检测结核分支杆菌的引物对、探针、试剂盒及其应用的制作方法

本发明属于生物工程技术领域，尤其涉及一种基于巢式rpa(nestrpa)技术检测结核分支杆菌is6110基因的引物对、探针、试剂盒及其应用。

背景技术：

结核病是由结核分枝杆菌引起的慢性传染病，可侵及许多脏器，以肺部结核感染最为常见。排菌者为其重要的传染源。人体感染结核菌后不一定发病，当抵抗力降低或细胞介导的变态反应增高时，才可能引起临床发病。若能及时诊断，并给予合理治疗，大多可获临床痊愈。

结核菌属于放线菌目、分枝杆菌科的分枝杆菌属，为有致病力的耐酸菌。主要分为人、牛、鸟、鼠等型。对人有致病性的主要是人型菌，牛型菌少有感染。1882年，德国细菌学家郭霍(robertkoch，1843-1910)首先发现并证明结核分枝杆菌是结核病的病原菌。

结核病临床特征为：有较密切的结核病接触史，起病可急可缓，多为低热(午后为著)、盗汗、乏力、纳差、消瘦、女性月经失调等；呼吸道症状有咳嗽、咳痰、咯血、胸痛、不同程度胸闷或呼吸困难。结核分枝杆菌可侵犯全身各组织器官，但以肺部感染最多见。

结核病严重影响人类健康和生命，人类与之斗争了许多世纪。在17-18世纪的欧洲，结核病被称为"白色瘟疫"，几乎100％的欧洲人被感染，25％的欧洲人死亡。随着抗结核药物的不断发展和卫生生活状况的改善，结核的发病率和死亡率曾一度大幅下降。

20世纪90年代以来，由于艾滋病和结核分枝杆菌耐药菌株的出现、免疫抑制剂的应用、吸毒、贫困及人口流动等因素，全球范围内结核病的疫情骤然恶化。结核病成为首要的再现传染病，成为了全球尤其是发展中国家最为严重的全球性卫生问题。

全世界约有1/3的人感染结核分枝杆菌，每年有900万的新病例出现，有200万人死于该疾病。中国是结核病高负担国家，发病率仅次于印度。国内带菌人群多，发病人群多，死亡人群多。2018年，我国肺结核发病人数88.9万人，死亡人数3149人。2019年，我国肺结核的发病人数为96.31万人，死亡人数为2008人。

目前临床诊断方法一般为：痰涂片、结核菌素试验、特异性抗体测定(酶联吸附试验)、胸腔积液检查及影像学检查，结核菌聚合酶联反应(pcr)阳性有辅助诊断价值。

目前临床分子诊断技术主要分为：蛋白检测和核酸检测，例如：lam抗原检测、xpertqpcr核酸扩增法、核酸扩增和杂交、lamp-pcr核酸扩增法。这些方法都具有各自的优缺点。其中，这些技术应用于结核分枝杆菌的检测时，仍然存在因灵敏度偏低，而造成结果假阴性的问题。此外，临床发现有30％左右的患者没有痰液或痰液很少，无法使用痰培养分离结核菌技术进行临床诊断；同时，即使有痰液的患者可以进行痰培养，其中仍有很大比例痰培养为阴性结果，而且痰培养的时间太长。因此，痰培养无法做到快速准确地诊断结核病。

重组酶聚合酶扩增(recombinasepolymeraseamplification，rpa)是基于重组酶聚合酶介导的扩增原理，模拟体内dna复制的酶反应过程，依赖特定的酶和蛋白组合(重组酶、单链结合蛋白和dna聚合酶)对dna模板进行特异性扩增，可在接近体温条件下实现快速特异性扩增(37℃-42℃，5-30min)，大大缩短了检测时间。rpa为核心的等温核酸扩增技术，减少了对高精度昂贵仪器、稳定电力供应设施及高级别实验室的依赖，只需要一个恒温装置就可进行样本检测工作，利用荧光分析装置实时判断是否存在待扩增的产物，对实验设施和操作设备要求低的特点。近年来，已广泛应用于生命科学研究、医学检测、农业、食品安全、转基因检测等多个领域。

目前，结核病仍是全世界最严重的传染病之一，潜伏性结核分支杆菌感染者为数众多，是潜在的传染源，危害巨大；而目前的检测技术手段仍存在一定的漏检率和假阴性率，早期、准确地发现结核分枝杆菌感染者是一个亟待解决的问题，因此急需开发出具有高灵敏度和快速准确的结核分支杆菌核酸检测新技术。

技术实现要素：

本发明要解决目前缺乏高灵敏度的检测结核分支杆菌试剂盒的技术问题，提供一种基于巢式rpa(nestrpa)技术检测结核分支杆菌的引物对、探针、试剂盒，该试剂盒能快速、准确、灵敏、特异地对结核分支杆菌进行检测，从而减少结合病的漏检率和假阴性率。

为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现:

在本发明的一个方面，提供了一种检测结核分支杆菌的引物对，所述引物对是针对seqidno：1所示结核分支杆菌is6110基因序列或其部分序列设计的引物对。

优选的，所述引物对是以巢式rpa检测结核分支杆菌的引物对，其包含外引物对和内引物对。

更优选的，所述外引物对具有如seqidno：3和seqidno：4所示的碱基序列，所述内引物对具有如seqidno：5和seqidno：6所示的碱基序列。

在本发明的另一方面，还提供了一种检测结核分支杆菌的探针，所述探针是特异性针对seqidno：1所示结核分支杆菌is6110基因序列或其部分序列设计的探针。

优选的，所述探针具有如seqidno：2所示的碱基序列。

在本发明的另一方面，还提供了一种检测结核分支杆菌的试剂盒，所述试剂盒包含上述的引物对。

优选的，所述试剂盒还包含上述探针。

在本发明的另一方面，还提供了一种以巢式rpa检测结核分支杆菌的方法，包括以下步骤：

用针对结核分支杆菌is6110基因的一对外引物，以待测样本核酸为模板进行第一次rpa反应，扩增目的基因第一片段；

用针对结核分支杆菌is6110基因的一对内引物，以扩增出的目的基因第一片段为模板、并在加入结核分支杆菌is6110基因特异性信号探针的条件下进行第二次rpa反应，扩增目的基因第二片段；

通过检测探针信号，获得结核分支杆菌核酸的检测结果。

所述信号探针为荧光素标记的探针，所述检测探针信号是利用荧光检测设备检测标记在探针上的荧光素信号。

在本发明的另一方面，还提供了上述试剂盒在制备检测结核分支杆菌的产品中的应用。

本发明检测结核分支杆菌的试剂盒，通过nestrpa技术检测结核分支杆菌is6110基因，最低可检测到1拷贝/ul的结核分支杆菌核酸片段，大大提高了检测灵敏度，且在39℃恒温条件下进行检测反应，无需昂贵检测设备，检测时间短，仅需15min，该技术可早发现感染结核分支杆菌人群，为早期隔离和早期治疗提供新的技术支撑，具有非常好的应用前景。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。

图1是本发明实施例1的rpa检测is6110基因优选引物lod结果图；

图2是本发明实施例2的nestrpa检测is6110基因(阳性质粒)lod结果图；

图3是本发明实施例3的使用nestrpa对结核分枝杆菌h37ra菌株dna的检测能力结果图；

图4是本发明实施例4的利用nestrpa方法对is6110基因优选引物和探针组合的特异性检测结果图；

图5是本发明实施例5的利用nestrpa方法对临床样本is6110基因检测结果图；

图6是本发明实施例5的nestrpa阳性反应产物is6110的高通量测序比对结果图。

具体实施方式

本发明根据结核分枝杆菌基因组中序列保守稳定的is6110基因设计特异性引物和探针，基于rpa反应原理，建立了结核分枝杆菌巢式rpa(nestrpa)实时荧光快速检测法，实验室条件下可以检出1拷贝/ul的结核分支杆菌核酸片段，大大提高检测方法的灵敏度。

本发明以巢式rpa检测结核分枝杆菌的方法，包括以下步骤：

步骤一：使用is6110基因的一对外引物，对模板dna进行第一次rpa反应，预扩增目的基因的第一片段；

步骤二：使用is6110基因的一对内引物，以步骤一扩增出的目的基因第一片段为模板，并在加入is6110基因特异性信号探针的条件下进行第二次rpa反应，扩增目的基因的第二片段；

利用荧光检测设备检测带标记的探针信号，获得结核分支杆菌核酸检测结果。

所述信号探针为带有信号标记的探针，通常为带有荧光素标记的探针，本发明实施例使用的荧光素标记的探针为fam荧光素标记探针。

步骤一中rpa反应体系为：酶的冻干粉(包括重组酶、单链dna结合蛋白及聚合酶)，25ul缓冲液vi，2.1ul正向外引物(10um)，2.1ul反向外引物(10um)，10ul待测样品，2.5ul乙酸镁(280mm)。醋酸镁一旦加入反应体系中，反应立即开始。

步骤二中rpa反应体系为：酶的冻干粉(包括重组酶、单链dna结合蛋白、聚合酶及核酸外切酶)，25ul缓冲液vi，2.1ul正向内引物(10um)，2.1ul反向内引物(10um)，0.6ul探针(10um),全部预反应产物，2.5ul乙酸镁(280mm)。醋酸镁一旦加入反应体系中，反应立即开始。

步骤一的rpa反应可在37-42℃进行，反应时间为5-20min。优选反应温度为39℃，反应时间15min。

步骤二的rpa反应可在在37-42℃进行，反应时间为1-30min。优选反应温度为39℃，反应时间15min。

通过恒温荧光扩增仪实时观察，在上机检测15min内可见典型指数型扩增曲线，曲线斜率大于20，且荧光值差值与空白/阴性对照具有显著统计学差异(p<0.05)，判断为阳性结果，待测样本is6110基因检测结果为阳性。

实施例1结核分枝杆菌is6110基因的引物和探针设计及筛选

通过检索pubmed核酸数据库，发现结核分枝杆菌is6110基因序列保守性较好，对其碱基突变频率较低的片段设计引物和探针(表1)。

表1is6110基因引物和探针

合适的引物序列是rpa高效扩增的重要一环，首先在有连续3个胸腺嘧啶(t)的序列设计探针，以fam荧光素修饰探针。在探针两端不同位置分别设计12对引物，以筛选出最高效的引物和探针组合(表1)。在引物筛选时，将第一条正向引物(f)分别与第一至第十二条反向引物(r)配对。接着再筛选反向引物，将第一条反向引物(r)分别与第一至第十二条正向引物(f)配对。通过两轮引物筛选，找到具有最大斜率和最短起峰时间的最佳引物组合。合成含结核分枝杆菌is6110基因片段的阳性质粒用于引物筛选，在1×10⁵拷贝/ul浓度下测试各引物对与探针组合的敏感性(阳性质粒、引物和探针的合成均由生工生物(上海)有限公司完成)。

将含有结核分枝杆菌is6110基因序列的质粒dna用依次稀释为1×10⁶拷贝/ul,1×10⁵拷贝/ul,1×10⁴拷贝/ul,1×10³拷贝/ul,5×10²拷贝/ul,3×10²拷贝/uls,2×10²拷贝/ul,1×10²拷贝/ul,1×10¹拷贝/ul。用rpa方法，在30分钟反应终点，观察待测样本与空白对照之间的荧光度差异是否有统计学意义，判断标准是p<0.05为阳性，p>0.05为阴性。经过筛选，发现is6110基因的引物对f4/r3和f12/r11具有更高的灵敏度(表2)，其最低检测限均为500拷贝/ul(图1，图1例中数值单位为拷贝/ul)。但这一结果与目前的qpcr方法相比，检测方法的灵敏度并没有明显优势。

表2is6110基因优选引物对和探针组合

rpa反应体系为：酶的冻干粉(包括重组酶、单链dna结合蛋白及聚合酶)，25ul缓冲液vi，2.1ul正向引物(10um)，2.1ul反向引物(10um)，1ul待测样品，0.6ul特异性探针(10um)，2.5ul乙酸镁(280mm)。醋酸镁一旦加入反应体系中，反应立即开始。

实施例2is6110基因优选引物、探针组合对结核分枝杆菌质粒dna的nestrpa检测

进一步将含有结核分枝杆菌is6110基因序列的质粒dna依次稀释为100拷贝/ul,50拷贝/ul，10拷贝/ul，5拷贝/ul和1拷贝/ul，用实施例1优选的is6110基因的引物对和探针组合进行nestrpa检测，可检测到浓度低至1拷贝/ul的含结核分枝杆菌is6110基因片段的阳性质粒dna(图2，图2例中数值单位为拷贝/ul)，说明nestrpa可显著提高检测结核分枝杆菌is6110基因的灵敏度。

实施例3is6110基因优选引物、探针组合对结核分枝杆菌h37ra菌株dna的nestrpa检测

实验室培养结核分枝杆菌h37ra至菌液od值为1.0时(浓度为10⁹cfu/ml)取出，取1ml培养菌液，用1×pbs按10倍系列稀释法稀释菌液，进行连续12次稀释，再根据试剂盒标准步骤提取h37ra菌液dna。使用本发明nestrpa方法并利用优选引物与探针组合对is6110基因进行检测。结果显示，本发明nestrpa方法对第11次稀释后的结核菌株dna的检测结果仍为阳性(图3，图3中图例表示样本稀释次数)。

实施例4利用nestrpa对is6110基因的优选引物、探针组合的特异性检测

实验室培养菌株脓肿分枝杆菌(m.abscessus)、偶然分枝杆菌(m.fortuitum)、克雷伯菌(klebsiella)、沙门氏菌(salmonella)、地衣芽孢杆菌(b.licheniformis)、荧光假单孢菌(p.fluorescens)、金黄色葡萄球菌(s.aurus)、耻垢分枝杆菌(m.smegmatis)以及海分枝杆菌(m.marinum)的dna提取液。使用本发明nestrpa方法，利用is6110基因的优选引物和探针组合，分别对以上菌株dna和结核分枝杆菌(mycobacteriumtuberculosis，简称m.tuberculosis)h37ra菌株dna进行检测。结果显示本发明nestrpa的特异性良好，仅在h37ra菌株dna样本出现典型阳性扩增曲线，其他菌株dna样本未见典型扩增曲线(图4)。

实施例5nestrpa对临床样本进行is6110基因检测

2020年1月至2020年9月期间，收集到来自50位确诊肺结核或疑似肺结核患者的50例样本(痰液样本)(表3)，以及来自14位非肺结核其他疾病患者或医务人员的14例阴性样本(外周血样本)。所有临床样本均按照说明书标准步骤提取dna。

用nestrpa对临床样本提取的dna进行结核分枝杆菌is6110基因检测。结果显示14例阴性样本is6110基因的nestrpa检测结果均为阴性(图5)。

该50例临床样本的临床分子检测结果，有46例样本进行痰菌培养，阳性率为26.09％(26/46)，有22例样本进行了tb-pcr检测，其阳性率为54.54％(12/22)，其中有18例样本同时进行了痰菌培养和tb-pcr检测，双阳性率仅为11.11％(2/18)。而使用本发明nestrpa方法检测50例临床样本，所有样本检测结果均为阳性100％(50/50)(表3)，这与临床诊断结果非常吻合。以上结果表明，本发明nestrpa灵敏度显著高于目前临床常用的痰菌培养(26.09％)和tb-pcr(54.54％)。将nestrpa阳性扩增产物进行高通量测序验证，结果显示扩增片段可与is6110基因完全匹配(图6)。

表3临床诊断为肺结核或肺结核可疑患者的nestrpa与临床检测结果比较

以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110>黄婉秋，黄健

<120>检测结核分支杆菌的引物对、探针、试剂盒及其应用

<160>6

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>652

<212>dna

<213>结核分枝杆菌（mycobacteriumtuberculosis）

<400>1

accgcgtcggctttcttcgcggccgagctcgaccggccagcacgctaattacccggttca60

tcgccgatcatcagggccaccgcgagggccccgatggtttgcggtggggtgtcgagtcga120

tctgcacacagctgaccgagctgggtgtgccgatcgccccatcgacctactacgaccaca180

tcaaccgggagcccagccgccgcgagctgcgcgatggcgaactcaaggagcacatcagcc240

gcgtccacgccgccaactacggtgtttacggtgcccgcaaagtgtggctaaccctgaacc300

gtgagggcatcgaggtggccagatgcaccgtcgaacggctgatgaccaaactcggcctgt360

ccgggaccacccgcggcaaagcccgcaggaccacgatcgctgatccggccacagcccgtc420

ccgccgatctcgtccagcgccgcttcggaccaccagcacctaaccggctgtgggtagcag480

acctcacctatgtgtcgacctgggcagggttcgcctacgtggcctttgtcaccgacgcct540

acgctcgcaggatcctgggctggcgggtcgcttccacgatggccacctccatggtcctcg600

acgcgatcgagcaagccatctggacccgccaacaagaaggcgtactcgacct652

<210>2

<211>48

<212>dna

<213>人工序列（artificial）

<220>

<221>misc_feature

<222>(31)..(31)

<223>n为i6famdt

<220>

<221>misc_feature

<222>(32)..(32)

<223>n为idsp

<220>

<221>misc_feature

<222>(33)..(33)

<223>n为ibhq1dt

<400>2

tcgacctgggcagggttcgcctacgtggccnnngtcaccgacgcctac48

<210>3

<211>35

<212>dna

<213>人工序列（artificial）

<400>3

cgccccatcgacctactacgaccacatcaaccggg35

<210>4

<211>35

<212>dna

<213>人工序列（artificial）

<400>4

tgaccaaactcggcctgtccgggaccacccgcggc35

<210>5

<211>35

<212>dna

<213>人工序列（artificial）

<400>5

accacatcaaccgggagcccagccgccgcgagctg35

<210>6

<211>35

<212>dna

<213>人工序列（artificial）

<400>6

cgaggtggccagatgcaccgtcgaacggctgatga35