本发明属于分子生物学检测技术领域，具体地，本发明涉及一种人类脓毒症病原体的检测试剂盒以及相应检测方法。
背景技术：
脓毒症(sepsis)是感染引起宿主反应失调，导致危及生命的器官功能损害的症候群，是一个高病死率的临床综合征。脓毒症不仅严重威胁人类健康，也给医疗卫生带来了巨大的经济负担。我国相关研究中脓毒症的病死率高于发达国家。一项基于人口的脓毒症流行病学调查发现，2015年全国有1025997例患者死于脓毒症，占总病死率的12.6％。另一项对2006-2016年的759例严重脓毒症患者单中心回顾性研究数据显示的病死率也高达36.6％。
2018年5月，中国急诊专家提出开展“中国预防脓毒症行动(preventingsepsiscampaigninchina，pscc)”，主张对脓毒症要做到“早预防、早发现、早干预，降低脓毒症的发生率和病死率”的“三早两降”方针，提出了“脓毒症前状态”和脓毒症“未病先防，既病防传”的防治理念。将预防脓毒症发生和阻断脓毒症进展作为行动的关键节点；把切断感染发展为器官功能衰竭的中间环节，做好围脓毒症期的感染控制、炎症调控、内皮细胞保护剂凝血调节作为切入点。由于严重感染患者往往首诊于急诊科，故从急诊开始采取措施预防脓毒症的发生不仅重要，而且可行。感染性疾病是急诊科最常见疾病，是脓毒症发生的前提。及时确定急性感染患者，并给予合理治疗是预防脓毒症行动的第一个环节。由于感染性疾病表现的多样性，判断患者是否存在感染也成为急诊科医生面临的第一难题。引起急性感染的病原体，包括细菌、病毒、真菌、支原体或衣原体、寄生虫等。导致脓毒症的病原体主要为细菌、病毒和真菌。尽快确定病原体，并采取针对性抗微生物治疗是治疗感染性疾病的重点。
目前，对于脓毒症病原学的诊断方法主要包括：(1)血培养：血培养结果阳性是诊断脓毒症的“金标准”，但并非所有脓毒症患者都有引起感染的病原微生物的阳性血培养结果，仅约45％的脓毒性休克患者可获得阳性血培养结果。同时，血培养阳性率会受到例如采血量、采血时间、采血次数等因素的影响，对于脓毒症的血培养阳性率会有一定干扰。此外通过血培养来诊断脓毒症耗时长，通常需要48～72小时。(2)血常规：目前临床上认为白细胞＜5×109/l或大于＞20×109/l应高度怀疑感染，然而有研究表明50％的新生儿脓毒症患儿白细胞可在正常范围内，而且异常白细胞计数在其他病理条件下也可出现，因而白细胞计数对于脓毒症感染的诊断缺乏敏感性和特异性。(3)炎性指标：c反应蛋白和降钙素原是目前临床上用得最多的诊断脓毒症的生物标志物，它们被看作是细菌感染的特异性标志物，但在一些非感染的情况(如手术后、创伤等)下其水平也会升高。(4)白细胞介素6水平由于在脓毒症发生时变化非常敏感，故在icu常被作为脓毒症的早期诊断标志物，但它在急性炎症反应综合症和脓毒症区分中的价值一直存在争议，因为在创伤、手术或自身免疫性疾病等情况下白细胞介素6水平会发生改变。
技术实现要素：
传统的微生物培养存在耗时长、覆盖面窄的缺陷，急性感染更需要病原学的快速检测体系。为了更加快速、准确、更多的检测脓毒症病原体，本申请采用多重荧光定量pcr方法，检测鲍曼不动杆菌、克雷伯氏肺炎菌、肺炎链球菌、脆弱拟杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、嗜水气单胞菌、大肠埃希菌、鹑鸡肠球菌、阴沟肠杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌、凝固酶阴性的葡萄球菌、白色念珠菌、热带念珠菌、光滑假丝酵母菌、巨细胞病毒、人类疱疹病毒第四型、人类细小病毒b19、近平滑念珠菌、链球菌，共20种常见感染病原体。
一方面，本申请提供了一种人类脓毒症病原体的检测试剂盒，其特征在于，包含检测鲍曼不动杆菌、克雷伯氏肺炎菌、肺炎链球菌、脆弱拟杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、嗜水气单胞菌、大肠埃希菌、鹑鸡肠球菌、阴沟肠杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌、凝固酶阴性的葡萄球菌、白色念珠菌、热带念珠菌、光滑假丝酵母菌、巨细胞病毒、人类疱疹病毒第四型、人类细小病毒b19、近平滑念珠菌、链球菌的引物和探针。
进一步地，所述引物和探针的核酸序列为seqidno.1-60。
进一步地，所述引物和探针分为7组，分别为s1：seqidno.1-9；s2：seqidno.10-18；s3：seqidno.19-27；s4：seqidno.28-36；s5：seqidno.37-45；s6：seqidno.46-54；s7：seqidno.55-63。
进一步地，所述试剂盒中还包含核酸序列为seqidno.61-63的rpp30内参引物和探针。
进一步地，所述探针为荧光探针。
进一步地，所述试剂盒中还包含pcr反应试剂。
另一方面，本申请提供使用上述试剂盒检测脓毒症的方法，包括使用上述试剂盒进行pcr反应的步骤。
进一步地，所述pcr反应分为7个反应体系进行，分别为s1：seqidno.1-9；s2：seqidno.10-18；s3：seqidno.19-27；s4：seqidno.28-36；s5：seqidno.37-45；s6：seqidno.46-54；s7：seqidno.55-63。
进一步地，检测样本为静脉血。
进一步地，所述检测脓毒症的方法中pcr扩增条件为：25℃，2分钟ung酶激活，53℃，10分钟反转录，95℃，2分钟聚合酶激活，95℃3秒，60℃30秒共45个循环。
本申请的试剂盒和检测方法可用于临床检查等诊断用途，也可以用于科研、疾病统计等非诊断用途。
本申请中的探针标记方式包括但不限于荧光标记、放射性同位素标记等；荧光标记时可用的荧光基团包括但不限于fam、hex、rox、cy5等本领域已知或市售的标记，标记的具体方法可以参考相应产品的说明和专业书籍或文献。
本申请中的引物和探针序列不局限于seqidno.1-63的序列，本领域技术人员可以根据《分子克隆》，萨姆布鲁克等专业书籍，使用primerpremier、oligo、beacon、ncbi等软件或者网站对这些序列进行调整以适应不同的检测要求。
pcr反应试剂不局限于实施例中的taqpathtm1-stepmultiplexmastermix，市售的各种pcr试剂以及自配的试剂只要符合需求均可选用。
有益效果：本申请采用多重荧光定量pcr方法同时全面检测20种脓毒症常见感染病原体，相比培养方法在时间和成本上有明显优势，实践中也显示出良好的灵敏度和特异性，有较高的临床应用前景。
具体实施方式
下面将结合具体实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，实施例中所涉及的各种试剂及仪器设备均为本领域常用试剂和仪器设备，未经特殊说明均可从商业途径获得。
实施例一：试剂盒的组成
1.特异性引物探针
注：其中w为g或t：r为g或a；y为c或t；m为a或c；s为g或c；d为a或g或t；k为g或t。
2.pcr反应试剂为：taqpathtm1-stepmultiplexmastermix(norox)。
3.去离子水。
实施例二：dna/rna制备
按医疗常规操作采集人外周静脉血1ml，加入edta抗凝。采用thermo公司的magmaxtmcorenucleicacidpurificationkit+magmaxtmcoremastitis&panbacteriamodule提取试剂盒，提取dna和rna。
实施例三：pcr反应体系配制
按以下体系配制pcr反应体系：
共7个反应体系(总反应体系为20μl)，分别为上表中s1-s7，混合内参引物探针构成。pcr反应试剂：10μl；每个引物探针浓度均为10m，引物体积均为0.8μl，探针体积均为0.4μl；样本模板：2μl；去离子水补够20μl。
实施例四：pcr反应
采用abi7500实时荧光pcr仪进行pcr反应。pcr反应在多通道实时荧光pcr仪上进行，每一循环实时采集fam、hex、rox和cy5荧光信号。本发明采用含u(尿嘧啶)体系，ung可以消除产物带来的污染。pcr扩增条件如下：25℃，2分钟ung酶激活，53℃，10分钟反转录，95℃，2分钟聚合酶激活，95℃3秒，60℃30秒共45个循环。
实施例五：结果分析
1.检验结果分析要求
检验结果应满足以下条件：
1)空白对照反应在任一检验通道ct值42之前无信号。若信号升起，且ct值＜42，则此次实验结果无效，建议重新实验。
2)待测样本内标基因的ct值≤40。
2.检验结果分析
使用本发明的试剂盒检测30患者，与标准的的血培养检测结果相同：
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发
明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围。
sequencelisting
<110>重庆市急救医疗中心（重庆市第四人民医院、重庆市急救医学研究所）、北京迈基诺基因科技股份有限公司
<120>一种人类脓毒症病原体检测试剂盒及检测方法
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