一种水稻矮杆基因高效应变异检测液相芯片及其应用

70％的引物。
10.优选的，所述s3中功能标记基因型鉴定，包括如下步骤：
11.s31、dna提取及基因组定量，用ctab方法进行dna提取，提取后利用试剂盒或荧光定量pcr方法对基因组进行精确定量。
12.s32、靶区域扩增，利用0.2ml pcr管/96孔pcr板进行pcr扩增，反应体系如下：rdwfmp18μl，模板dna(≥50ng)，genoplexs 3
×
t master mix 10μ l，用超纯水补齐30μl。
13.s33、pcr产物纯化，利用genoprep dna clean beads纯化试剂盒对pcr产物进行纯化。
14.s34、第二轮pcr及pcr产物回收，对回收产物进行pcr扩增，引入与测序相应接头与barcode，在所得带有磁珠的tube管中加入pcr体系，其扩增体系为i5 barcode(10um)-mgi 1μl，i7 barcode(2um)-mgi 5μl，genoplexs 3
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t master mix 10μl，超纯水14μl，pcr扩增步骤包括：95℃ 3min热启动； 95℃ 15s，58℃ 15s，72℃ 30s，7次循环，72℃延伸4min，利用genoprep dnaclean beads纯化试剂盒对pcr产物进行纯化，对纯化产物进行dna浓度测定，产物可直接用于上机测序或置于-20℃保存。
15.s35、高通量测序及数据分析，对得到的纯化后的pcr产物进行高通量测序和数据分析，获得靶区域的基因型鉴定结果。
16.优选的，所述s32中pcr扩增包括如下步骤：
17.s321、95℃，3min热启动；95℃ 30s，60℃ 4min，进行15次循环，
18.s321、72℃延伸4min。
19.优选的，所述s33中pcr产物纯化包括如下步骤：
20.s331、向pcr反应液/酶促反应液加入0.4倍体积genoprep dna cleanbeads(30μl体系加12μl)，涡旋震荡，使扩增产物与genoprep dna cleanbeads充分混匀，室温静置5-6分钟后瞬离。
21.s332、用强力磁铁或磁力架吸附磁珠，室温静置2min此时溶液为澄清。
22.s333、用移液器小心吸取全部上清至新的ep管子/96孔板中(保留上清)，小心避免吸到磁珠。该步骤被吸附的磁珠可抛弃。
23.s334、向新的上清液中加入0.6倍原始pcr体积genoprep dna cleanbeads(30μl体系加18μl)，涡旋震荡，使扩增产物与genoprep dna cleanbeads充分混匀。室温静置5-6分钟后瞬离。
24.s335、用强力磁铁或磁力架吸附磁珠，室温静置2min此时溶液为澄清。用移液器小心吸取上清，抛弃上清，留磁珠。
25.s336、加入等pcr体积的genoplexs bw10 buffer，涡旋震荡，重悬磁珠，室温静置5-6分钟后瞬离。用磁力架吸附磁珠，直至溶液澄清为止。用移液器吸取上清，弃上清，留磁珠。
26.s337、保持pcr管处于磁力架中，加入80-100μl 80％的乙醇，室温静置 1-1.21min此时溶液为澄清。用移液器小心去除上清，避免吸到磁珠。
27.s338、室温放置，直至乙醇挥发干净。
28.优选的，表1中的所列基因及变异位点为检测的靶标位点。
29.优选的，对表1中的所列的多个变异位点同时进行基因型鉴定。
30.优选的，对表1中snp位点，选择其侧翼200bp进行引物设计和pcr扩增，所以表1中所列snp位点，上下游200bp的范围内的snp/indel均可被本发明的方法有效覆盖，以这些变异位点为目标的检测也在本发明的权利要求范围内。
31.本发明提供的一种水稻矮杆基因高效应变异检测液相芯片及其应用，通过选择目标变异，pcr引物设计及筛选和对功能标记基因型鉴定进行一次实验同步获得多个可能产生较强效应的矮杆基因变异的基因型数据，可以很方便地对大量育种材料进行基因型，有效地克服了传统分子标记技术的低效率的问题，同时，检测成本比基于常规的二代测序及高密度芯片的检测方法大大降低，此外，对变异位点通过生物信息学的方法进行了排查，选择的变异位点均为可能产生明显表型效应的位点。
附图说明
32.图1即表1 是本发明提出的一种多个水稻性状控制基因变异检测功能标记方法的步骤一中的目标变异位点选择表；
33.图2即表2是本发明提出的一种多个水稻性状控制基因变异检测功能标记方法的利用功能标记组rdwfmp1检测14个水稻亲本90个位点的基因型的实施例展示表。
具体实施方式
34.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
35.实施例1
36.一种水稻矮杆基因高效应变异检测液相芯片及其应用，包括如下步骤：
37.s1、选择目标变异，利用29份株高不同的育种材料的高通量测序数据进行了186个株高相关基因的变异分析，总共获得59个基因的90个有较强效应的snp 位点，进一步利用3000份水稻重测序建立的snp数据库对90个snp数据进行了分析，其中包含只在测序育种材料中鉴定出的snp位点19个，maf值小于0.05 的稀有snp位点14个，其余snp位点57个，具体信息见表1；
38.s2、根据变异位点在水稻日本晴参考基因组(基因组版本irgsp1.0)，提取变异位点上下游200bp的序列，按下列引物设计原则进行引物设计：引物长度 18-36bp；tm值59-64℃；gc含量15％-70％，在设计出的引物中进一步进行如下评估选择：针对设计出来的引物进行非特异性评估，然后挑出非特异性的引物；引物之间进行二聚体评估，避免二聚体的产生；针对上述两步筛选的引物，再次进行两两非特异性评估；选出最终符合要求的引物。符合要求的引物等量混合构成用于检测多个水稻矮杆基因变异的功能标记芯片，命名为rdwfmp1(rice dwarf functional marker panel1)；
39.s3、功能标记基因型鉴定
40.s31、dna提取及基因组定量，用ctab方法进行dna提取，提取后利用试剂盒或荧光定量pcr方法对基因组进行精确定量。
41.s32、靶区域扩增，利用0.2ml pcr管/96孔pcr板进行pcr扩增，反应体系如下：rdwfmp1 8μl，模板dna(≥50ng)，博锐迪公司genoplexs 3
×
t master mix 10μl，用超纯水
补齐30μl，pcr扩增程序：95℃ 3min热启动；95℃ 30 s，60℃ 4min，15个循环，72℃延伸4min。
42.s33、pcr产物纯化，利用genoprep dna clean beads纯化试剂盒对pcr产物进行纯化。
43.s331、向pcr反应液/酶促反应液加入0.4倍体积genoprep dna cleanbeads(30μl体系加12μl)，涡旋震荡，使扩增产物与genoprep dna cleanbeads充分混匀，室温静置5-6分钟后瞬离。
44.s332、用强力磁铁或磁力架吸附磁珠，室温静置2min此时溶液为澄清。
45.s333、用移液器小心吸取全部上清至新的ep管子/96孔板中(保留上清)，小心避免吸到磁珠。该步骤被吸附的磁珠可抛弃。
46.s334、向新的上清液中加入0.6倍原始pcr体积genoprep dna cleanbeads(30μl体系加18μl)，涡旋震荡，使扩增产物与genoprep dna cleanbeads充分混匀。室温静置5-5.1分钟后瞬离。
47.s335、用强力磁铁或磁力架吸附磁珠，室温静置2min此时溶液为澄清。用移液器小心吸取上清，抛弃上清，留磁珠。
48.s336、加入等pcr体积的genoplexs bw10 buffer，涡旋震荡，重悬磁珠，室温静置5-6分钟后瞬离。用磁力架吸附磁珠，直至溶液澄清为止。用移液器吸取上清，弃上清，留磁珠。
49.s337、保持pcr管处于磁力架中，加入90-100μl 80％的乙醇，室温静置 1min此时溶液为澄清。用移液器小心去除上清，避免吸到磁珠。
50.s338、室温放置，直至乙醇挥发干净。本步骤磁珠亦可放于50℃烘箱5分钟左右，快速蒸干乙醇。
51.s34、第二轮pcr及pcr产物回收，对回收产物进行pcr扩增，引入与测序相应接头与barcode。在s33所得带有磁珠的tube管中加入pcr体系。扩增体系：i5 barcode(10um)-mgi 1μl，i7 barcode(2um)-mgi 5μl，博锐迪公司 genoplexs 3
×
t master mix 10μl，超纯水14μl。pcr扩增程序：95℃ 3min 热启动；95℃ 15s，58℃ 15s，72℃ 30s，7个循环，72℃延伸4min。利用 genoprep dna clean beads纯化试剂盒对pcr产物进行纯化。对纯化产物进行 dna浓度测定，产物可直接用于上机测序或置于-20℃保存，
52.s35、高通量测序及数据分析，对上步骤中得到的纯化后的pcr产物进行高通量测序和数据分析，获得靶区域的基因型鉴定结果。
53.以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。