一种羟基积雪草苷的发酵转化的方法与应用与流程

1.本发明属于发酵领域，涉及积雪草发酵，尤其涉及一种利用微生物转化反应转化富含羟基积雪苷的制备方法，以及羟基积雪草苷发酵液的应用。


背景技术：

2.积雪草是积雪草(拉丁学名：centellaasiatica(l.)urban)，又称雷公根、铜钱草、马蹄草，为伞形科植物积雪草的全草。积雪草原产于印度，现广泛分布于世界热带、亚热带区，在我国主要分布于长江以南各省。积雪草全草的主要活性成分有积雪草苷、羟基积雪草苷、积雪草酸和羟基积雪草酸。积雪草长久以来被作为健脑药、利尿药和麻风病、溃疡的辅助药以及皮肤病用药。
3.天然药物积雪草具有强烈的促进伤口愈合和皮肤修复的功效作用，它能使皮肤瘢痕成纤维细胞增殖抑制减少细胞外基质合成，刺激纤维母细胞增生，良好的诱导细胞凋零阻断剂，降低氧自由基浓度，明显抗菌减少炎症，促进疤痕表皮再生修复，淡化色素(促进黑素细胞凋亡，抑制黑素合成)、促进细胞再生，恢复皮肤弹性与光泽。
4.积雪草的化学成分复杂，主要有三萜类、黄酮类、挥发油类、多炔烯类等。目前认为，积雪草的主要活性成分为积雪草总苷，积雪草总苷是一种混合物，主要由三萜烷酸形成的糖苷组成，包括积雪草苷
‑
b、羟基积雪草苷和积雪草苷，它们都具有五环三萜结构和糖苷支链，仅在三萜环上的羟基数目和位置存在着差异。积雪草中起效的功效为积雪草苷和羟基积雪苷含量，研究表明，羟基积雪草苷所发挥的功效显著强于积雪草苷。
5.cn101724006a公开了一种分离积雪草苷
‑
b、羟基积雪草苷和积雪草苷的方法，包括：将原料溶于甲醇水溶液后通入模拟移动床色谱系统，用甲醇水溶液洗脱得到积雪草苷，提余液蒸除溶剂后得到一次固体料；将一次固体料溶于含乙腈和甲基叔丁基醚的水溶液或通入模拟移动床色谱系统，用含乙腈和甲基叔丁基醚的水溶液洗脱得到羟基积雪草苷，提余液蒸除溶剂后得到二次固体料；将二次固体料溶于甲醇水溶液后通入模拟移动床色谱系统，用甲醇水溶液洗脱得到积雪草苷
‑
b。然而，该方法从含积雪草总苷的原料出发，采用模拟移动床色谱系统，其操作复杂，对设备要求高，且使用甲基叔丁基醚，具有一定的毒性和危险性，在储存和使用过程中都需要充分重视。
6.cn102477063公开了制备型高效液相色谱仪分离积雪草提取物中的积雪草苷b与羟基积雪草苷的方法，在流动相内添加环糊精，再用有机溶剂萃取去除溶剂中的环糊精得到纯品，该方法操作复杂，添加β
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环糊精的溶剂容易造成色谱柱堵塞，降低色谱柱的使用寿命，成本高，不易工业化生产。cn102532244a公开了制备高纯度积雪草苷的方法，通过萃取、脱色、重结晶的方法得到积雪草苷纯品，但工艺中采用多种有机溶剂对积雪草提取物浸膏进行萃取，有机溶剂用量多，容易造成二次污染。cn101948501a公开了一种羟基积雪草苷的制备方法，提取液经大孔树脂柱层、活性炭脱色、析晶、大孔树脂再层析，最后得到98％以上纯度羟基积雪草苷，该工艺周期长，工艺复杂，成本高。
7.以上几种方法均是通过提取的方法来制得羟基积雪草苷，周期长，工艺复杂，成本
高。
8.由于积雪草中各成分性质的复杂性和特殊性，尤其是积雪草总苷中积雪草苷、羟基积雪草苷和积雪草苷b的结构及理化性质都较为接近，其中羟基积雪草苷和积雪草苷b是一对同分异构体，它们和积雪草苷相比只多了一个羟基，而强极性糖元的连接又大大地弱化了这种微小极性的差异，使得很难用常规的分离方法将这三种物质完全分离。现有技术要么多数是从积雪草总苷出发制备上述三种化合物，要么是从积雪草出发制备分离其中的一种或两种化合物。而使用微生物发酵积雪草，通过其生物转化得到羟基积雪草苷目前未见有报道。


技术实现要素：

9.本发明一方面是为了提供一种羟基积雪草苷发酵转化的制备方法，通过含嗜热菌的微生物发酵生产富含羟基积雪草苷的积雪草发酵液，转化高含量的羟基积雪苷，或者利用含嗜热菌的微生物发酵积雪草提取物或积雪草苷得到富含羟基积雪草苷的积雪草发酵液，积雪草苷经羟基转化后，其极性提高，从而提高积雪草苷类成分的利用率。同时，对比药材直接提取等方法，本工艺制得的羟基积雪苷转化后得率更高，是同浓度的水提取液的200
‑
8000倍，并且大幅增加羟基积雪草苷的含量。
10.本发明另一方面是为了提供该富含羟基积雪草苷的积雪草发酵液，通过嗜热菌或嗜热菌与其它菌种组成的多菌组合物对积雪草进行发酵，提高积雪草的利用率，提高临床功效。
11.本发明第三方面是为了提供该富含羟基积雪草苷的积雪草发酵液的应用，其在化妆品领域的应用，抗氧化、美白、皮肤细胞修复能力(光损伤修复、划痕修复)得到了显著的提升(相比与纯嗜热栖热菌发酵液)。
12.为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
13.一种羟基积雪草苷的发酵转化方法，所述制备方法包括：以积雪草或积雪草粗提物或积雪草苷或两者以上的组合物为原料，通过微生物发酵制得富含羟基积雪草苷的发酵液；
14.或者，以积雪草发酵液或积雪草粗提物或积雪草苷或两者以上的组合物为原料通过微生物二次发酵制得富含羟基积雪草苷的发酵液；
15.将富含羟基积雪草苷的发酵液经后处理得到羟基积雪草苷纯品；
16.其中，所述的微生物包括嗜热菌或者嗜热菌与非嗜热菌组成的多菌组合物。
17.在本发明中，经含嗜热菌的微生物发酵后，积雪草或积雪草粗提物或积雪草苷或者其组合物转化生成了羟基积雪草苷，其中羟基积雪草苷含量是同浓度的积雪草水提取液的200
‑
8000倍。
18.作为本发明的一种优选方案，所述嗜热菌包括嗜热栖热菌，嗜热链球菌，嗜热芽胞杆菌，海栖热袍菌中的一种。
19.作为本发明的一种优选方案，所述非嗜热菌包括乳酸菌、双歧杆菌、米曲霉或酵母中的一种或多种。
20.作为本发明的一种优选方案，所述嗜热菌为嗜热栖热菌。
21.作为本发明的一种优选方案，所述积雪草的添加量为0.001
‑
2000g/l，所述积雪草
粗提取物的添加量为0.001
‑
2000g/l；所述积雪草发酵液的添加量为0.1
‑
99.9％。
22.作为本发明的一种优选方案，所述微生物为嗜热菌时，发酵温度60
‑
80℃，时间2
‑
80h。
23.作为本发明的一种优选方案，所述微生物为多菌组合物时，发酵温度25
‑
80℃，发酵时间2
‑
80h。
24.作为本发明的一种优选方案，所述多菌组合物中，嗜热菌占2％
‑
99.9％。
25.一种富含羟基积雪草苷的积雪草发酵液的应用，上述的发酵转化方法得到的羟基积雪草苷或者富含羟基积雪草苷的发酵液在化妆品领域的应用。
26.作为优选，通过微生物转化得到羟基积雪草苷的得率为药材直接提取的得率的200倍以上。
27.本发明具有以下有益效果：
28.1)积雪草经含嗜热菌的微生物发酵后，转化生成了羟基积雪草苷，羟基积雪草苷的含量是同浓度的积雪草水提取液的200
‑
8000倍。
29.2)利用积雪草发酵后，比纯嗜热栖热菌发酵液蛋白质提升19倍、氨基酸提升12倍，总多糖提升108倍，总黄酮提升145倍，水溶性固含物提升8倍，比同浓度的积雪草水提取液蛋白质提升6倍，总多糖提升6倍，总黄酮提升11倍，总多酚提升6倍，总氨基酸提升42倍，水溶性固含物提升10倍。
30.3)积雪草发酵后的功效【抗氧化、美白、皮肤细胞修复能力(光损伤修复、划痕修复)】也显著提升。
附图说明
31.图1是积雪草发酵液与纯嗜热栖热菌发酵液成分对比增长率示意图。
32.图2是积雪草发酵液与积雪草水提取浓缩液成分对比增长率示意图。
33.图3是羟基积雪草酸与积雪草酸标准品的hplc图。
34.图4是积雪草酸转化物中积雪草水提取浓缩液的hplc图。
35.图5是积雪草酸转化物中积雪草发酵液的hplc图。
36.图6是羟基积雪草苷、积雪草苷标准品的hplc图。
37.图7是积雪草苷类转化物中积雪草水提取浓缩液的hplc图。
38.图8是积雪草苷类转化物中积雪草发酵液的hplc图。
39.图9是抗氧化能力(清除dpph)对比图。
40.图10是对b16细胞中酪氨酸酶的活性的示意图。
41.图11是不同浓度的积雪草
‑
嗜热栖热菌发酵液对hacat细胞的光损伤修复能力的示意图。
具体实施方式
42.下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
43.本发明中所用的试剂均可从市场购得，所用的设备亦均可从市场购得。
44.本发明提供了一种羟基积雪草苷的发酵转化方法，所述制备方法包括：以积雪草或积雪草粗提物或积雪草苷或其两者以上的组合物为原料，通过微生物发酵制得富含羟基积雪草苷的积雪草发酵液；
45.或者，以积雪草发酵液或积雪草粗提物或积雪草苷为原料通过微生物二次发酵制得富含羟基积雪草苷的积雪草发酵液；
46.将富含羟基积雪草苷的发酵液经后处理得到羟基积雪草苷纯品；
47.其中，所述的微生物包括嗜热菌或者嗜热菌与非嗜热菌组成的多菌组合物。
48.优选地，所述嗜热菌包括嗜热栖热菌，嗜热链球菌，嗜热芽胞杆菌，海栖热袍菌中的一种。
49.最优选地，嗜热菌为嗜热栖热菌。
50.优选地，所述非嗜热菌包括乳酸菌、双歧杆菌、米曲霉或酵母中的一种或多种。
51.后处理包括分离纯化、结晶等常规工艺。
52.当微生物为嗜热菌时，发酵温度60
‑
80℃，时间2
‑
80h。
53.当微生物为多菌组合物时，发酵温度25
‑
80℃，发酵时间2
‑
80h。
54.多菌组合物可以是嗜热栖热菌与乳酸菌的双菌组合物，嗜热栖热菌与双歧杆菌的双菌组合物，嗜热栖热菌与米曲霉的双菌组合物，嗜热栖热菌与酵母菌的双菌组合物，也可以是嗜热栖热菌与乳酸菌+双歧杆菌的多菌组合物，嗜热栖热菌与乳酸菌+米曲霉的多菌组合物，嗜热栖热菌与乳酸菌+酵母菌的多菌组合物，嗜热栖热菌与双歧杆菌+米曲霉的多菌组合物，嗜热栖热菌与双歧杆菌+酵母菌的多菌组合物，嗜热栖热菌与米曲霉+酵母菌的多菌组合物，嗜热栖热菌与双歧杆菌+米曲霉+酵母菌的多菌组合物，嗜热栖热菌与乳酸菌+米曲霉+酵母菌的多菌组合物，嗜热栖热菌与乳酸菌+双歧杆菌+米曲霉的多菌组合物，嗜热栖热菌与乳酸菌+双歧杆菌+酵母菌的多菌组合物，嗜热栖热菌与乳酸菌+双歧杆菌+米曲霉+酵母菌的多菌组合物。
55.在多菌组合物中，嗜热栖热菌也可以是嗜热链球菌，嗜热芽胞杆菌，海栖热袍菌。
56.实施例1
57.将积雪草加入至嗜热栖热菌培养基中，按嗜热栖热菌的发酵工艺(60℃，48h)培养发酵，积雪草分别选取5g/l、50g/l两个添加浓度，并与同浓度的积雪草水提取液(60℃，48h)，以及同浓度的积雪草水提取液的浓缩液(浓缩成药材：浓缩液比例为2：1，即2g药材得浓缩液1g)及未添加积雪草的纯嗜热栖热菌发酵液进行分析对比，结果见表1与图1、图2：(一)各类成分对比数据
58.表1积雪草发酵液与纯嗜热栖热菌发酵液、积雪草水提取液、同浓度积雪草水提取物的成分对比
[0059][0060]
由图1，图2与表1可见，利用积雪草发酵后，比纯嗜热栖热菌发酵液蛋白质提升19倍、氨基酸提升12倍，总多糖提升108倍，总黄酮提升145倍，水溶性固含物提升8倍，羟基积雪草苷提升1520倍，比同浓度的积雪草水提取液蛋白质提升6倍，总多糖提升6倍，总黄酮提升11倍，总多酚提升6倍，总氨基酸提升42倍，水溶性固含物提升10倍。
[0061]
(二)积雪草苷类成分的萃取及转化
[0062]
对比发现，积雪草通过发酵产生了积雪草酸与羟基积雪草酸等4种近似成分。参见高效液相色谱(图3，图4与图5)：
[0063]
利用嗜热栖热菌发酵得到的积雪草发酵液和相同温度与时间等环境条件下的积雪草水提液(浓缩成药材比浓缩液为2：1)进行对比，在标准高效液相的特征图谱分析系统中，对比观察积雪草发酵前后，积雪草酸和羟基积草酸的相关特征峰。
[0064]
通过对比可见：
[0065]
(1)在积雪草水提取浓缩液(2：1)中，无积雪草酸和羟基积雪酸的相关特征峰。
[0066]
(2)在积雪草发酵液(5g/l)中，通过转化生成了积雪草酸。
[0067]
(3)在积雪草发酵液(5g/l)中，在6.5
′
，7.6
′
以及20.2
′
也出现了新的特征峰。
[0068]
从以上图谱分析得出，积雪草通过嗜热栖热菌发酵转化，得到了积雪草水提取液中没有的积雪草酸及其他积雪草酸近似物等4种成分。即，积雪草通过发酵产生了积雪草酸等4种近似成分。
[0069]
(三)利用嗜热栖热菌对积雪草进行发酵还发现，嗜热栖热菌中的相关转化酶对积雪草中的积雪草苷类成分(特别是羟基积雪草苷)能够进行转化富集，在所得的积雪草发酵液中，羟基积雪草苷的含量大幅度地增加(对比同浓度积雪草水提取液，其转化后含量能够提升1520倍)。参见高效液相色谱图(图6，图7与图8)，对比发现，积雪草通过嗜热栖热菌的发酵转化，产生了大量的羟基积雪草苷。
[0070]
利用嗜热栖热菌发酵的积雪草发酵液和相同温度与时间等环境条件下的积雪草水提液(浓缩成药材比浓缩液为2：1)进行对比，在标准高效液相的特征图谱分析系统中，对比观察积雪草发酵前后，积雪草苷和羟基积草苷相关特征峰。
[0071]
通过对比可见：
[0072]
(1)在积雪草水提取浓缩液中，无积雪草苷和羟基积雪苷的相关特征峰。
[0073]
(2)在积雪草发酵液(5g/l)图中，通过转化生成了大量的羟基积雪草苷。通过含量计算，该积雪草发酵液中的得到羟基积雪草苷含量高达1.5g/l。通过发酵转化后，与药材积雪草对比研究分析，羟基积雪草苷的含量提升了1520倍。
[0074]
由此可见，积雪草通过嗜热栖热菌发酵后，转化生成大量羟基积雪草苷，发酵转化后，羟基积雪草苷转化得率高达药材总质量的20％。
[0075]
实施例2
[0076]
将积雪草苷加入(加入量50g/l)至嗜热栖热菌与乳酸菌的双菌组合物的培养基中，按发酵工艺先经乳酸菌在(28℃，18h)发酵后，转至嗜热栖热菌发酵(78℃，8h)培养发酵，将发酵液加入到d330树脂以2bv/h流速下脱色，经离心过滤后，得到富含羟基积雪草苷的积雪草发酵液，再通过常规的提纯结晶等后处理工艺得到羟基积雪草苷纯品。
[0077]
实施例3
[0078]
将积雪草粗提物(加入量10g/l)加入至嗜热链球菌的培养基中，按发酵工艺(65℃，36h)培养发酵，将发酵液加入到d330树脂以2bv/h流速下脱色，经离心过滤后，得到富含羟基积雪草苷的积雪草发酵液，再通过常规的提纯结晶等后处理工艺得到羟基积雪草苷纯品。
[0079]
实施例4
[0080]
与实施例3相同，唯一不同的是原料为积雪草发酵液。
[0081]
实施例5
[0082]
积雪草发酵液与嗜热栖热菌发酵液对比功效研究：参见图9，图10与图11。
[0083]
(1)抗氧化(抗衰老)能力更强；
[0084]
(2)美白、淡斑功效更出色：积雪草发酵液的美白活性强于原发酵液及其积雪草提取浓缩液，并且，5％的积雪草(嗜热栖热菌)发酵液酪氨酸酶抑制率达50％，表现出较强的活性抑制能力，具有较强的美白功效。
[0085]
(3)光损伤修复：对比阳性药物地塞米松组及未紫外照射组后发现，经过紫外照射后，发现积雪草发酵液对hacat细胞的光损伤有较强修复能力，浓度在3％
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10％范围内细胞存活率均100％以上，光损伤修复能力较强，略有促进生长的作用；证实积雪草/嗜热栖热菌发酵液有较强的皮肤细胞的光损伤修复能力。
[0086]
尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。