一株产几丁质酶、产吲哚乙酸的芽孢杆菌及其应用和方法

1.本发明涉及农业技术领域，尤其涉及的是一株产几丁质酶、产吲哚乙酸的芽孢杆菌及其应用和方法。


背景技术：

2.在植物根系土壤中生存的有益菌可以有效的促进植物生长，同时具有提高作物收成的作用如芽孢杆菌。筛选出良好促生能力如产植物激素及产几丁质酶能力的菌株不仅可以促进作物生长，帮助植物抵抗病原微生物，还可替代化肥，在数量和性能上达到绿色生产、保障食品安全的目的，对推动我国农业发展意义重大。
3.如今,在我国的农业生产中,农药、肥料、添加剂使用量的逐年增加对生态环境方面造成严重的威胁，污染土壤和空气,造成土壤板结、水土失衡等一系列问题。植物根际促生菌(pgpr)是生活在植物根际土壤中,能够促进植物生长、防病害和增加作物产量的有益菌。由于其分布在多个种属,因此具有多种不同的作用机制来促进植物生长。由植物根际促生菌对作物进行促生能经济、环保,大力推动了绿色农业的发展。
4.根际菌促进植物生的原因可以归纳为以下几点：通过生物固氮增加植物的氮素供给；增加植物根际可供植物直接利用的营养物质的数量；刺激根系生长；拮抗有害微生物；促进其他有益微生物与植物的共生。很多根际菌都能产生重要的植物激素和多种酶类直接对植物根系的生长产生影响，不同类型的pgpr产生的植物激素数量与种类各不相同。如很多根际菌会以根系分泌的色氨酸作为前体物质来合成吲哚乙酸(iaa)。iaa是调节植物生长发育的主要激素,可以促进植物更好地吸收土壤营养。pgpr产生iaa的方式主要有3种:
①
iaa基因整合到植物细胞的染色体上,由植物细胞合成iaa；
②
细菌进入植物细胞内分泌iaa；
③
细菌在宿主植物的根际定殖,合成外源iaa而供给植物。
5.还有一些根际菌能通过产生特定的酶或者其他物质参与植物自身的激素合成过程或相关信号传递过程，从而对植物产生影响。如分泌几丁质酶,它能破坏病原真菌的细胞壁,从而杀死病原菌，达到防治某些真菌病害的效果。几丁质酶参与植物生长发育调控，可能在细胞分裂和分化以及植物生长发育的信号分子的产生中起作用；几丁质酶大多兼具溶菌酶的功能，可分解细菌细胞壁的肽聚糖，甚至还可能催化转葡糖基反应，因而能对病原菌产生毒害作用；几丁质酶在抗虫反应中也起着作用。例如粘质沙雷氏菌(s.marcescens)产生的几丁质酶是其抑制齐整小核菌(sclerotium rolfsii)和丝核菌(r.solani)的关键。类芽孢杆菌(paenibacillus sp.300)和链霉(streptomyces sp.385)也是通过产生几丁质酶抑制尖孢镰刀菌。
6.植物根际和根系中的促生菌种类很多，它们在发挥作用时不会是孤立的，必然会有相互的影响，了解他们之间的互作情况，对于更好的对这些促生菌进行控制以发挥它们最大效力是非常重要的。很多报道显示，一些存在于根际中的促生菌能影响豆科植物和根瘤菌的结瘤过程，使根瘤的数量和质量增加，促进豆科植物的生长。


技术实现要素：

7.本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足提供一株产几丁质酶、产吲哚乙酸的芽孢杆菌及其应用和方法。
8.本发明的技术方案如下：
9.一株产几丁质酶、产吲哚乙酸的芽孢杆菌，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，保藏编号为cgmcc no：21556，分类命名为：bacillus proteolyticus。
10.一种利用所述的芽孢杆菌促进大豆生长的方法，将所述芽孢杆菌和根瘤菌共接种。
11.所述的方法，将根瘤菌和所述芽孢杆菌菌液共同加入无氮营养液中，待大豆子叶张开时，延大豆根部浇入。
12.所述的方法，根瘤菌和所述芽孢杆菌菌液体积比为1:1。
13.所述的芽孢杆菌的应用，该菌株产几丁质酶、产吲哚乙酸的应用。
14.将根瘤菌和所述芽孢杆菌菌液共同加入无氮营养液中，待大豆子叶张开时，延大豆根部浇入；在有根瘤的情况下，芽孢杆菌ccnwlxl2表现出了促植物生长和促结瘤能力，能同时提高根、茎干重，能显著促进结瘤。
附图说明
15.图1为菌株划线结果；
16.图2为菌株进行产iaa定性检测的结果；a为0、5、10、60mg/l iaa标准溶液的对照，b为该菌株iaa检测结果；
17.图3为产几丁质酶定性检测的结果；
18.图4为产几丁质酶能力结果；
19.图5为系统发育进化树；
20.图6为ccnwlxl2与根瘤菌共接根瘤数百分比；
21.图7为ccnwlxl2与根瘤菌共接总氮百分比；
22.图8为ccnwlxl2与根瘤菌共接干重百分比；
具体实施方式
23.以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。
24.实施例1
25.大豆促生菌的分离、产铁载体能力鉴定
26.1、土样来源
27.从陕西省咸阳市长武试验站中种植大豆的根部根瘤分离得到。
28.2、培养基配方
29.(1)牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏3.0g，蛋白胨10.0g，nacl 5.0g，琼脂18～20g，水1000ml，调ph 7.2～7.4。121℃灭菌2h。
30.3、土壤悬液的制备
31.在实验室首先抖落根上的泥土，用无菌的镊子将所有饱满的根瘤摘下，用无菌水
对根瘤冲洗3次，每次3min，将没有紧密粘附在根瘤表面的细菌细胞冲洗掉。之后将所有的根瘤放入装有玻璃珠和0.7％nacl的摇瓶中，150rpm，28℃摇动1h。将悬液进行适当稀释，在牛肉膏蛋白胨培养基上涂布。
32.4、菌株分离纯化
33.经过涂布的培养基，置于28℃条件下培养2
‑
7d。在培养期间，观察菌落的生长情况，挑取不同形态、颜色的菌落进行分离及纯化，从而获得纯培养物。挑取保留下的菌株，反复划线，进行纯化培养，并且对纯化后的菌株进行编号，最后保藏纯菌种，菌株划线结果如图1，a为平板正面照、b为平板反面照。
34.5、产iaa实验结果
35.该菌株产iaa实验结果如图2，其中a为浓度梯度为0、5、10、60mg/l的吲哚乙酸标准溶液作为对照，b为该菌株实验结果，观察到呈粉色为阳性，表示该菌株具备分泌iaa的能力。
36.6、产几丁质酶实验结果
37.通过观察在几丁质培养基上28℃培养3d的菌株，只要菌株在培养基上能够生长，并且产生溶解圈，就表示该菌株具有产几丁质酶的能力，如图3为菌株产几丁质酶实验结果。
38.为了更清晰的知道该菌株的产几丁质酶能力，在培养基中心点接一次培养3d。测量菌落直径(d)与该菌落的溶解圈直径(d)，如图4所示，变色圈直径d黑色横线为2.4cm，菌落直径d黄色纵线为1.3cm，溶解圈直径d与菌落直径d的比值为1.85，该菌株可产几丁质酶。
39.实施例2
40.大豆促生菌株鉴定
41.将该菌株于液体培养基140rpm摇床培养2天后，提取dna，进行16s rdna测序，序列如seq id no：1所示。
42.将测序结果在ncbi上进行blast比对，构建系统发育进化树。结果如图5所示，该菌株与bacillus anthracis atcc 14578的相似度为99.7％，属于产碱杆属(bacillus sp.)命名为bacillus sp.ccnwlxl2；
43.将产碱杆属bacillus sp.ccnwlxl2于2020年12月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，保藏编号为cgmcc no：21556，分类命名为：bacillus proteolyticus。保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
44.实施例3
45.植物实验
46.(1)供试菌株
47.以具有固氮促结瘤能力的中华根瘤菌sinorhizobium americanum cfnei 156为主体菌株，与具有产iaa、几丁质酶能力的促生菌株bacillus sp.ccnwlxl2为组合，进行促生长和促结瘤能力的检测。
48.(2)试验设计
49.为保证植物试验的可靠性，对于该菌株，进行三次重复实验，检测其促进植物生长及促结瘤的能力。
[0050]ⅰ只接根瘤菌，并浇无氮营养液；ⅱ，同时接根瘤菌和根瘤表面细菌ccnwlxl2，浇无氮营养液。设15个重复，每个重复1个植株。
[0051]
(3)植物试验
[0052]
将蛭石和珍珠岩以2:1的比例混合，加入蒸馏水拌匀，在聚丙烯种植袋中装入约1l混合物，121℃灭菌1.5h后备用。选取饱满、粒大、表皮完整无破损的中黄13大豆种子，用无菌水摇动清洗1h，再用75％酒精处理30sec，用1％次氯酸钠处理4min进行表面消毒，用无菌水洗涤6次去除酒精和次氯酸钠。将消毒后的种子置于水琼脂平板(含琼脂1.2％)，倒置于28℃下避光3d进行发芽。选取发芽良好的种子在无菌条件下种于种植袋中，每袋2颗，同时浇入150ml无氮营养液(k2hpo
4 0.5g，ca3(po4)22.0g，mgso4·
7h2o 0.2g，nacl 0.1g，fecl
3 0.01g，蒸馏水1000ml)，之后将其置于植物培养间，每天光照14h进行培养。
[0053]
(4)菌株接种
[0054]
待大豆子叶张开时接入菌种。接种时分两种种处理。
①
处理i——只接根瘤菌的对照：将根瘤菌菌液取1ml，再加1ml无菌水，加入150ml无氮营养液中，延根部浇入；
②
处理ⅱ——同时接根瘤菌和ccnwlxl2：将根瘤菌、ccnwlxl2菌液各取1ml，加入150ml无氮营养液中，延根部浇入。之后让植物在温室中继续生长，其间每隔10d浇入150ml无氮营养液。
[0055]
接菌后第30d，取出植物，对根、茎干重、根瘤数、总氮进行测定。
[0056]
(5)试验结果
[0057]
通过测定处理i和ⅱ中植物的生长和结瘤数据，比较了ccnwlxl2菌株在接根瘤菌的情况下，促进植物生长和结瘤的能力，结果见图6、7、8。
[0058]
对比单接根瘤菌的处理i和共接根瘤菌及ccnwlxl2的处理ⅱ。我们看到在有根瘤的情况下，ccnwlxl2表现出了促植物生长和促结瘤能力，能同时提高根、茎干重，能显著促进结瘤。
[0059]
应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
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[0063]