1.本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种高效的缬氨酸制备方法。
背景技术：
2.缬氨酸为机体必需氨基酸和营养物质，被广泛应用于食品、医药、化妆品、饲料等领域的食品添加剂、饲料添加剂、营养增补剂、风味剂、化妆品添加剂、药物(如抗生素、除草剂等)的制备前体等，市场前景十分广阔。
3.cn110607268a公开了一种缬氨酸发酵基因工程菌及其发酵方法，该方法的发酵周期为40h，缬氨酸产量为80g/l。但该方法存在发酵周期长、糖酸转化率低(30
‑
40％)、产物中杂酸含量偏高等缺陷。
4.为此，需要研究开发糖酸转化率高、发酵周期短、杂酸含量少的缬氨酸发制备方法。
5.中国专利申请(cn202010401422.5、cn202010466347.0、cn202010460035.9)公开的内容作为理解本发明必不可少的内容。
技术实现要素：
6.本发明的目的在于提供一种高效的缬氨酸制备方法，包括下述步骤：
7.(1)将缬氨酸生产菌按照接种量为1
‑
10％接种到lb培养基中，将其培养体系置于180
‑
220r/min、35
‑
37℃、ph6
‑
7条件下培养至od值3
‑
4，得到一级种子液；
8.(2)将一级种子液按照1
‑
10％接种量转接至合成培养基中，将其置于180
‑
220r/min、35
‑
37℃、ph6
‑
7条件下培养至od值3
‑
4，得到二级种子液；
9.(3)将二级种子液按接种量1
‑
10％接种到发酵培养基中，将其置于30～37℃、ph为6
‑
7下发酵培养至生长稳定期，继续在38～45℃、ph为6
‑
7条件下发酵培养至残糖量不高于2g/l，制得缬氨酸发酵液。
10.本发明优选的技术方案中，步骤(1)中的缬氨酸生产菌选自野生大肠杆菌、重组大肠杆菌、野生黄色短杆菌、重组黄色短杆菌中的任一种。
11.本发明优选的技术方案中，所述缬氨酸生产菌选自sval031菌株、sval049菌株、sval065菌株中的任一种。
12.本发明优选的技术方案中，所述sval031菌株(保藏编号：cgmcc no.19456)于2020年3月6日提交保藏，分类命名：大肠埃希氏菌(escherichia coli)，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
13.本发明优选的技术方案中，所述sval049菌株(保藏编号：cgmcc no.19457)于2020年3月6日提交保藏，分类命名：大肠埃希氏菌(escherichia coli)，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
14.本发明优选的技术方案中，所述sval065菌株(保藏编号：cgmcc no.19458)于2020年3月6日提交保藏，分类命名：大肠埃希氏菌(escherichia coli)，保藏单位：中国微生物
菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
15.本发明优选的技术方案，步骤(1)中的lb培养基组成为：8
‑
10g/l蛋白胨，5
‑
10g/l酵母粉和8
‑
10g/l氯化钠。
16.本发明优选的技术方案，步骤(2)中的合成培养基组成为：甘油8
‑
10g/l，磷酸二氢钾18
‑
21g/l，硫酸铵5
‑
7g/l，硫酸镁1
‑
2g/l，酵母粉1.0
‑
1.2g/l，维生素b1为0.002
‑
0.004g/l，灭菌前用氨水调ph7.3
‑
7.5。
17.本发明优选的技术方案，步骤(3)中的发酵培养基的组成为：葡萄糖100
‑
150g/l，磷酸二氢钾18
‑
22g/l，硫酸铵5
‑
6g/l，vb1为0.010
‑
0.012g/l，七水硫酸镁2
‑
3g/l，硫酸铜0.03
‑
0.05g/l，七水硫酸亚铁0.02
‑
0.04g/l，聚醚消泡剂0.2ml/l。
18.本发明优选的技术方案中，发酵培养基中的葡萄糖量为140
‑
150g/l。
19.本发明优选的技术方案，步骤(3)中的空气流量为80
‑
100l/h。
20.本发明优选的技术方案，步骤(3)中的发酵转速为200
‑
400r/min。
21.本发明优选的技术方案，步骤(3)中的环境压力为0.03
‑
0.05mpa。
22.本发明优选的技术方案，步骤(3)中，培养至生长稳定期的温度为33
‑
36℃。
23.本发明优选的技术方案，步骤(3)中，培养至残糖量不高于2g/l的温度为42
‑
45℃。
24.本发明优选的技术方案中，所述的糖酸转化率不低于55％，发酵周期为不高于55h，发酵液中总杂酸含量不高于2.5g/l。
25.除非另有说明，本发明涉及液体与液体之间的百分比时，所述的百分比为体积/体积百分比；本发明涉及液体与固体之间的百分比时，所述百分比为体积/重量百分比；本发明涉及固体与液体之间的百分比时，所述百分比为重量/体积百分比；其余为重量/重量百分比。
26.除非另有说明，本发明采用如下检测方法：
27.1.od值
28.仪器以及试剂：紫外可见光分光光度计，玻璃比色皿，纯水
29.实验步骤：分光光度计使用前提前15分钟开机进行预热，将波长调到600nm，再在比色皿中加入纯水，放入分光光度计中进行校零，取出比色皿，将纯水倒掉，加入待测样品，放入分光光度计中读取吸光度值，得到样品od值。
30.2.杂酸量和产酸量
31.仪器以及试剂：岛津lc
‑
16液相色谱仪，c18色谱组，衍生剂为5％的邻苯二甲醛乙醇水溶液、30％甲醇流动相，缬氨酸标准品为西格玛分析标准品，杂酸为市售的含量99％的其它氨基酸。
32.实验步骤：发酵液稀释100倍后，过滤，加衍生剂衍生2分钟，衍生后进样，波长234nm，进样量10ul，通过标准品峰面积计算样品中氨基酸浓度。
33.杂酸量＝杂酸标准品峰面积/杂酸峰面积*杂酸标准品浓度。
34.产酸量＝缬氨酸标准品峰面积/缬氨酸峰面积*缬氨酸标准品浓度。
35.3.残糖量
36.使用山东科学院生物研究所的sba
‑
40d生物传感器检测发酵产物中的葡萄糖含量。
37.4.糖酸转化率
38.糖酸转化率的计算方法＝产酸量/(发酵培养基中的总葡萄糖质量*0.9)。
39.与现有技术相比，本发明具有下述有益技术效果：
40.1、本发明的缬氨酸制备方法筛选优化了发酵培养条件，显著提高了缬氨酸糖酸转化率并缩短发酵周期，显著降低杂酸的含量并提高发酵效率，利于缬氨酸发酵液的提纯，提高缬氨酸质量且质优价廉。
41.2、本发明缬氨酸的制备方法具有操作简便，适于工业化生产等优点。
具体实施方式
42.以下结合实施例对本发明做进一步的说明。
43.实施例中的菌种为中国专利申请(cn202010401422.5、cn202010466347.0、cn202010460035.9)中的菌种sval065菌株(保藏编号为cgmcc no.19458)、sval031菌株(保藏编号：cgmcc no.19456)、sval049菌株(保藏编号：cgmcc no.19457)。
44.lb培养基的组成：10g/l蛋白胨，5g/l酵母粉和10g/l氯化钠。
45.合成培养基的组成：甘油8
‑
10g/l，磷酸二氢钾18
‑
21g/l，硫酸铵5
‑
7g/l，硫酸镁1
‑
2g/l，酵母粉1.0
‑
1.2g/l，vb1为0.002
‑
0.004g/l，灭菌前用氨水调至7.3
‑
7.5。
46.发酵培养基的组成：葡萄糖150g/l，磷酸二氢钾18
‑
22g/l，硫酸铵5
‑
6g/l，vb1为0.010
‑
0.012g/l，七水硫酸镁2
‑
3g/l，硫酸铜0.03
‑
0.05g/l，七水硫酸亚铁0.02
‑
0.04g/l，聚醚消泡剂0.2ml/l。
47.实施例1
48.(1)取1ml甘油管保藏的sval065菌株(保藏编号为cgmcc no.19458)，将其接种至50ml的lb培养基中，在37℃、210r/min下摇床培养，调节ph6.2
‑
6.5，培养至od值为2
‑
3结束时，获得一级种子液；
49.(2)取2ml的一级种子液接种到100ml合成培养基中，在37℃、210r/min下摇床培养，调节ph6.4
‑
6.6，培养至od值为3
‑
4，获得二级种子液；
50.(3)在火焰保护环境下，将二级种子液按2.5％的接种量接种到发酵培养基中，35℃下培养30h，43℃下培养至残糖量小于2g/l，其中，环境压力为0.03mpa，发酵转速为200r/min、空气流量为100l/h，调节发酵ph为6.9
‑
7.0。
51.经统计，本次发酵时长为51h，发酵结束后，检测产酸量和杂酸量，其中缬氨酸为74g/l，l
‑
丙氨酸为0.24g/l，亮氨酸为0.16g/l，异亮氨酸为0.2g/l，糖酸转化率为54.8％。
52.对比例1
53.(1)取1ml甘油管保藏的菌种sval065菌株(保藏编号为cgmcc no.19458)，将其接种至50ml的lb培养基中，在37℃、210r/min下摇床培养，调节ph6.2
‑
6.5，培养至od值为2
‑
3，获得一级种子液；
54.(2)取2ml的一级种子液种接到100ml合成培养基中，37℃、ph6.4
‑
6.6、210r/min条件下摇床培养至od值为3
‑
4，获得二级种子液；
55.(3)在火焰保护环境下，将二级种子液按2.5％的接种量接种到发酵培养基中，35℃下培养至残糖量小于2g/l，其中，环境压力为0.03mpa，发酵转速为200r/min、空气流量为100l/h，调节发酵ph为6.9
‑
7.0。
56.经统计，本次发酵时长为78h，发酵结束后，检测产酸量和杂酸量，其中缬氨酸为
65g/l，l
‑
丙氨酸为0.8g/l，亮氨酸为0.42g/l，异亮氨酸为0.36g/l，糖酸转化率为48.1％。
57.实施例2
58.(1)取1ml甘油管保藏的sval031菌株(保藏编号：cgmcc no.19456)，将其接种至50ml的lb培养基中，37℃、210r/min下摇床培养，ph6.2
‑
6.5，培养至od值为2
‑
3，获得一级种子液；
59.(2)取2ml的一级种子液种接种至100ml合成培养基中，在37℃、210r/min、ph6.4
‑
6.6条件下摇床培养至od值为3
‑
4，获得二级种子液；
60.(3)在火焰保护环境下，将二级种子液按2.5％的接种量接种到发酵培养基中，35℃下培养至生长稳定期，43℃下培养至残糖量小于2g/l，其中，环境压力为0.03mpa，发酵转速为200r/min、空气流量为100l/h，发酵ph为6.9
‑
7.0。
61.经统计，本次发酵时长为52h，发酵结束后，检测产酸量和杂酸量，其中缬氨酸为71g/l，l
‑
丙氨酸为0.27g/l，亮氨酸为0.21g/l，异亮氨酸为0.26g/l，糖酸转化率为52.6％。
62.对比例2
63.(1)取1ml甘油管保藏的菌种sval031菌株(保藏编号为cgmcc no.19458)，将其接种至50ml的lb培养基中，在37℃、210r/min、ph6.2
‑
6.5条件下摇床培养至od值为2
‑
3，获得一级种子液；
64.(2)取2ml的一级种子液种接到100ml合成培养基中，在37℃、210r/min、ph6.4
‑
6.6条件下摇床培养至od值为3
‑
4，获得二级种子液；
65.(3)在火焰保护环境下，将二级种子液按2.5％的接种量接种到发酵培养基中，35℃下培养30h，39℃下培养10h，43℃下培养至残糖量小于2g/l，其中，环境压力为0.03mpa，发酵转速为200r/min、空气流量为100l/h，发酵ph为6.9
‑
7.0。
66.经统计，本次发酵时长为57h，发酵结束后，检测产酸量和杂酸量，其中缬氨酸为62g/l，l
‑
丙氨酸为0.44g/l，亮氨酸为0.34g/l，异亮氨酸为0.23g/l，糖酸转化率为45.9％。
67.实施例3
68.(1)取1ml甘油管保藏的sval049菌株(保藏编号：cgmcc no.19457)，将其接种至50ml的lb培养基中，37℃、210r/min、ph6.2
‑
6.5下摇床培养至od值为2
‑
3，获得一级种子液；
69.(2)取2ml的一级种子液种接到100ml合成培养基中，37℃、210r/min、ph6.4
‑
6.6下摇床培养至od值为3
‑
4，获得二级种子液；
70.(3)在火焰保护环境下，将二级种子液按2.5％的接种量接种到发酵培养基中，35℃下培养至生长稳定期，43℃下培养至残糖量小于2g/l，其中，环境压力为0.03mpa，发酵转速为200r/min、空气流量为100l/h，发酵ph为6.9
‑
7.0。
71.经统计，本次发酵时长为52h，发酵结束后，检测产酸量和杂酸量，其中缬氨酸为68g/l，l
‑
丙氨酸为0.3g/l，亮氨酸为0.16g/l，异亮氨酸为0.14g/l，糖酸转化率为50.4％。
72.对比例3
73.(1)取1ml甘油管保藏的菌种sval049菌株(保藏编号为cgmcc no.19458)，将其接种至50ml的lb培养基中，在37℃、210r/min、ph6.2
‑
6.5下摇床培养至od值为2
‑
3，获得一级种子液；
74.(2)取2ml的一级种子液种接到100ml合成培养基中，在37℃、210r/min、ph6.4
‑
6.6下摇床培养至od值为3
‑
4，获得二级种子液；
75.(3)在火焰保护环境下，将二级种子液按2.5％的接种量接种到发酵培养基中，35℃下培养至残糖量小于2g/l，其中，环境压力为0.03mpa，发酵转速为200r/min、空气流量为100l/h，发酵ph为6.9
‑
7.0。
76.经统计，本次发酵时长为75h，发酵结束后，检测产酸量和杂酸量，其中缬氨酸为64g/l，l
‑
丙氨酸为0.71g/l，亮氨酸为0.33g/l，异亮氨酸为0.21g/l，糖酸转化率为47.4％。
77.以上对本发明具体实施方式的描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明权利要求保护的范围。