿造的酱油、发酵酱等发酵食品呈红褐色且有明显光泽，红色指数稳定，在产品储存过程中，色率和红色指数稳定，延长了货架期。
21.3)本发明的酿酒酵母菌(saccharomyces cerevisiae)zb434应用于高盐稀态酱油大罐发酵工艺时，对乙醇的耐受性高，且该菌株在发酵时能够健壮生长及繁殖，从而提高乙醇发酵速度。提升了发酵产品品质，并进一步显著缩短发酵周期。本方法操作简便，生产工艺易控，达到了降低了生产成本的目的。
22.在某些实施方案中，通过接种所述的酿酒酵母菌(saccharomyces cerevisiae)zb434进行酱油发酵试验，相对于空白对照组，所得酱油产品中乙酸乙酯、乙酸异戊酯含量均有显著的增加，例如乙酸乙酯含量的增长率不少于65％，优选不小于70％，更优选不小于80％，特别优选不小于85％；例如乙酸异戊酯含量的增长率不少于80％，优选不小于90％，更优选不小于100％，特别优选不小于110％。
23.因此，在一方面，本发明提供所述酿酒酵母菌(saccharomyces cerevisiae)zb434，其于2020年12月22日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为gdmcc no:61362，保藏地址为广东省广州市先烈中路100号大院59号楼。
24.在另一方面，本发明提供使用如上所述的酿酒酵母菌(saccharomyces cerevisiae)zb434的发酵方法。
25.在另一方面，本发明还提供一种包含使用如上所述的酿酒酵母菌(saccharomyces cerevisiae)zb434的发酵方法，所述发酵方法包括下述步骤：
26.将所述酿酒酵母菌(saccharomyces cerevisiae)zb434加入至发酵酱醪物中进行发酵，从而引起由所述发酵方法产生的发酵物中乙酸乙酯和乙酸异戊酯含量的协同增加。
27.在某些实施方案中，所述发酵物中：乙酸乙酯含量的增长率不少于65％，优选不小于70％，更优选不小于80％，特别优选不小于85％；乙酸异戊酯含量的增长率不少于80％，优选不小于90％，更优选不小于100％，特别优选不小于110％。
28.在某些实施方案中，所述发酵酱醪物中，氨基酸态氮≥0.8g/100ml，总酸≥1.6g/100ml。本发明实施例所述的总酸是以乳酸总量进行表征的。
29.在某些实施方案中，所述发酵物的红色指数为3.5～4.5。
30.在某些实施方案中，所述发酵酱醪物是采用大豆和小麦粉制备成曲并混合所述成曲和食盐水发酵制备而成。
31.在某些实施方案中，所述大豆可以为脱脂大豆，也可以为未脱脂大豆或者为二者的组合，小麦粉可以是烤制小麦粉，也可以是未烤制小麦粉或者二者的组合。
32.在另一方面，本发明提供通过如上所述的发酵方法获得的发酵物。
33.在某些实施方案中，所述发酵物可以是液态调味剂，也可以是固态调味剂
34.在另一方面，本发明提供如上所述的发酵物在酯香型酱油、发酵酱制品中的用途。
35.在某些实施方案中，所述发酵酱制品为大豆酱、蚕豆酱、豆瓣酱以及豆面酱中的一种或多种。
36.在另一方面，本发明提供一种如上所述的酿酒酵母菌(saccharomyces cerevisiae)zb434在制备酯香型酱油、发酵酱制品中的用途。
37.在某些实施方案中，所述发酵酱制品为大豆酱、蚕豆酱、豆瓣酱以及豆面酱中的一种或多种。
38.在某些实施方案中，所述酯香型酱油的制备的步骤包括：在氨基酸态氮≥0.8g/100ml以及总酸(是以乳酸总量进行表征的)≥1.6g/100ml的酱醪体系接种所述酿酒酵母菌(saccharomyces cerevisiae)zb434进行发酵用于制备酯香型酱油。
39.作为上述方案的进一步优化，其中发酵为高盐稀态发酵。
40.作为上述方案的进一步优化，所述酱醪体系的制备包括如下步骤：用大豆和小麦粉制备成曲，向所述成曲中加入盐水发酵。
41.在某些实施方案中，所述大豆可以为脱脂大豆，也可以为未脱脂大豆或者二者的组合，小麦粉可以是烤制小麦粉，也可以是未烤制小麦粉或者二者的组合。
42.作为上述方案的进一步优化，本技术的发明人经多次试验发现，采用本发明酿酒酵母菌(saccharomyces cerevisiae)zb434发酵制备酱油，可显著提升酱油的酯香风味，并且色泽红亮，鲜甜突出，无明显酸涩味。
43.在某些实施方案中，采用本发明酿酒酵母菌(saccharomyces cerevisiae)zb434发酵制备的酯香型酱油，可显著提高乙酸乙酯和乙酸异戊酯含量。
44.在某些实施方案中，所述发酵酱制品的制备的步骤包括：在氨基酸态氮≥0.8g/
100ml以及总酸(是以乳酸总量进行表征的)≥1.6g/100ml的酱醪体系接种所述酿酒酵母菌(saccharomyces cerevisiae)zb43进行发酵用于制备所述发酵酱制品。
45.在某些实施方案中，发酵为高盐稀态发酵。
46.在某些实施方案中，所述酱醪体系的制备包括如下步骤：用大豆和小麦粉制备成曲，向所述成曲中加入盐水发酵。
47.在某些实施方案中，所述大豆可以为脱脂大豆，也可以为未脱脂大豆或者二者的组合，小麦粉可以是烤制小麦粉，也可以是未烤制小麦粉或者二者的组合。
48.本发明的有益效果包括：
49.本发明通过从酱油发酵酱醪中分离筛选、诱变获得一株不仅能够提高酱油、发酵酱等发酵产品的酯香风味，而且能够提升其鲜甜口感的酿酒酵母菌(saccharomyces cerevisiae)zb434。采用该菌株发酵可提高发酵液中乙酸乙酯、乙酸异戊酯含量，将该菌株应用在高盐稀态酱油发酵中，获得的酱油呈红褐色且有光泽，红色指数稳定，具有浓郁的酯香风味，滋味鲜味、浓厚、鲜甜适口。
附图说明
50.为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
51.图1为酿酒酵母菌(saccharomyces cerevisiae)zb434在麦芽汁琼脂平板上的菌落形态；
52.图2为酿酒酵母菌(saccharomyces cerevisiae)zb434在显微镜下的细胞形态。
53.本发明提供的酿酒酵母，命名为酿酒酵母菌(saccharomyces cerevisiae)zb434，该菌株已于2020年12月22日保藏于广东微生物菌种保藏中心，地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏编号为gdmcc no:61362；该菌株于2020年12月22日由保藏中心收到并登记入册，经保藏中心于2020年12月22日检测为存活菌株。
具体实施方式
54.下面将结合附图和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将理解，下列附图和实施例仅用于说明本发明，而不是对本发明的范围的限定。根据附图和优选实施方案的下列详细描述，本发明的各种目的和有利方面对于本领域技术人员来说将变得显然。
55.现参照下列意在举例说明本发明(而非限定本发明)的实施例来描述本发明。
56.除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本领域常规试剂、方法和设备。
57.除非特别说明，本发明实施例所用培养基和试验条件为本领域常规培养基和试验条件。除非特别说明，本发明实施例所用试剂均为市购。本发明所述的“发酵食品”是指利用有益微生物制取的食品，该食品具有独特的风味。常见的发酵食品主要有谷物发酵制品、豆类发酵制品、乳类发酵制品等。本发明所述的“发酵调味食品”是指利用发酵微生物并采用独特的酿造工艺制作的营养丰富、风味独特、能够增加菜肴的色、香、味，促进食欲的调味食
品。常见的发酵调味食品包括酱油、食醋、酱、豆豉、腐乳等传统发酵调味食品以及具有复合调味作用的新兴发酵调味食品。
58.本发明实施例提供一株酿酒酵母菌(saccharomyces cerevisiae)zb434，所述酿酒酵母菌(saccharomyces cerevisiae)zb434已于2020年12月22日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为gdmcc no:61362，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼。该酿酒酵母菌是从佛山市海天(高明)调味食品有限公司酱醪中，经过大量的复壮筛选、分离、纯化、诱变获得的，遗传稳定性好。
59.实施例1、菌株获得
60.出发菌株的筛选获得，包括以下筛选流程：
61.1、菌株分离
62.取佛山市海天(高明)调味食品有限公司酱油发酵酱醪，以质量比1:9加入无菌水制成悬浊液，然后用无菌生理盐水梯度稀释至10-1
、10-2
、10-3
、10-4
、10-5
、10-6
倍后，取0.1ml稀释液涂布至含盐量10wt％的pda琼脂培养基上，30℃培养48h，挑选单菌落进行进一步划线分离纯化3次后，纯化后的菌株接种在斜面pda琼脂培养基上进行保种。
63.ypd液体培养基：1wt％酵母膏，2wt％蛋白胨，2wt％葡萄糖，和水。
64.ypd固体或斜面培养基中则另外添加2wt％琼脂。
65.2、菌株初筛
66.将上述经分离纯化、培养后的菌株接种至含酱油的筛选培养基中，于30℃、180rpm震荡培养48h，通过测定od600值和进行香气感官鉴评，挑选在含盐培养基能够快速增殖的菌株，且对发酵所得培养液经感官鉴评后风味优良、酯香更加浓郁的菌种为初筛合格菌株。
67.含酱油的筛选培养基：酱油稀释10倍后，添加1.5wt％的葡萄糖、1.5wt％的酵母粉，调节ph为5.0，调节盐浓度至10wt％。
68.表1、菌株od600值的初筛结果
69.[0070][0071]
香气鉴评方法：召集20名有丰富经验的酱油鉴评人员进行感官鉴评，对上述不同菌株的发酵培养液样品进行盲评，主要评价香气可接受度、鉴别酯香气及色泽。
[0072]
表2、发酵培养液的香气鉴评结果
[0073]
菌株编号是否有酯香香气是否愉悦cx20fj214是否cx20fj228否否cx20fj233是是cx20fj245是否cx20fj247否是cx20fj254是是cx20fj258是是cx20fj263是否cx20fj268是是cx20fj271否是cx20fj273是否cx20fj281否是
[0074]
根据上表，挑选具有较高od600值，并且发酵培养液香气浓郁，具有令人愉悦的酱香气的菌株备用。
[0075]
3、菌株复筛
[0076]
将上述菌株cx20fj233、cx20fj254、cx20fj258和cx20fj268，共4株菌株的单菌落接种于pda液体培养基中，30℃、180rpm震荡培养48h，得到上述菌株的种子培养液。
[0077]
将种子培养液按0.1wt％的添加量分别接种至酱醪发酵液体培养基中进行发酵，30℃、180rpm振荡发酵培养7d，发酵结束后，过滤取澄清酱油原液进行色泽感官鉴评及指标检测。
[0078]
酱醪发酵液体培养基：取发酵酱油酱醪，其中氨基酸态氮≥0.8g/100ml，总酸≥1.6g/100ml，盐度：15wt％，过滤取上清液即为酱醪发酵液体培养基。
[0079]
上述各发酵酱油原油组色泽如下：(1)cx20fj233组：原油呈红褐色；(2)cx20fj254组：原油呈红褐色且有光泽；(3)cx20fj258组：原油呈红褐色且有光泽；(4)cx20fj268组：原油呈浅红褐色。
[0080]
采用spme-gc-ms检测上述酱油原液中的香气物质，检测参数如下：
[0081]
spme条件：car/pdms萃取头；萃取温度：35℃；取样量：5g；平衡时间：10min；萃取时间：30min；脱附时间：20min；gc条件：进样口温度：250℃，不分流进样；色谱柱：vf-wax 60m
×
0.25mm
×
50μm；升温程序如下表：
[0082]
表3、spme-gc-ms检测参数
[0083]
升温速度/(℃/min)终温/℃保持时间/min0408514003022030
[0084]
检测器：ms，离子源温度：250℃；四级杆温度：150℃。
[0085]
表4、香气成分结果(半定量检测，以对照例香气物质峰面积为100％计)
[0086][0087][0088]
备注：以不接种种子培养液发酵作为空白组，空白组乙醇指标为100％，其他接种初筛菌株种子培养液发酵，乙醇指标换算成相应比值。
[0089]
从上表的结果可以看出，优选色泽较好、产乙醇含量最高的菌株cx20fj258进行后续试验。
[0090]
优选出的风味最好的菌株为目标菌株，命名为cx20fj258，将其保藏。保藏信息如下：本发明实施例提供一株酿酒酵母菌(saccharomyces cerevisiae)zb434，所述酿酒酵母菌(saccharomyces cerevisiae)zb434已于2020年12月22日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为gdmcc no:61362，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼。
[0091]
4、菌株鉴定
[0092]
根据细胞形态、生理生化特征和18s its rdna测序等实验数据综合分析，cx20fj258菌株被鉴定为saccharomyces cerevisiae，该菌株的生理生化实验结果如下表所示。
[0093]
表5、生理生化试验结果
[0094][0095][0096]
注：糖类发酵试验中“+”指无氧时可将糖转化分解为乙醇和二氧化碳，
“‑”
指无氧时不能将糖转化为乙醇和二氧化碳；
[0097]
糖类同化试验“+”指有氧时将糖转化分解，获取能量供菌体生长，
“‑”
指有氧时不能将糖转化分解，不能获取能量供菌体生长；
[0098]
氮源同化试验“+”指有氧时将氮源转化分解，获取能量供菌体生长，
“‑”
指有氧时不能将氮源转化分解，不能获取能量供菌体生长；
[0099]
产酯试验“+”指发酵过程可产酯，
“‑”
发酵过程不产酯；
[0100]
产酸试验“+”指发酵过程可产酸，
“‑”
发酵过程不产酸。
[0101]
将菌株cx20fj258送上海生工生物工程有限公司测序鉴定，cx20fj258菌株的18s its rdna序列如下seq id no.1所示：
[0102]
ctgtctagttaagcaatttatacagtgaaactgcgaatggctcattaaatcagttatcgtttatttgatagttcctttactacatggtataactgtggtaattctagagctaatacatgcttaaaatctcgaccctttggaagagatgtatttattagataaaaaatcaatgtcttcggactctttgatgattcataataacttttcgaatcgcatggccttgtgctggcgatggttcattcaaatttctgccctatcaactttcgatggtaggatagtggcctaccatggtttcaacgggtaacggggaataagggttcgattccggagagggagcctgagaaacggctaccacatccaaggaaggcagcaggcgcgcaaattacccaatcctaattcagggaggtagtgacaataaataacgatacagggcccattcgggtcttgtaattggaatgagtacaatgtaaataccttaacgaggaacaattggagggcaagtctggtgccagcagccgcggtaattccagctccaatagcgtatattaaagttgttgcagttaaaaagctcgtagttgaactttgggcccggttggccggtccgattttttcgtgtactggatttccaacggggcctttccttctggctaaccttgagtccttgtggctcttggcgaaccaggacttttactttgaaaaaattagagtgttcaaagcaggcgtattgctcgaatatattagcatggaataatagaataggacgtttggttctattttgttggtttctaggaccatcgtaatgattaatagggacggtcgggggcatcagtattcaattgtcagaggtgaaattcttggatttattgaagactaactactgcgaaagcatttgccaaggacgttttcattaatcaagaacgaaagttaggggatcgaagatgatcagataccgtcgtagtcttaaccataaactatgccgactagggatcgggtggtgtttttttaatgacccactcggcaccttacgagaaatcaaagtctttgggttctggggggagtatggtcgcaaggctgaaacttaaaggaattgacggaagggcaccaccaggagtggagcctgcggcttaatttgactcaacacggggaaactcaccaggtccagacacaataaggattgacagattgagagctctttcttgattttgtgggtggtggtgcatggccgttcttagttggtggagtgatttgtctgcttaattgcgataacgaacgagaccttaacctactaaatagtggtgctagcatttgctggttatccacttcttagagggactatcggtttcaagccgatggaagtttgaggcaataacaggtctgt
gatgcccttagacgttctgggccgcacgcgcgctacactgacggagccagcgagtctaaccttggccgagaggtcttggtaatcttgtgaaactccgtcgtgctggggatagagcattgtaattattgctcttcaacgaggaattcctagtaagcgcaagtcatcagcttgcgttgattacgtccctgccctttgtacacaccgcccgtcgctagtaccgattgaatggcttagtgaggcctcaggatctgcttagagaagggggcaactccatctcagagcggagaa
[0103]
5、菌株诱变
[0104]
将上述鉴定的saccharomyces cerevisiae菌株进行artp(atmospheric and room temperature plasma，常压室温等离子体)诱变。
[0105]
具体的，本发明菌株的诱变方法如下：
[0106]
artp诱变育种仪：artp-iiis型，购自无锡源清天木生物科技有限公司。
[0107]
将菌株接种至ypd液体培养基中，于30℃、180rpm震荡培养48h获得含saccharomyces cerevisiae鉴定菌株的培养液。
[0108]
取10μl的培养液，均匀涂至artp载片上进行诱变，设定功率120w，气量10slm，作用时间选择10s、20s、30s、40s、60s、80s。
[0109]
诱变完毕后，每个诱变载片转移至含有10ml麦芽汁培养基的ep管中，涡旋洗脱2min。
[0110]
取100μl洗脱液涂布至含盐量15wt％麦芽汁琼脂培养基平板，于28℃～30℃培养箱中培养24小时。
[0111]
挑选获得的单菌落接种至含酱油的筛选培养基，30℃培养48小时。
[0112]
从而根据od600值和香气感官，挑选出比出发菌株相比，生长较快且酯香更浓郁、整体风味更愉悦的6株菌株。
[0113]
将上述初筛选出的6株酵母株菌依次转接斜面活化后，进行三角瓶扩大培养，保持28℃恒温，180rpm培养48小时，获得菌悬液，然后以1％体积比接种量接种于含酱油的发酵培养基中继续进行发酵小试，28℃～33℃条件下静置发酵72h后停止发酵。
[0114]
采用spme-gc-ms分析测定其发酵液中乙酸乙酯和乙酸异戊酯的含量，检测结果如下表所示。
[0115]
表6、香气成分结果(半定量检测，以对照例香气物质峰面积为100％计)
[0116]
项目乙酸乙酯乙酸异戊酯cas number141-78-6123-92-2cx20fj258100％100％cx20yb218124.1％127.4％cx20yb227112.5％136.4％cx20yb235157.4％162.4％cx20yb239134.5％129.7％cx20yb242142.5％124.7％cx20yb257131.4％135.4％
[0117]
备注：以接种cx20fj258(对照菌株)发酵各项指标为100％，其他诱变菌株发酵指标换算成相应比值。
[0118]
从上表的结果可以看出，优选乙酸乙酯和乙酸异戊酯指标最高的菌株cx20yb235进行后续试验，并将其按广东海天创新技术有限公司菌种库命名规则命名为酿酒酵母菌株
zb434。
[0119]
6、耐乙醇性能试验
[0120]
挑取酿酒酵母菌株(saccharomyces cerevisiae)zb434单菌落接种于pda液体培养基中，30℃、180rpm震荡培养48h，得到酿酒酵母菌(saccharomyces cerevisiae)zb434种子培养液。调节发酵培养基乙醇体积浓度为0％、4％、8％、12％，接种2％体积比的酵母菌(saccharomyces cerevisiae)zb434种子培养液，每个梯度做3个平行，在30℃条件下静置发酵72h后停止发酵，测定od600值并采用spme-gc-ms分析测定发酵液中乙酸乙酯和乙酸异戊酯的含量，根据其含量高低来判断菌株的生长情况。菌株耐乙醇性能结果如下表所示。
[0121]
表7、菌株耐乙醇性能结果
[0122][0123][0124]
备注：以0％乙醇浓度下，接种酿酒酵母菌(saccharomyces cerevisiae)zb434发酵香气成份各项指标为100％，乙醇浓度为4％、8％、12％下，接种酿酒酵母菌(saccharomyces cerevisiae)zb434发酵香气成份换算成相应比值。
[0125]
从上表的结果可以看出，当乙醇浓度在0％～12％时，酿酒酵母菌(saccharomyces cerevisiae)zb434皆能够正常生长，当酒精浓度大于8％后，酵母菌株的生长稍受限制，但不影响乙酸乙酯和乙酸异戊酯的生成。由此表明，本发明提供的酿酒酵母菌(saccharomyces cerevisiae)zb434具有较好的耐乙醇性能。
[0126]
7、菌株保藏
[0127]
该酿酒酵母菌(saccharomyces cerevisiae)zb434已于2020年12月22日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，命名为酿酒酵母菌(saccharomyces cerevisiae)zb434，保藏编号为gdmcc no:61362，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼。
[0128]
酿酒酵母菌菌株cx20yb235与酿酒酵母菌(saccharomyces cerevisiae)zb434指同一菌株。
[0129]
本发明提供的酿酒酵母菌(saccharomyces cerevisiae)zb434具有以下特征：
[0130]
酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)zb434在麦芽汁琼脂平板上，在30℃条件下培养2天，菌落呈乳白色，表面平滑，不透明，不反光，边缘整齐，圆形，菌落直径3mm～5mm。请参见图1。
[0131]
酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)zb434在麦芽汁液体培养基中，30℃条件下培养2天，菌体浑浊，无菌璞，不产膜，有酯香，无不良气味。菌体在显微镜下观察，酵母细胞为球形或卵圆形。请参见图2。
[0132]
根据细胞形态、生理生化特征和18s its rdna测序等实验数据综合分析，该菌株被鉴定为saccharomyces cerevisiae，该菌株的生理生化实验结果如下表所示：
[0133]
表8、生理生化试验结果
[0134][0135]
注：糖类发酵试验中，“+”指无氧时可将糖转化分解为乙醇和二氧化碳，
“‑”
指无氧时不能将糖转化为乙醇和二氧化碳；
[0136]
糖类同化试验中，“+”指有氧时将糖转化分解，获取能量供菌体生长，
“‑”
指有氧时不能将糖转化分解，不能获取能量供菌体生长；
[0137]
氮源同化试验中，“+”指有氧时将氮源转化分解，获取能量供菌体生长，
“‑”
指有氧时不能将氮源转化分解，不能获取能量供菌体生长；
[0138]
产酯试验中，“+”指发酵过程可产酯，
“‑”
发酵过程不产酯；
[0139]
产酸试验中，“+”指发酵过程可产酸，
“‑”
发酵过程不产酸。
[0140]
酿酒酵母菌(saccharomyces cerevisiae)zb434的18s its rdna序列如下seq id no.2所示：
[0141]
ctgtctagttaagcaatttatacagtgaaactgcgaatggctcattaaatcagttatcgtttatttgatagttcctttactacatggtataactgtggtaattctagagctaatacatgcttaaaatctcgaccctttggaagagatgtatttattagataaaaaatcaatgtcttcggactctttgatgattcataataacttttcgaatcgcatggccttgtgctggcgatggttcattcaaatttctgccctatcaactttcgatggtaggatagtggcctaccatggtttcaacgggtaacggggaataagggttcgattccggagagggagcctgagaaacggctaccacatccaaggaaggcagcaggcgcgcaaattacccaatcctaattcagggaggtagtgacaataaataacgatacagggcccattcgggtcttgtaattggaatgagtacaatgtaaataccttaacgaggaacaattggagggcaagtctggtgccagcagccgcggtaattccagctccaatagcgtatattaaagttgttgcagttaaaaagctcgtagttgaactttgggcccggttggccggtccgattttttcgtgtactggatttccaacggggcctttccttctggctaaccttgagtccttgtggctcttggcgaaccaggacttttactttgaaaaaattagagtgttcaaagcaggcgtattgctcgaatatattagcatggaataatagaataggacgtttggttctattttgttggtttctaggaccatcgtaatgattaatagggacggtcgggggcatcagtattcaattgtcagaggtgaaattcttggatttattgaagactaactactgcgaaagcatttgccaaggacgttttcattaatcaagaacgaaagttaggggatcgaagatgatcagataccgtcgtagtcttaaccataaactatgccgactagggatcgggtggtgtttttttaatgacccactcggcaccttacgagaaatcaaagtctttgggttctggggggagtatggtcgcaaggctgaaacttaaaggaattgacggaagggcaccaccaggagtggagcctgcggcttaatttgactcaacacggggaaactcaccaggtccagacacaataaggattgacagattgagagctctttcttgattttgtgggtggtggtgcatggccgttcttagttggtggagtgatttgtctgcttaattgcgataacgaacgagaccttaacctactaaatagtggtgctagcatttgctggttatccacttcttagagggactatcggtttcaagccgatggaagtttgaggcaataacaggtctgtgatgcccttagacgttctgggccgcacgcgcgctacactgacggagccagcgagtctaaccttggccgagaggtcttggtaatcttgtgaaactccgtcgtgctggggatagagcattgtaattattgctcttcaacgaggaattcctagtaagcgcaagtcatcagcttgcgttgattacgtccctgccctttgtacacaccgcccgtcgctagtaccgattgaatggcttagtgaggcctcaggatctgcttagagaagggggcaactccatctcagagcggagaa
[0142]
8、遗传稳定性
[0143]
将上述诱变筛选出的酿酒酵母菌(saccharomyces cerevisiae)zb434接种于ypd斜面培养基连续传代10代，观察各代菌株的生长情况，并将第1代、第5代和第10代斜面菌种按按上述发酵小试培养方法对菌种进行发酵培养，发酵结束后测定其发酵液中乙酸乙酯和乙酸异戊酯的含量，判断其遗传稳定性，若十代测定乙酸乙酯和乙酸异戊酯的含量误差在10％误差范围内，则表明菌株遗传稳定性良好，具体数据见下表。
[0144]
表9、传代稳定性检测结果
[0145]
传代数乙酸乙酯乙酸异戊酯出发菌株100％100％zb434第1代103.6％102.4％zb434第5代98.6％104.5％zb434第10代102.5％97.3％
[0146]
备注：以出发酿酒酵母菌(saccharomyces cerevisiae)zb434发酵各项指标为100％，传代第1代、第5代、第10代发酵指标换算成相应比值。
[0147]
如上表的结果所示，从发酵液中乙酸乙酯和乙酸异戊酯的检测结果来看，酿酒酵母菌(saccharomyces cerevisiae)zb434的遗传稳定性好。
[0148]
实施例2、在酱油发酵中的应用
[0149]
采用含18wt％氯化钠的pda液体培养基培养本发明实施例所述的酿酒酵母菌(saccharomyces cerevisiae)zb434，30℃、180rpm震荡培养48h，得到菌体活性高，菌体密度大的种子培养液。
[0150]
将原料大豆和小麦粉通过圆盘制曲获得成曲，然后向曲料加入1.8倍重量、浓度为18wt％盐水进行发酵，当发酵体系中氨基酸态氮≥0.8g/100ml、总酸(以乳酸计)≥1.6g/100ml接种种子培养液发酵7d～10d，发酵管理按照常规方法进行。
[0151]
发酵完成后，检测酱油常规理化指标，采用spme-gc-ms分析测定其发酵液中乙酸乙酯和乙酸异戊酯的含量，并对酱油的风味进行鉴评，结果如下表所示。
[0152]
对照组即为按照现有常规的高盐稀态大罐发酵工艺进行发酵制取酱油。
[0153]
表10、发酵酱油理化指标测试结果
[0154]
组别总酸氨基酸态氮乙酸乙酯乙酸异戊酯对照组(不接种酿酒酵母菌zb434)100％100％100％100％接种酿酒酵母菌cx20fj258100.5％99.4％110.3％160.1％接种酿酒酵母菌zb434组106.8％101.6％185.7％213.6％
[0155]
备注：对照组发酵酱油各项待测物质浓度为100％，接种本发明实施例菌株发酵酱油指标换算成相应比值。
[0156]
表11、酱油货架期内色率测定
[0157]
[0158][0159]
表12、酱油货架期内红色指数测定
[0160]
库存时间0个月3个月6个月12个月18个月对照组(不接种酿酒酵母菌zb434)3.363.313.233.193.12接种酿酒酵母菌cx20fj2583.413.463.253.203.16接种酿酒酵母菌zb434组3.523.513.543.573.53
[0161]
酱油色率和红色指数的测定方法为：将酱油用超纯水稀释100倍后，分别测定510nm和610nm下的吸光值od510和od610，色率＝od610
×
2000/0.076，红色指数＝od510/od610
[0162]
本实施例还召集20名有丰富经验的鉴评人员进行感官鉴评。感官鉴评的评价指标包括酯香、综合香气、色泽(红亮)和综合感官，分值为0分～5分打分，分数越高，该项指标越好，满分5分。感官鉴评结果见表13。
[0163]
表13、发酵酱油感官鉴评测试结果
[0164][0165]
上述结果表明，酿酒酵母菌(saccharomyces cerevisiae)zb434应用于酱油发酵，可显著提高乙酸乙酯和乙酸异戊酯含量，降低酱油色率并提升红色指数，且在酱油货架期内红色指标保持稳定。通过感官鉴评结果可知，接种酿酒酵母菌(saccharomyces cerevisiae)zb434发酵获得的酱油，香气丰富，酯香浓郁，色泽红亮，鲜甜突出，无明显酸涩味，综合感官显著提升。
[0166]
实施例3、在黄豆酱酿造中的应用
[0167]
采用大豆和小麦粉为原料，按常规方法进行黄豆酱制曲，成曲分别加入1.8倍重量浓度为18wt％的盐水，混匀后进行发酵，当发酵体系中氨基酸态氮≥0.8g/100ml、总酸(以乳酸计)≥1.6g/100ml接种种子培养液发酵7d～10d，发酵管理按照常规方法进行。
[0168]
发酵完成后，检测黄豆酱常规理化指标，采用spme-gc-ms测定乙酸乙酯和乙酸异戊酯含量，并对黄豆酱的风味进行鉴评，结果如下表所示。
[0169]
对照组即为按照现有常规的发酵工艺发酵获得黄豆酱。
[0170]
表14、黄豆酱理化指标测试结果
[0171]
组别总酸氨基酸态氮乙酸乙酯乙酸异戊酯对照组(不接种酿酒酵母菌zb434)100％100％100％100％接种酿酒酵母菌cx20fj258组98.71％101.3％150.5％107.7％接种酿酒酵母菌zb434组102.0％104.3％210.2％186.4％
[0172]
备注：对照组发酵黄豆酱各项指标为100％，接种本发明菌株发酵黄豆酱指标换算成相应比值。
[0173]
表15、黄豆酱感官鉴评测试结果(0分～5分打分，满分5分)
[0174][0175][0176]
上述结果表明，酿酒酵母菌(saccharomyces cerevisiae)zb434应用于黄豆酱发酵，可显著提高乙酸乙酯和乙酸异戊酯含量。通过感官鉴评结果可知，接种酿酒酵母菌(saccharomyces cerevisiae)zb434发酵获得的黄豆酱，香气丰富，酯香浓郁，色泽红褐有光泽，口感鲜味浓厚，综合感官显著提升。
[0177]
由以上实施例可知，本发明实施例提供的酿酒酵母菌(saccharomyces cerevisiae)zb434具备如下优点：(1)本发明提供的酿酒酵母菌(saccharomyces cerevisiae)zb434具有能够显著提升酱油或发酵酱类产品中乙酸乙酯、乙酸异戊酯含量，并且能够显著提升酱油或发酵酱的酯香风味。(2)本发明的酿酒酵母菌(saccharomyces cerevisiae)zb434可以用于酱油、发酵酱等酱香发酵食品的酿造，使得酿造的酱油、酱类产品呈红褐色且有明显光泽，红色指数稳定，在产品储存过程中，色率和红色指数稳定，延长了货架期。(3)本发明的酿酒酵母菌应用于高盐稀态酱油大罐发酵工艺时，对乙醇的耐受性高，且该菌株在发酵时能够健壮生长及繁殖，从而提高乙醇发酵速度。提升了发酵产品品质，并进一步显著缩短发酵周期。本方法操作简便，生产工艺易控，达到了降低了生产成本的目的。
[0178]
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
[0179]
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。