本发明属于食品发酵技术领域，具体涉及一种基于克拉通酵母、葡萄汁有孢汉逊酵母和酿酒酵母的组合发酵工艺。
背景技术：
葡萄酒发酵是一个复杂的生物化学过程，克拉通酵母在发酵过程中起到了非常关键的作用，例如将糖转化为乙醇、二氧化碳及其他成千上万的次生代谢产物。大量科学研究表明，葡萄酒质量高度依赖于不同克拉通酵母的代谢活动及发酵行为，不同克拉通酵母对葡萄酒的化学组成、感官特性、风味特征等具有重要贡献。酿酒酵母是迄今为止在葡萄酒工业生产中应用最广的菌种，其优点在于能够保证葡萄酒发酵过程中变质的风险，且均有很好的发酵动力，但伴随而来的问题是葡萄酒风味特征单一、同质化现象严重等问题。因此，为追求葡萄酒风格特色化，香气特点更具有代表性、多样性和复杂性，酿酒师们常采用酿酒酵母与非酿酒酵母混合发酵的方法，尤其是一些具有很强适应性和代表性的本土克拉通酵母，从而改善和提高葡萄酒风味品质。
非酿酒酵母已经成为提高葡萄酒质量的一种选择。大量研究表明，非酿酒酵母能够产生酶以及一些我们所期望的次生代谢产物，从而提高葡萄酒香气和风味特色，并且能够控制葡萄酒中一些不良菌种的生长，但缺点是发酵动力不足。将非酿酒酵母和酿酒酵母进行混合发酵既能提高葡萄酒香气多样性和复杂性，又能弥补非酿酒酵母发酵动力不足的问题，是提高葡萄酒香气品质的有效方法。
本领域目前极为罕见采用克拉通酵母saccharomycopsiscrataegensis进行发酵的相关报道，而关于将克拉通酵母saccharomycopsiscrataegensis、葡萄汁有孢汉逊酵母hanseniasporauvarum和酿酒酵母联用进行组合发酵的工艺，本领域目前更未见任何相关报道。
技术实现要素：
基于本领域的上述需求和空白，本发明提供一种基于克拉通酵母saccharomycopsiscrataegensis、葡萄汁有孢汉逊酵母hanseniasporauvarum和酿酒酵母的组合发酵工艺，相比常规的酿酒酵母发酵，在多种会影响酒饮风味的香气物质上均有十分显著的提升。
本发明的技术方案如下：
一种基于克拉通酵母和葡萄汁有孢汉逊酵母的组合发酵工艺，其特征在于，采用克拉通酵母、葡萄汁有孢汉逊酵母和酿酒酵母进行发酵。
所述克拉通酵母指克拉通酵母saccharomycopsiscrataegensis菌株yc30；所述克拉通酵母saccharomycopsiscrataegensis菌株yc30的保藏号为cctccm2021089。
所述葡萄汁有孢汉逊酵母指葡萄汁有孢汉逊酵母hanseniasporauvarum菌株qtx22；所述葡萄汁有孢汉逊酵母hanseniasporauvarum菌株qtx22的保藏号为cctccm2021083；
优选地，所述酿酒酵母为酿酒酵母菌株f33。
所述的一种底物添加氨基酸并基于克拉通酵母的发酵工艺包括下述步骤：活化菌株、活化后的菌株接入待发酵的底物进行发酵；
优选地，所述活化菌株指将菌株接种于培养基中进行培养。
所述菌株选自：克拉通酵母saccharomycopsiscrataegensis菌株yc30、葡萄汁有孢汉逊酵母hanseniasporauvarum菌株qtx22、酿酒酵母菌株f33；
优选地，所述培养温度为24-30℃，优选28℃；培养时间为20-30h，优选24h，转速为120-250rpm，优选150rpm；
优选地，所述接种指按照体积比2-4％优选3％的接种量将初始菌株保存液接种于培养基中；
优选地，所述培养基为ypd培养基；优选地，ypd培养基包括如下质量体积比的组分：0.5-3.5％优选1％的克拉通酵母浸粉、1.0-3.0％优选2％的蛋白胨、1.0-5.0％的优选2％葡萄糖，其余为水；
优选地，所述初始菌株保存液指菌株保存于体积比15-35％优选25％甘油/ypd培养基中；
更优选地，所述活化菌株进行1-3次，优选2次。
优选地，所述活化后的菌株指：活化后的克拉通酵母saccharomycopsiscrataegensis菌株yc30、或，活化后的葡萄汁有孢汉逊酵母hanseniasporauvarum菌株qtx22、或，活化后的酿酒酵母菌株f33；
优选地，所述发酵温度为18℃±2℃；
优选地，活化后的菌株在底物中的接种量为106-107cfu，优选6×106cfu；
优选地，待底物失重连续3天不再变化终止发酵；
优选地，所述底物为葡萄汁。
一种葡萄酒生产方法，其特征在于，以葡萄汁为底物，接入克拉通酵母和葡萄汁有孢汉逊酵母进行发酵。
所述克拉通酵母指克拉通酵母saccharomycopsiscrataegensis菌株yc30；所述克拉通酵母saccharomycopsiscrataegensis菌株yc30的保藏号为cctccm2021089；
优选地，所述葡萄汁有孢汉逊酵母指葡萄汁有孢汉逊酵母hanseniasporauvarum菌株qtx22；所述葡萄汁有孢汉逊酵母hanseniasporauvarum菌株qtx22的保藏号为cctccm2021083；
优选地，所述一种葡萄酒生产方法包括：活化菌株、活化后的菌株接入待发酵的底物进行发酵。
所述菌株选自：克拉通酵母saccharomycopsiscrataegensis菌株yc30、葡萄汁有孢汉逊酵母hanseniasporauvarum菌株qtx22、酿酒酵母菌株f33；
优选地，所述活化菌株指将菌株接种于培养基中进行培养；
优选地，所述培养温度为24-30℃，优选28℃；培养时间为20-30h，优选24h，转速为120-250rpm，优选150rpm；
优选地，所述接种指按照体积比3％的接种量将初始菌株保存液接种于培养基中；
优选地，所述培养基为ypd培养基；优选地，ypd培养基包括如下质量体积比的组分：0.5-3.5％优选1％的克拉通酵母浸粉、1.0-3.0％优选2％的蛋白胨、1.0-5.0％的优选2％葡萄糖，其余为水；
优选地，所述初始菌株保存液指保存于体积比15-35％优选25％甘油/ypd培养基中的菌株；
更优选地，所述活化菌株进行1-3次，优选2次；
优选地，所述活化后的菌株指：活化后的克拉通酵母saccharomycopsiscrataegensis菌株yc30、或，活化后的葡萄汁有孢汉逊酵母hanseniasporauvarum菌株qtx22、或，活化后的酿酒酵母菌株f33；
优选地，所述活化后的克拉通酵母saccharomycopsiscrataegensis菌株yc30、活化后的葡萄汁有孢汉逊酵母hanseniasporauvarum菌株qtx22、和，活化后的酿酒酵母菌株f33同时接入待发酵的底物进行发酵；
优选地，所述发酵温度为18℃±2℃；
优选地，活化后的克拉通酵母saccharomycopsiscrataegensis菌株yc30，和，活化后的葡萄汁有孢汉逊酵母hanseniasporauvarum菌株qtx22的总接入量为106-107cfu，优选6×106cfu；
优选地，待底物失重连续3天不再变化终止发酵。
所述的一种葡萄酒生产方法还包括：制备葡萄汁；
所述制备葡萄汁指：将葡萄果粒低温压榨；
优选地，将采收的葡萄果粒利用气囊压榨机进行带冰压榨；
优选地，压榨同时添加二氧化硫或k2s2o5、和，果胶酶；
优选地，二氧化硫或k2s2o5的添加量为30-100mg/l优选50mg/l；果胶酶的添加量为10-30mg/l优选20mg/l；
优选地，葡萄果粒为大小均匀的果粒；
优选地，葡萄果粒为葡萄成熟后待温度下降到连续24小时-8℃以下时采收的葡萄果粒。
一种葡萄酒，其特征在于，采用所述的葡萄酒生产方法生产得到。
本发明采用在底物中同时接种克拉通酵母saccharomycopsiscrataegensis、葡萄汁有孢汉逊酵母hanseniasporauvarum和酿酒酵母菌株f33进行组合发酵，与单独使用商业酿酒酵母发酵相比，在产生的数十种香气物质中，有很多香气物质的产量均有所提升，例如，冰醋酸提高了49％，辛酸提高了11倍，正己酸乙酯提高了12.6倍，香茅醇提高了11.5倍，辛醇提高了1倍，4-乙烯基-2-甲氧基苯酚提高了72％，棕榈酸乙酯提高了4.67倍，乙酸苯乙酯提高了10.86倍，肉豆蔻酸乙酯提高了25.8％；1,3-丙二醇单乙醚提高了36倍，苯甲醇提高了1.58倍，芳樟醇提高了41.8％，9-癸烯酸提高了9倍，己酸提高了2倍，2,4-二叔丁基苯酚提高了8.64倍，乙酸乙酯提高了8.1倍，2-甲基丁酸提高了12.4倍，丁二酸二乙酯提高了17.3倍，乳酸乙酯提高了32倍，α-松油醇提高了18％，2-乙基己醇提高了1.58倍；本发明的组合发酵工艺同时还产生了单独使用商业酿酒酵母发酵无法产生的香气物质，例如：异丁酸乙酯、里哪醇、2-糠酸乙酯、辛酸异戊酯、丁酸、3-羟基-2-丁酮、(2s-顺)-四氢化-4-甲基-2-(2-甲基-1-丙烯基)-2h-吡喃、1-癸醇、异戊醛、十二醇、反式-3-己烯-1-醇、3-苯丙酸乙酯。上述这些香气物质的产生或它们的产量的提升均会给发酵所得饮品的风味、香气产生一定的影响，使混菌发酵产品呈现出相比单菌发酵产品更为独特的香味，可生产出一款独特风味、香气、口感的酒饮，充实消费品类，扩大消费选择。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明的详细内容做进一步具体说明，但并不以此限制本发明的保护范围。
生物材料的来源及记载出处
实验例中使用的克拉通酵母saccharomycopsiscrataegensis菌株yc30为申请人实验室筛选出的新菌株，保藏信息如下：
命名：yc30
分类名称：克拉通酵母
拉丁名称：saccharomycopsiscrataegensis
保藏号：cctccm2021089
保藏机构：中国典型培养物保藏中心
保藏日期：2021年1月15日；
实验例中使用的葡萄汁有孢汉逊酵母hanseniasporauvarum菌株qtx22为申请人实验室筛选出的新菌株，保藏信息如下：
命名：qtx22
分类名称：葡萄汁有孢汉逊酵母
拉丁名称：hanseniasporauvarum
保藏号：cctccm2021083
保藏机构：中国典型培养物保藏中心
保藏日期：2021年1月15日；
酿酒酵母f33为商业菌株，购自法国拉氟德(laffort)公司。
使用的葡萄品种为威代尔冰葡萄，购自宁夏巴格斯醉美国际酒庄有限公司。
第1组实施例、本发明的底物添加氨基酸发酵工艺
本组实施例提供一种基于克拉通酵母和葡萄汁有孢汉逊酵母的组合发酵工艺。本组所有的实施例都具备如下共同特征：采用克拉通酵母、葡萄汁有孢汉逊酵母和酿酒酵母进行发酵。
本领域技术人员可根据本发明的启示，任何采用克拉通酵母、葡萄汁有孢汉逊酵母和酿酒酵母进行发酵、生产的行为均落入本发明的保护范围。发酵的目标产品包括但不限于：酒饮、乳制品、面制品等。
所述乳制品包括但不限于酸奶、发酵乳、乳饮料等；所述面制品包括但不限于：面包、蛋糕、包子、馒头、花卷等。
在优选的实施例中，所述克拉通酵母指克拉通酵母saccharomycopsiscrataegensis菌株yc30；所述克拉通酵母saccharomycopsiscrataegensis菌株yc30的保藏号为cctccm2021089。
在另一些实施例中，所述葡萄汁有孢汉逊酵母指葡萄汁有孢汉逊酵母hanseniasporauvarum菌株qtx22；所述葡萄汁有孢汉逊酵母hanseniasporauvarum菌株qtx22的保藏号为cctccm2021083。
在一些优选的实施例中，所述酿酒酵母指酿酒酵母菌株f33，可商购获得。
在进一步的实施例中，所述的一种底物添加氨基酸并基于克拉通酵母的发酵工艺包括下述步骤：活化菌株、活化后的菌株接入待发酵的底物进行发酵；
优选地，所述活化菌株指将菌株接种于培养基中进行培养；
在优选的实施例中，所述菌株选自：克拉通酵母saccharomycopsiscrataegensis菌株yc30、葡萄汁有孢汉逊酵母hanseniasporauvarum菌株qtx22、酿酒酵母菌株f33；
本发明不仅验证了克拉通酵母saccharomycopsiscrataegensis菌株、葡萄汁有孢汉逊酵母hanseniasporauvarum菌株和酿酒酵母菌株组合发酵效果，还同时验证了商业酿酒酵母菌株单菌发酵的效果，相比商业酿酒酵母菌株进行单菌发酵，本发明克拉通酵母saccharomycopsiscrataegensis菌株和葡萄汁有孢汉逊酵母hanseniasporauvarum菌株组合发酵能获得更高的香气物质产量，因此，本领域技术人员可根据本发明的启示，可选用其他商业菌株与克拉通酵母saccharomycopsiscrataegensis菌株和葡萄汁有孢汉逊酵母hanseniasporauvarum菌株联用进行组合发酵，除f33外，目前市面上还存在多种商业菌株，例如，saccharomycescerevisiaev1116、saccharomycescerevisiaevl1、saccharomycescerevisiaex16、saccharomycescerevisiaest等，这些菌株都可用来接种于添加了氨基酸的底物中进行发酵，获得与本发明类似的技术效果是可预期的。
优选地，所述培养温度为24-30℃，优选28℃；培养时间为20-30h，优选24h，转速为120-250rpm，优选150rpm；
优选地，所述接种指按照体积比2-4％优选3％的接种量将初始菌株保存液接种于培养基中；
优选地，所述培养基为ypd培养基；优选地，ypd培养基包括如下质量体积比的组分：0.5-3.5％优选1％的克拉通酵母浸粉、1.0-3.0％优选2％的蛋白胨、1.0-5.0％的优选2％葡萄糖，其余为水；
优选地，所述初始菌株保存液指菌株保存于体积比15-35％优选25％甘油/ypd培养基中；
更优选地，所述活化菌株进行1-3次，优选2次。
优选地，所述活化后的菌株指：活化后的克拉通酵母saccharomycopsiscrataegensis菌株yc30、或，活化后的葡萄汁有孢汉逊酵母hanseniasporauvarum菌株qtx22、或，活化后的酿酒酵母菌株f33；
优选地，所述发酵温度为18℃±2℃；
优选地，活化后的菌株在底物中的接种量为106-107cfu，优选6×106cfu；
优选地，待底物失重连续3天不再变化终止发酵；
优选地，所述底物为葡萄汁。
第2组实施例、本发明的葡萄酒生产方法
本组实施例提供一种葡萄酒生产方法。本组实施例都具备如下共同特征：以葡萄汁为底物，接入克拉通酵母、葡萄汁有孢汉逊酵母和酿酒酵母进行发酵。
在优选的实施例中，所述克拉通酵母指克拉通酵母saccharomycopsiscrataegensis菌株yc30；所述克拉通酵母saccharomycopsiscrataegensis菌株yc30的保藏号为cctccm2021089。
在另一些实施例中，所述葡萄汁有孢汉逊酵母指葡萄汁有孢汉逊酵母hanseniasporauvarum菌株qtx22；所述葡萄汁有孢汉逊酵母hanseniasporauvarum菌株qtx22的保藏号为cctccm2021083。
在一些优选的实施例中，所述酿酒酵母指酿酒酵母菌株f33。
在另一些实施例里，所述的一种葡萄酒生产方法包括：在葡萄汁中添加氨基酸、活化菌株、活化后的菌株接入代发酵的底物进行发酵；
在一些实施例中，所述菌株选自：克拉通酵母saccharomycopsiscrataegensis菌株yc30、葡萄汁有孢汉逊酵母hanseniasporauvarum菌株qtx22、酿酒酵母菌株f33；
优选地，所述活化菌株指将菌株接种于培养基中进行培养；
优选地，所述培养温度为24-30℃，优选28℃；培养时间为20-30h，优选24h，转速为120-250rpm，优选150rpm；
优选地，所述接种指按照体积比3％的接种量将初始菌株保存液接种于培养基中；
优选地，所述培养基为ypd培养基；优选地，ypd培养基包括如下质量体积比的组分：0.5-3.5％优选1％的克拉通酵母浸粉、1.0-3.0％优选2％的蛋白胨、1.0-5.0％的优选2％葡萄糖，其余为水；
优选地，所述初始菌株保存液指保存于体积比15-35％优选25％甘油/ypd培养基中的菌株；
更优选地，所述活化菌株进行1-3次，优选2次；
优选地，所述活化后的菌株指：活化后的克拉通酵母saccharomycopsiscrataegensis菌株yc30、或，活化后的酿酒酵母菌株f33、或，活化后的葡萄汁有孢汉逊酵母hanseniasporauvarum菌株qtx22；
优选地，所述发酵温度为18℃±2℃；
优选地，活化后的克拉通酵母saccharomycopsiscrataegensis菌株yc30、和，活化后的葡萄汁有孢汉逊酵母hanseniasporauvarum菌株qtx22、和，活化后的酿酒酵母菌株f33的总接入量为106-107cfu，优选6×106cfu；
优选地，待底物失重连续3天不再变化终止发酵。
在进一步的实施例中，所述的一种葡萄酒生产方法还包括：制备葡萄汁；
所述制备葡萄汁指：将葡萄果粒低温压榨；
优选地，将采收的葡萄果粒利用气囊压榨机进行带冰压榨；
优选地，压榨同时添加二氧化硫或k2s2o5、和，果胶酶；
优选地，二氧化硫或k2s2o5的添加量为30-100mg/l优选50mg/l；果胶酶的添加量为10-30mg/l优选20mg/l；
优选地，葡萄果粒为大小均匀的果粒；
优选地，葡萄果粒为葡萄成熟后待温度下降到连续24小时-8℃以下时采收的葡萄果粒。
第3组实施例、本发明的葡萄酒
本组实施例提供一种葡萄酒。本组所有的实施例都具备如下共同特征：采用第2组实施例任一项所述的葡萄酒生产方法生产得到。
本发明的葡萄酒产生下述单菌发酵的葡萄酒无法产生的香气物质：异丁酸乙酯、里哪醇、2-糠酸乙酯、辛酸异戊酯、丁酸、3-羟基-2-丁酮、(2s-顺)-四氢化-4-甲基-2-(2-甲基-1-丙烯基)-2h-吡喃、1-癸醇、异戊醛、十二醇、反式-3-己烯-1-醇、3-苯丙酸乙酯。
实验例、本发明的混菌发酵工艺及发酵数据
1.菌株
本试验采用的菌株为：商业酿酒酵母s.cerevisiaef33、本发明分离筛选的克拉通酵母saccharomycopsiscrataegensis菌株yc30、葡萄汁有孢汉逊酵母hanseniasporauvarum菌株qtx22。
2.葡萄汁
威代尔冰葡萄原料种植于宁夏省银川市永宁县玉泉营，宁夏巴格斯醉美国际酒庄有限公司(e106.02°，n38.24°)。葡萄树种植于2013年，采用小棚架栽培，株行距为1.0m×2.0m，本试验于2017年采收，葡萄成熟后不采摘，待温度下降到连续24小时-8℃以下时采摘，去除小次果粒，随机选择大小一致的冰葡萄果实低温压榨。对采收后的冰葡萄通过气囊压榨机进行带冰压榨操作，同时添加二氧化硫(50mg/lk2s2o5)和20mg/l果胶酶(≥500u/mg)，抑制细菌并提高出汁率。压榨得到的葡萄汁含糖量432g/dm3，酸度4.65g/dm3(酒石酸)，ph为4.21。
3.发酵操作
3种菌株：酿酒酵母s.cerevisiaef33菌株、克拉通酵母saccharomycopsiscrataegensis菌株yc30、葡萄汁有孢汉逊酵母hanseniasporauvarum菌株qtx22在使用前均保存于体积比25％甘油/ypd培养基中。ypd培养基为1％克拉通酵母浸粉、2％蛋白胨、2％葡萄糖。按照体积比3％的接种量分别接种于装有40mlypd培养基的50ml三角瓶中和装有150mlypd培养基的250ml三角瓶中，培养温度为28℃,转速为150rpm，培养时间为24h，得到第1次活化的菌液，再按照3％的接种量分别接种于装有40mlypd培养基的50ml三角瓶中和装有150mlypd培养基的250ml三角瓶中重复上述培养，完成第2次传代活化，即得到活化后的菌液。将活化后的克拉通酵母saccharomycopsiscrataegensis菌株yc30、活化后的葡萄汁有孢汉逊酵母hanseniasporauvarum菌株qtx22、活化后的酿酒酵母菌株f33同时接入已收集好的葡萄汁中，菌株的总接种量控制在6×106cfu，以s.cerevisiaef33纯发酵的葡萄汁为空白对照，发酵温度为18℃±2℃，待葡萄汁失重连续三天不再变化终止发酵。所有葡萄酒样品在7500rpm下离心8分钟，取上清液于4℃保存。
克拉通酵母saccharomycopsiscrataegensis菌株yc30、葡萄汁有孢汉逊酵母hanseniasporauvarum菌株qtx22和酿酒酵母菌株f33组合发酵做3次平行发酵处理，s.cerevisiaef33单菌发酵做3次平行发酵处理。
4.香气物质的定量方法
采用顶空-固相微萃取法-气相质谱法(hs-spme-gc/ms)。准确量取8ml葡萄酒样品加入含有1.5gnacl顶空瓶中，同时394.08μg/l4-甲基-1-戊醇(内标物)，加盖密封。插入car/dvb/pdms萃取纤维，45℃下吸附30min后将萃取纤维在gc进样口250℃下解吸3min，进行gc-ms分析。色谱柱：inertcapwax极性色谱柱(60m×0.25mm，0.25μm)；升温程序为：40℃保持5min，以3℃/min升至120℃，再以8℃/min升至230℃，保持10min；载气(he)流速0.8ml/min，不分流。电子轰击离子源；电子能量70ev；传输线温度275℃；离子源温度230℃；激活电压1.5v；灯丝流量0.25ma；质量扫描范围m/z33～450。采用外标定量法进行化合物定量分析。
5.数据分析方法
上述第3部分所述的每个平行发酵处理所得的发酵产物做为不同的样品分别测定香气物质含量，每个样品均分别平行测定3次取平均值。使用spss22.0forwindows(spssinc.，chicago,il,us)进行单因素方差分析(anova)和duncan`s多范围检验(p<0.05)；unscrambler9.7(camoasa,norway)进行偏最小二乘法分析。
最终统计整理得到下表1，表中数据的单位为μg/l，含义：每升葡萄酒中该香气物质的含量。
表1、葡萄汁发酵产物的香气物质含量
上表1中的香气阈值指人类可以嗅闻到该物质的最低浓度下限值，香气描述和阈值均以记载有该类香气物质的香气描述和阈值的相关文献报道为准，表中无香气描述和阈值的香气物质则是未检索到有关该物质的香气描述和阈值的相关记载的文献。表头中的各标记含义列示如下：
sc+f33+hu：克拉通酵母saccharomycopsiscrataegensis菌株yc30、葡萄汁有孢汉逊酵母hanseniasporauvarum菌株qtx22和酿酒酵母菌株f33组合发酵的3次平行发酵处理所得发酵产物分别测定香气物质含量的平均值；
f33：s.cerevisiaef33单菌发酵做3次平行发酵处理所得发酵产物分别测定香气物质含量的平均值。
发酵领域公知，影响发酵的因素众多且复杂，发酵后的产品成分会因原料批次、原料成分、发酵条件、温度、时间等因素的变化而变化，因此也会出现在某些香气成分上单菌发酵高于添加氨基酸发酵的情况，这在本领域属正常现象。