一种重组类人胶原蛋白工程菌的构建方法与流程

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种重组类人胶原蛋白工程菌的构建方法。

背景技术：

胶原蛋白是结缔组织中极其重要的结构蛋白质，对维护细胞、组织及器官的正常生理功能有着重要作用。胶原蛋白被广泛的应用于医学材料及药物方面、美容化妆品、保健品以及各种实用工业中。然而，使用传统方法制备的动物源胶原有一定的病毒隐患如疯牛病、口蹄疫、猪瘟疫等，特别是应用于人体时易引起异体异种的排异反应，从而限制了胶原蛋白在医药方面的应用。

人类采用基因工程手段生产重组胶原蛋白，这种生产方法有着传统提取方法难以媲美的优势：1)安全可控，相比于传统胶原制备法原料来源的难以追踪和不确定性，利用基因工程技术生产重组类人胶原蛋白的原料成分明确，无病毒感染风险，2)质量可控，基因工程技术可表达特定分子量的类人胶原片段，批次之间重复性好，而提取的胶原蛋白通常为不同种类胶原蛋白的混合产物，批次之间差异大，不利于质量控制，3)较低的排异反应，类人胶原蛋白以人体胶原蛋白基因为基础构建，其免疫排异反应比动物来源的胶原蛋白小。

技术实现要素：

本发明设计出独特基因序列(如seqidno.1所示)的重组类人胶原蛋白，结合与pet24a载体的酶切连接得到酶切产物，基于酶切产物获得类人胶原蛋白片段，并将类人胶原蛋白片段与pet-24a载体进行连接得到pet24-类人胶原蛋白片段连接产物，最终基于pet24-类人胶原蛋白片段连接产物获得重组类人胶原蛋白工程菌。采用此种方法获得的重组类人胶原蛋白工程菌经过培养、蛋白诱导表达及纯化后所得纯化的重组胶原蛋白，纯化过程简单且参数容易控制，且所得纯化的重组胶原蛋白对人表皮细胞、人皮肤成纤维原代细胞在72小时内均具有一定的增殖作用，生物活性高。具体技术方案如下：

一种重组类人胶原蛋白工程菌的构建方法，包括以下步骤：

重组类人胶原蛋白基因序列的设计，具体是：以选取的类人胶原蛋白iii的氨基酸序列为基础；根据大肠杆菌的偏好密码子设计出编码重组类人胶原蛋白的基因序列，并在该序列3’端引入组氨酸纯化标签；

将重组类人胶原蛋白片段与pet24a载体的酶切连接，得到酶切产物，其中：重组类人胶原蛋白的基因序列如seqidno.1所示；

将酶切产物用琼脂糖凝胶进行电泳得到目的条带；

将目的条带切胶，进行纯化回收得到类人胶原蛋白片段；

将类人胶原蛋白片段测定含量，并将类人胶原蛋白片段与pet-24a载体进行连接得到pet24-类人胶原蛋白片段连接产物；

将pet24-类人胶原蛋白片段连接产物热转化大肠杆菌感受态细胞bl21(de3)得到重组类人胶原蛋白工程菌。

优选的，重组类人胶原蛋白的氨基酸序列如seqidno.2所示。

优选的，将重组类人胶原蛋白片段与pet24a载体酶切连接时的酶切反应体系如下：

含类人胶原蛋白片段的质粒或pet24a质粒：10μl；

10×fastdigestbuffer：10μl；

ndei：5μl；

xhoi：5μl；

h2o：70μl；

37℃，30min。

优选的，将酶切产物用1％琼脂糖凝胶进行电泳得到目的条带。

优选的，将类人胶原蛋白片段与pet-24a载体进行连接，连接反应体系如下：

类人胶原蛋白片段：4μl；

pet-24a载体：1μl；

t4dnaligase：1μl；

10×t4dnaligasebuffer：1μl；

水：3μl；

25℃，30min。

优选的，还包括大肠杆菌的发酵培养、蛋白诱导表达及纯化，具体包括以下步骤：

大肠杆菌的发酵培养：将工程细胞株接种于含kan的lb培养液的离心管中，培养过夜；将过夜培养的菌株接种于含kan的lb培养液中，振摇至菌体od600为0.2-0.5；

蛋白诱导表达：向剩余的培养物中加入iptg，振摇3-5h，诱导蛋白表达；

蛋白纯化：将过夜培养的菌液接种于新鲜的含kan的lb培养基中，35℃-40℃培养，振摇至菌体od600为0.6-0.8；补加iptg；35℃-40℃诱导表达3-5h；取出培养物，室温离心，弃上清；将菌体沉淀用nativebinding-buffer重悬后，超声破碎，3℃-8℃条件下离心，取上清；将上清液加入至binding-buffer预平衡的ni亲和层析柱中，静音混匀仪上旋转混匀；收集流穿液；用nativewashbuffer洗脱，得到纯化的重组胶原蛋白。

优选的，大肠杆菌的发酵培养具体是：将工程细胞株接种于含50μg/mlkan的3ml的lb培养液的离心管中，37℃，220rpm培养过夜；将过夜培养的菌株按1：100接种于50μg/mlkan的10ml的lb培养液中，37℃，220rpm振摇至菌体od600为0.4，振摇时间为1.8-2.5h。

优选的，蛋白诱导表达：向剩余的培养物中加入iptg至终浓度为0.5-0.8mmol/l，35℃-40℃及220rpm振摇3-6h，诱导蛋白表达；离心收集菌体，用3mltris缓冲液重悬，超声破菌，收集上清和沉淀，进行sds-page。

优选的，蛋白纯化：将过夜培养的菌液以1：100转接于新鲜的1l含50μg/mlkan的lb培养基中，37℃大量培养，od600为0.6-0.8，振摇时间为1.8-2.2h，补加iptg至终浓度为1mm，37℃诱导表达4h；取出培养物，12000g室温离心2min，弃上清；根据镍离子亲和层析柱ni-ntaagarose将1l诱导表达的培养菌体沉淀用30ml的nativebinding-buffer重悬后，超声破碎，4℃条件下取12000g离心20min，取上清；将上清液10ml加入至binding-buffer预平衡的ni亲和层析柱中，静音混匀仪上旋转混匀15min；收集流穿液；用8ml的nativewashbuffer以0.5ml/min流速冲洗；用20ml的nativewashbuffer以1ml/min流速冲洗柱子；用2ml的nativeelution-buffer、4ml的nativeelution-buffer及8ml的nativeelution-buffer以1ml/min流速洗脱目的蛋白，得到纯化的重组胶原蛋白。

附图说明

图1为实施例1中琼脂糖凝胶电泳检测表达载体酶切结果示意图；

图2为实施例1中蛋白诱导表达结果示意图；

图3为实施例1中纯化的重组胶原蛋白示意图；

图4为实施例1中纯化的重组胶原蛋白48小时对人角质形成细胞hacat的作用情况；

图5为实施例1中纯化的重组胶原蛋白72小时对人角质形成细胞hacat的作用情况；

图6为实施例1中纯化的重组胶原蛋白48小时对人皮肤成纤维原代细胞(fibroblast)的作用情况；

图7为实施例1中纯化的重组胶原蛋白72小时对人皮肤成纤维原代细胞(fibroblast)的作用情况；

图8为对比例1中bss蛋白48小时对人角质形成细胞hacat的作用情况；

图9为对比例1中bss蛋白72小时对人角质形成细胞hacat的作用情况；

图10为对比例1中bss蛋白48小时对人皮肤成纤维原代细胞(fibroblast)的作用情况；

图11为对比例1中bss蛋白72小时对人皮肤成纤维原代细胞(fibroblast)的作用情况。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的实施例进行详细阐述，以使本发明的优点和特征能更易于被本领域技术人员理解，从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界定。

实施例1：

一种重组类人胶原蛋白工程菌的构建方法，包括以下步骤：

1、将重组类人胶原蛋白基因片段与pet24a载体酶切连接，得到酶切产物，其中：重组类人胶原蛋白的基因序列如seqidno.1所示，具体为：

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氨基酸序列如seqidno.2所示：

gergdlgpqgiagqrgvvgergergergasgergdlgpqgiagqrgvvgergergergasgergdlgpqgiagqrgvvgergergergasgergdlgpqgiagqrgvvgergergergasgergdlgpqgiagqrgvvgergergergasgergdlgpqgiagqrgvvgergergergasgergdlgpqgiagqrgvvgergergergasgergdlgpqgiagqrgvvgergergergasgppgpccggg。

将重组类人胶原蛋白片段与pet24a载体的酶切连接，得到酶切产物，此酶切反应体系如下：含类人胶原蛋白片段的质粒或pet24a质粒：10μl；

10×fastdigestbuffer：10μl；

ndei：5μl；

xhoi：5μl；

h2o：70μl；

37℃，30min。

2、将酶切产物用1％琼脂糖凝胶进行电泳得到目的条带，详见图1，其中：m为ds5000marker(东盛生物)，其中5000bp左右大小条带为pet24载体条带，1000bp左右大小条带为类人胶原蛋白基因条带。

3、将目的条带切胶，进行纯化回收得到类人胶原蛋白片段。

4、将类人胶原蛋白片段测定含量，并将类人胶原蛋白片段与pet-24a载体进行连接得到pet24-类人胶原蛋白片段连接产物，连接反应体系如下：

类人胶原蛋白片段：4μl；

pet-24a载体：1μl；

t4dnaligase：1μl；

10×t4dnaligasebuffer：1μl；

水：3μl；

25℃，30min。

5、将pet24-类人胶原蛋白片段连接产物热转化大肠杆菌感受态细胞bl21(de3)得到重组类人胶原蛋白工程菌。

在上述转化的板上挑取单菌落10个，接入1ml50ug/ml的kan-lb液体培养基，37℃，培养过夜；随机挑取6个菌株进行质粒提取，编号1-6；用ndei和xhoi对质粒进行酶切鉴定，此处酶切鉴定的体系为：质粒：3μg(约3μl)；

ndei：0.5μlxhoi：

0.5μlh2o：6μl；

采用0.8％琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果，初步鉴定阳性结果；将酶切检测为阳性结果的质粒送测序。测序结果符合预期的，则认定为构建成功的工程细胞株。

大肠杆菌的发酵培养、蛋白诱导表达及纯化，具体是：挑取工程菌单菌落，置于lb培养基中进行活化培养，然后转接至少量发酵培养基中，加入iptg进行诱导表达，离心收集菌体后，将上清和细胞沉淀分别进行sds-page电泳，以检测胶原蛋白表达情况。确认蛋白成功表达后，在摇瓶中培养工程菌诱导蛋白表达，超声破碎细胞后，离心取上清，镍离子亲和层析柱对上清进行纯化。本实施例的具体操作如下：

1、大肠杆菌的发酵培养：将工程细胞株接种于含50μg/mlkan的3ml的lb培养液的离心管中，37℃，220rpm培养过夜；将过夜培养的菌株按1：100接种于50μg/mlkan的10ml的lb培养液中，37℃，220rpm振摇至菌体od600为0.4，振摇时间为1.8-2.5h。

2、蛋白诱导表达：向剩余的培养物中加入iptg至终浓度为0.5mmol/l，37℃及220rpm振摇4h，诱导蛋白表达，详见图2，图2中：m为proteinladder(thermofisher，#26616)，1号泳道为诱导前上清，2号泳道为诱导后上清，3号泳道为诱导后沉淀，与1号泳道相比，诱导后的2号和3号泳道表达了预期大小为35kda的类人胶原蛋白；离心收集菌体，用3mltris缓冲液重悬，超声破菌，收集上清和沉淀，进行sds-page。

3、蛋白纯化：

3.1、将过夜培养的菌液以1：100转接于新鲜的1l含50μg/mlkan的lb培养基中，37℃大量培养，od600为0.6，振摇时间为2.0h，补加iptg至终浓度为1mm，37℃诱导表达4h；

3.2、取出培养物，12000g室温离心2min，弃上清；

3.3、根据镍离子亲和层析柱ni-ntaagarose(thermofisher，k85001)将1l诱导表达的培养菌体沉淀用30ml的nativebinding-buffer重悬后，超声破碎(功率200w，工作4sec，间歇8sec，共20min)，4℃条件下取12000g离心20min，取上清；

3.4、将上清液10ml加入至binding-buffer预平衡的ni亲和层析柱中，静音混匀仪上旋转混匀15min；

3.5、收集流穿液；

3.6、重复步骤3.4-3.5，完成全部上清液的纯化；

3.7、用8ml的nativewashbuffer以0.5ml/min流速冲洗；

3.8、用20ml的nativewashbuffer以1ml/min流速冲洗柱子；

3.9、相继用2ml的nativeelution-buffer(咪唑浓度20mm)、4ml的nativeelution-buffer(咪唑浓度100mm)及8ml的nativeelution-buffer(咪唑浓度200mm)以1ml/min流速洗脱目的蛋白，收集流穿液，2ml/管；

3.10、从每管中吸取12μl，加入3μl5×loadingbuffer，进行12％sds-page分析，得到纯化的重组胶原蛋白，计为col蛋白(即col-2)，详见图3，m为proteinladder(thermofisher，#26616)，1号泳道为纯化的重组类人胶原蛋白，从图3可知，成功获得纯度为85％的重组类人胶原蛋白。

将本实施例所得的纯化的重组胶原蛋白诱导培养人皮肤成纤维原代细胞(代称fibroblast，即成纤维细胞)和人表皮细胞(hacat，即人永生化角质形成细胞)，采用cck8法检测重组胶原蛋白对人表皮细胞、人皮肤成纤维原代细胞的增殖作用，具体是：

人皮肤成纤维原代细胞培养条件：opti-mem培养基，15％血清，三抗1％，37℃，5％co2。

将人皮肤成纤维原代细胞(fibroblast)和人表皮细胞(hacat)进行铺板，接种2×10³个细胞于96孔板中，每孔100ul，培养24小时，各铺板5块96孔板。

将重组胶原蛋白(即col蛋白)用dmem+5％fbs(hacat)及opti-mem+5％fbs(fibroblast)稀释成终浓度为0(阴性对照)、75ug/ml、150ug/ml、300ug/ml、600ug/ml和1200ug/ml。

弃去培养基，加入各浓度组的重组胶原蛋白(col蛋白)及阴性对照100ul，处理时间分为48h和72h，每组5个复孔。

采用cck8测定，具体是根据cck8试剂盒说明书测定读值，详见图4-图7，从图4-7可知：图4显示本发明重组胶原蛋白(col-2)在48小时对人表皮细胞(hacat)不起作用；图5显示本发明重组胶原蛋白(col-2)在72小时对人表皮细胞(hacat)起作用；图6显示本发明重组胶原蛋白(col-2)在48小时对人皮肤成纤维原代细胞(fibroblast)起作用；图7显示本发明重组胶原蛋白(col-2)在72小时对人皮肤成纤维原代细胞(fibroblast)起作用。

本实施例所得纯化的重组胶原蛋白(即col蛋白)作用于人皮肤成纤维原代细胞(fibroblast)在48小时，有显著促进细胞增殖的作用；作用72小时，有一定促增殖作用。

本实施例所得纯化的重组胶原蛋白(即col蛋白)作用于人表皮细胞hacat细胞72小时，有一定促增殖作用。

可见，本实施例方法所得纯化的重组胶原蛋白(即col蛋白)具有很好的活性。

对比例1：

市场上购买bss蛋白，购买于江苏江山聚源生物技术有限公司，将该bss蛋白诱导培养人皮肤成纤维原代细胞(代称fibroblast)和人表皮细胞(hacat)，将bss蛋白用dmem+5％fbs(hacat)及opti-mem+5％fbs(fibroblast)稀释成终浓度为0(阴性对照)、75ug/ml、150ug/ml、300ug/ml和600ug/ml五个浓度，结果详见图8-11，具体是：

图8显示bss蛋白在48小时对人表皮细胞(hacat)不起作用；图9显示bss蛋白在72小时对人表皮细胞(hacat)不起作用；图10显示bss蛋白在48小时对人皮肤成纤维原代细胞(fibroblast)起作用；图11显示bss蛋白在72小时对人皮肤成纤维原代细胞(fibroblast)起作用。

胶原促进细胞增殖的原理复杂，主要可分为物理支持作用以及特异性作用：物理支持作用是指，胶原蛋白在生理条件下会形成特定的三维结构，进一步自组装成纤维，这种纤维结构能够起到支持细胞黏附生长，保护细胞不受物理损伤等作用，促进细胞增殖；特异性作用是指，上皮细胞、内皮细胞、巨噬细胞等细胞在滞留在胶原基质内部或者表面的过程中，会与胶原相互作用，直接或间接激活某些细胞膜受体，从而调节细胞功能。结合实施例1的细胞试验数据(图4-7)和对比例1的细胞试验数据(图8-11)显示：市售胶原蛋白bss仅对人皮肤成纤维原代细胞(fibroblast)起作用，而采用本发明方法获得的对人皮肤成纤维细胞和人皮肤角质形成细胞均具有诱导增殖的作用，且本发明胶原蛋白对人皮肤成纤维原代细胞(fibroblast)的增值效果明显优于现有技术的市售胶原蛋白bss。

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

序列表

<110>可孚医疗科技股份有限公司

<120>一种重组类人胶原蛋白工程菌的构建方法

<160>2

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>750

<212>dna

<213>2ambystomalateralexambystomajeffersonianum

<400>1

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