一株能够调控肠道阿克曼菌属相对丰度的普通拟杆菌

本发明涉及一株能够调控肠道阿克曼菌属相对丰度的普通拟杆菌，属于微生物技术领域。

背景技术：

阿克曼菌属(akkermansia)作为下一代益生菌之一，已经被证明是与人类健康和疾病紧密相关的一类菌株。根据以前的报道，它有助于缓解疾病，增强人体免疫力，甚至增强对癌症的抑制，表明阿克曼菌属与宿主之间存在复杂的关系。值得注意的是，其中一些功能与人类肠道内阿克曼菌的生态分布以及丰度有关。例如，一些研究发现肥胖儿童中嗜黏蛋白阿克曼菌(akkermansiamuciniphila)丰度显著低于健康儿童肠道，且嗜黏蛋白阿克曼菌的定植可以有效减少体内脂肪堆积、降低体重。此外，与健康人群相比，嗜黏蛋白阿克曼菌在炎症性肠病(ibd)患者、急性阑尾炎患者肠道中的丰度低于健康人肠道。因此，调节阿克曼菌属在肠道中的丰度对于调节其与机体健康和疾病方面的作用可以起到一定的推动作用。

近年来，随着研究的不断深入，特别是动物实验的出现及不断普及，使得大量的研究发现可以调节阿克曼菌属丰度的方法。例如，2018年的一篇论文报道，一种临床药品牛磺酸熊去氧胆酸的摄入可以显著提高小鼠肠道内阿克曼菌的丰度。而一些植物提取物也显示出了对于阿克曼菌丰度的调节能力，例如白藜芦醇的摄入会使阿克曼菌的相对丰度降低。除此以外，近年来也有研究证明了拟杆菌摄入对于阿克曼菌丰度的影响。例如，everard等学者在2013年发表的一篇文献证明补充多形拟杆菌(bacteroidesthetaiotaomicron)可以显著改变嗜黏蛋白阿克曼菌丰度。此外，最近的一篇专利表明脆弱拟杆菌(bacteroidesfragilis)的摄入可以显著提高阿克曼菌属的丰度(见公布号：cn111635874a)。这些数据表明了不同拟杆菌种的摄入对于调节阿克曼菌的丰度具有显著的作用。然而，目前关于这方面的研究还局限于非常有限的一些拟杆菌种(如脆弱拟杆菌和多形拟杆菌)，对于包括普通拟杆菌在内的其他拟杆菌种的研究还处于空白状态。

技术实现要素：

[技术问题]

目前关于普通拟杆菌在内的其他拟杆菌对肠道中阿克曼菌种的丰度调节的研究及应用仍处于空白状态，需筛选一株能够调节阿克曼菌属丰度的普通拟杆菌(bacteroidesvulgatus)。

[技术方案]

为解决本发明的技术问题，本发明提供了一株普通拟杆菌(bacteroidesvulgatus)ccfm1153，已于2020年11日9日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为gdmccno:61281，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。

所述普通拟杆菌ccfm1153是从来源于天津市河东区蝶桥公寓一位23岁青年男子粪便样本中分离得到的，该菌株经测序分析，其16srdna序列如seqidno.1所示，将测序得到的序列在ncbi中进行核酸序列比对，结果显示菌株为普通拟杆菌，命名为普通拟杆菌(bacteroidesvulgatus)ccfm1153。

所述普通拟杆菌ccfm1153的菌体特征为：革兰氏染色阴性杆状细菌，无芽孢形成。

所述普通拟杆菌ccfm1153的菌落特征：直径在0.3～2mm之间，正面形态圆形，侧面形态呈凸起状，边缘整齐，乳白色，不透明，表面湿润光滑。

所述普通拟杆菌ccfm1153的生长特性：严格厌氧，对氧气敏感，在温度30～37℃生长最佳，最适初始生长ph为7.0。

本发明还提供了一种用于预防和/或治疗炎症的产品，所述产品含有上述普通拟杆菌ccfm1153。

在本发明的一种实施方式中，所述产品中，上述普通拟杆菌ccfm1153的活菌数不低于1×10⁶cfu/ml或1×10⁶cfu/g。

在本发明的一种实施方式中，所述产品包含食品、药品或保健品。

本发明的一种实施方式中，所述药品含有上述普通拟杆菌ccfm1153、药物载体和/或药用辅料。

本发明的一种实施方式中，所述药物载体包含微囊、微球、纳米粒和/或脂质体。

本发明的一种实施方式中，所述药用辅料包含填充剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、润滑剂和/或矫味剂。

在本发明的一种实施方式中，所述填充剂为淀粉、蔗糖、乳糖、硫酸钙和/或微晶纤维素。

在本发明的一种实施方式中，所述粘合剂为纤维素衍生物、藻酸盐、明胶和/或聚乙烯吡咯烷酮。

在本发明的一种实施方式中，所述润湿剂为水、乙醇、淀粉和/或糖浆。

在本发明的一种实施方式中，所述崩解剂为羧甲基淀粉钠、羧丙纤维素、交联羧甲基纤维素、琼脂、碳酸钙和/或碳酸氢钠。

在本发明的一种实施方式中，所述润滑剂为滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁、微粉硅胶和/或聚乙二醇。

在本发明的一种实施方式中，所述矫味剂为单糖浆、蔗糖、卵磷脂、橙皮糖浆、樱桃糖浆、柠檬、茴香、薄荷油、海藻酸钠、阿拉伯胶、明胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、柠檬酸、酒石酸和/或碳酸氢钠。

本发明的一种实施方式中，所述药品的剂型为粉剂、颗粒剂、胶囊剂、片剂、丸剂或口服液。

有益效果：

1、本发明筛选出了一株普通拟杆菌(bacteroidesvulgatus)ccfm1153，其具有调节阿克曼菌株丰度的作用，能显著提高小鼠肠道中阿克曼氏菌属的相对丰度，因此，普通拟杆菌ccfm1153在制备调节阿克曼氏菌株丰度进而预防和/或治疗相关疾病的产品(如食品或药品等)中，具有巨大的应用前景。

2、普通拟杆菌(bacteroidesvulgatus)是下一代益生菌的一种。本发明的普通拟杆菌有效成分为普通拟杆菌ccfm1153。

生物材料保藏

一株普通拟杆菌(bacteroidesvulgatus)ccfm1153，分类学命名为bacteroidesvulgatus，已于2020年11日9日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为gdmccno:61281，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。

附图说明

图1.四株普通拟杆菌对炎症小鼠肠道中阿克曼氏菌属相对丰度的影响。(*表示p<0.05；**表示p<0.01；***表示p<0.001；****表示p<0.0001；n.s.表示没有显著性差异(p>0.05)。)

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图对本发明进行进一步的阐述。

下述实施例中涉及的脑心浸液购自青岛海博生物技术有限公司；下述实施例中涉及的fastdnaspinkitforfeces试剂盒购自mpbiomedicals公司。

下述实施例中涉及的培养基如下：

拟杆菌特异性筛选培养基：43.1g布氏培养基粉末均匀溶于1l水后，加入0.01‰的氯化血红素及0.01‰的维生素k1，121℃灭菌15min。待降温至50℃时，加0.1‰的卡那霉素、0.0075‰的万古霉素及5％的绵羊血后，混匀倒入无菌的培养皿中。

bhi液体培养基：脑心浸液中加入半胱氨酸盐酸盐1g/l、氯化血红素0.01g/l和维生素k10.002g/l，ph为7.0。

bhi固体培养基：脑心浸液中加入半胱氨酸盐酸盐1g/l、氯化血红素0.01g/l和维生素k10.002g/l、琼脂20g/l，ph为7.0。

下述实施例中涉及的普通拟杆菌菌悬液的制备方法如下：

将普通拟杆菌划线于bhi固体培养基上，37℃条件下培养48h，得到单菌落；挑取单菌落接种于bhi液体培养基中，37℃条件下培养18h进行活化，连续活化两代，得到活化液；将活化液按2％(v/v)的接种量接种于bhi液体培养基中，37℃条件下培养18h，得到菌液；将菌液经8000g离心10min，得到普通拟杆菌菌体；将普通拟杆菌菌体经生理盐水洗涤后重悬于浓度为200g/l的甘油溶液(含1g/l半胱氨酸盐酸盐)中至菌浓度为1×10¹⁰cfu/ml，得到菌悬液，将菌悬液于-80℃下保存待用。

实施例1：普通拟杆菌ccfm1153的分离筛选

1、样品采集

采集天津市河东区蝶桥公寓一位23岁青年男子粪便样本，样本置于装有30％甘油的大便管中，保存于装有冰袋的保温盒中，带回实验室后迅速置于-80℃冰箱待分离筛选。

2、菌株的分离纯化

(1)稀释涂布：取0.5g左右的保存于30％甘油的内容物在无菌环境下加入装有4.5ml生理盐水的10ml离心管中，得到10^-1稀释液，重复上述稀释步骤，依次得到10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6稀释液；

(2)涂布培养：分别吸取100μl步骤(1)中10^-4、10^-5、10^-6三个梯度稀释液于拟杆菌特异性筛选培养基上，用涂布棒涂布均匀，至37℃厌氧条件下培养48h，得到稀释涂布平板；

(3)一级纯化培养：取步骤(2)中菌落数在30～300区间的稀释涂布平板，每个样本随机挑选10个乳白色或白色，表面光滑，边缘整齐，大小不一的单菌落在bhi固体培养基上划线，放至37℃厌氧条件下培养48h，得到单菌落；

(4)二级纯化培养：取步骤(3)划线平板上单菌落分别接种于bhi液体培养基中，至37℃厌氧条件下培养20h，得到二级纯化培养液。

3、菌种保藏与鉴定

(1)菌种保藏：

将步骤2(4)获得的二级纯化培养液混匀，分别取菌体至2ml干净的菌种保藏管，平行5份，其中4份加入750μl菌液和750μl60％甘油重悬，静止30分钟后放入-80℃冰箱；1份加入1ml菌液用于菌种鉴定，6000r/min离心3min，弃上清得菌体。

(2)菌种鉴定：

步骤(1)用于菌种鉴定的保藏管中加入1ml无菌水吹打洗菌体后，10000r/min离心1min，弃上清得菌体，加入500μl无菌水重悬，作为菌液模板；

其中，16srdnapcr的体系和引物分别见表1和表2；

16srdnapcr的条件：第一步：94℃，5min第二步：94℃，30s第三步：55℃，30s，第四步：72℃，2min，第五步：72℃，10min，第二到四步进行30个循环。

表1细菌菌种鉴定25μl16srdnapcr反应体系

表2引物名称

pcr产物经核酸电泳分析确认后，送华大基因测序；将测序返回的27f和1492r拼接序列上传到ncbi的blast(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)进行种属确认；比对结果发现编号为ccfm1153菌株为普通拟杆菌株(bacteroidesvulgatus)，其16srdna扩增序列如seqidno.1所示。

实施例2：普通拟杆菌ccfm1153对小鼠肠道菌群组成的影响

具体步骤如下：

1、普通拟杆菌ccfm1153灌胃液的制备

将实施例1步骤2获得的普通拟杆菌ccfm1153划线于bhi固体培养基中，37℃厌氧条件下培养48h，得到单菌落；挑取bhi固体培养基上的单菌落接种于bhi液体培养基中，37℃厌氧条件下富集培养18～20h进行活化，连续活化两代，得到活化培养物；将活化培养物按2％～5％(v/v)的接种量接种于bhi液体培养基中，37℃厌氧条件下富集培养18～20h得到菌液，经8000g离心10min得到菌泥，用无菌生理盐水洗涤3次后收集菌泥，将收集得到的上述菌泥用无菌30％甘油溶液重悬得到普通拟杆菌ccfm1153悬浮液，用作工作发酵剂，放置于-20％保藏。实验之前取普通拟杆菌ccfm1153悬浮液离心，用0.85％无菌生理盐水(不含半胱氨酸盐酸盐)洗涤重悬，得到普通拟杆菌ccfm1153灌胃液(1×10¹⁰cfu/ml)。参照同样的方法获得同批次筛选到的普通拟杆菌ccfm1152、fsdlz51k1和fsdta11b14灌胃液。空白组和造模组每天灌胃与普通拟杆菌实验组同等剂量的无菌生理盐水(不含半胱氨酸盐酸盐)。

2、实验动物

spf级8周龄雄性balb/c小鼠，购于上海斯莱克有限公司；饲养于25±2℃、相对湿50±5％、12h光照12h黑暗的标准化实验室中，适应性喂养一周后开始实验。

3、实验方法

取6-8周龄健康雌性c57小鼠72只，随机分为6组，每组12只，6组分别为：造模组、空白组和普通拟杆菌ccfm1153、ccfm1152、fsdlz51k1和fsdta11b14干预组。

造模组和空白组小鼠按照0.1ml的剂量每天灌胃一次浓度为200g/l的甘油溶液(含1g/l半胱氨酸盐酸盐)，ccfm1152和ccfm1153、fsdlz51k1和fsdta11b14干预组小鼠按照0.1ml的剂量每天灌胃一次步骤1获得的灌胃液，共灌胃7天；实验第8天，按照200μl的剂量给造模组和干预组小鼠腹腔注射由生理盐水稀释的内毒素溶液(10μg/200μl)，注射2h后，取血并处死每组一半的小鼠(6只)，注射24h后，收集每组小鼠的粪便，处死每组另一半的小鼠(6只)。

采用fastdnaspinkitforfeces试剂盒提取每组小鼠粪便细菌宏基因组后，对16sv3-v4区序列进行pcr扩增后，通过二代测序仪粪便样品中肠道菌群的组成差异。

如图1所示，阿克曼菌属被认为是与免疫调节相关的有益菌，空白组小鼠肠道中阿克曼菌属的丰度为0.4％，造模组小鼠肠道中阿克曼菌属的丰度为3.6％，经过普通拟杆菌ccfm1153干预的炎症小鼠肠道中阿克曼菌属的丰度为13.59％，是空白组的34倍，是普通拟杆菌ccfm1152干预组的1.2倍；同批筛选到的fsdlz51k1和fsdta11b14干预的炎症小鼠肠道中阿克曼菌属含量显著低于普通拟杆菌ccfm1153干预组。

可见，普通拟杆菌ccfm1153能够改善肠道菌群结构，增加肠道中有益菌阿克曼菌属的相对丰度。

实施例3：普通拟杆菌ccfm1153的应用

普通拟杆菌ccfm1153可用于制备胶囊制品，胶囊制品的具体制备过程如下：

普通拟杆菌ccfm1153划线于bhi固体培养基上，37℃条件下培养48h，得到单菌落；挑取单菌落接种于bhi液体培养基中，37℃条件下培养18h进行活化，连续活化两代，得到活化液；将活化液按2％(v/v)的接种量接种于bhi液体培养基中，37℃条件下培养18h，得到菌液；将菌液经8000g离心10min，得到菌泥；将菌泥用生理盐水清洗3次后用保护剂重悬至浓度为1×10⁷cfu/ml，得到菌悬液；菌悬液添加至浓度为30g/l的海藻酸钠溶液中至浓度为1×10⁶cfu/ml后，充分搅拌，使得普通拟杆菌ccfm1153的细胞均匀地分散于海藻酸钠溶液中，得到混合液；将混合液挤压到浓度为20g/l的氯化钙溶液中形成胶粒；待形成的胶粒静止固化30min后，过滤收集胶粒；将收集得到的胶粒进行冷冻干燥48h，得到粉剂；将粉剂装入到药用胶囊中，得到胶囊制品。

保护剂的成分包含：100g/l脱脂奶粉、30ml/l甘油、100g/l麦芽糊精、150g/l海藻糖和10g/ll-谷氨酸钠。

实施例4：普通拟杆菌ccfm1153的应用

普通拟杆菌ccfm1153可用于制备片剂，片剂的具体制备过程如下：

普通拟杆菌ccfm1153划线于bhi固体培养基上，37℃条件下培养48h，得到单菌落；挑取单菌落接种于bhi液体培养基中，37℃条件下培养18h进行活化，连续活化两代，得到活化液；将活化液按2％(v/v)的接种量接种于bhi液体培养基中，37℃条件下培养18h，得到菌液；将菌液经8000g离心10min，得到菌泥；将菌泥用生理盐水清洗3次后用保护剂重悬至浓度为1×10¹⁰cfu/ml，得到菌悬液；将菌悬液在温度37℃下预培养60min后冻干，得到普通拟杆菌ccfm1153菌粉；

其中，所述保护剂为浓度为130g/l的脱脂奶粉溶液。称取普通拟杆菌ccfm1153菌粉25.7重量份、淀粉55.0重量份、纤维素衍生物4.5重量份、羧甲基淀粉钠12.0重量份、滑石粉0.8重量份、蔗糖1.0重量份与水1.0重量份，得到原材料；将原材料混合，得到湿颗粒；将湿颗粒用中南制药机械厂的压片机进行压片后使用青州市益康中药机械有限公司的小型药物干燥机进行干燥，得到片剂。

保护剂的成分包含：100g/l脱脂奶粉、30ml/l甘油、100g/l麦芽糊精、150g/l海藻糖和10g/ll-谷氨酸钠。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

sequencelisting

<110>江南大学

<120>一株能够调控肠道阿克曼菌属相对丰度的普通拟杆菌

<130>baa210320a

<160>1

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>1396

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

cgctcctcgcggttacgcacttcaggtacccccggctcccatggcttgacgggcggtgtg60

tacaaggcccgggaacgtattcaccgcgccgtggctgatgcgcgattactagcgaatcca120

gcttcgtggagtcgggttgcagactccagtccgaactgagagaggttttggggattggca180

tccactcgcgtggtagcggccctctgtaccccccattgtaacacgtgtgtagccccggac240

gtaagggccgtgctgatttgacgtcatccccaccttcctcacatcttacgatggcagtct300

tgtcagagtcctcagcggaacctgttagtaactgacaacaagggttgcgctcgttatggc360

acttaagccgacacctcacggcacgagctgacgacaaccatgcagcaccttcacagatgc420

cttgcggcttacggctttcaccgtaattcatctgcaatttaagcccgggtaaggttcctc480

gcgtatcatcgaattaaaccacatgttcctccgcttgtgcgggcccccgtcaattccttt540

gagtttcaccgttgccggcgtactccccaggtggaatacttaacgctttcgcttggccgc600

ttgctgtatatcgcaaacagcgagtattcatcgtttaccgtgtggactaccagggtatct660

aatcctgtttgatacccacactttcgagcctcaatgtcagttgcagcttagcaggctgcc720

ttcgcaatcggagttcttcgtgatatctaagcatttcaccgctacaccacgaattccgcc780

tgcctcaactgcactcaagatatccagtatcaactgcaattttacggttgagccgcaaac840

tttcacaactgacttaaacatccatctacgctccctttaaacccaataaatccggataac900

gctcggatcctccgtattaccgcggctgctggcacggagttagccgatccttattcataa960

agtacatgcaaacgggtattcatacccgactttattcctttataaaagaagtttacaacc1020

catagggcagtcatccttcacgctacttggctggttcaggctctcgcccattgaccaata1080

ttcctcactgctgcctcccgtaggagtttggaccgtgtctcagttccaatgtgggggacc1140

ttcctctcagaacccctatccatcgaagactaggtgggccgttaccccgcctactatcta1200

atggaacgcatccccatcgtctaccggaaaacctttaatcatgtgaacatgtggactcat1260

gatgccatcttgtattaatcttcctttcagaaggctgtccaagagtagacggcaggttgg1320

atacgtgttactcacccgtgcgccggtcgccatcggccttagcaagctaagaccatgctg1380

cccctcgactgcattg1396