一种用于降解检材分型的人类常染色体和性染色体上64个基因座的六色荧光标记检测体系的制作方法

1.本发明属于分子生物技术和法医物证学应用领域，具体涉及一种用于降解检材分型的人类常染色体与性染色体上61个缺失/插入多态性（deletion or insertion polymorphism, dip）基因座、2个mini str基因座及1个性别鉴定基因（amelogenin, amel）的六色荧光分型体系及其法医学应用。


背景技术：

2.短串联重复序列（short tandem repeat，str）是法医物证学领域最常用的分子遗传标记之一，其多态性高，个体识别力强，但其突变率较高（约10
‑3），对亲子鉴定具有一定的影响；受基因座核心序列长度的影响，pcr扩增片段较长，在高度降解样本检测上存在一定的局限性。单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，snp）突变率低（约10
‑8），然而snp基因座分型检测对平台要求高，耗时长，步骤相对繁琐也增加了pcr产物污染的可能性；限制其在法医dna鉴定中广泛推广和应用。
3.mini str基因座通过将引物设计的尽可能靠近str基因座核心重复序列区域，从而有效缩短扩增片段长度，有助于提高降解检材检出的成功率。但是，同一反应体系中所能容纳的mini str基因座数量是有限的，较少的mini str基因座组合导致体系所有基因座的累积鉴别效能较低。dip是指在基因组特定核苷酸位置由于dna片段的缺失或者插入所形成的dna多态性，其本质上与str基因座一样，属于长度多态性。dip基因座兼具str与snp基因座的优势，在法医物证领域有相当大的应用潜能。dip基因座突变率低，遗传相对稳定；扩增片段短，增加了降解生物检材中基因座的检出成功率；基于目前基层法医实验室常用pcr扩增仪及毛细管电泳遗传分析仪进行检测基因分型，分型方法简便，成本低，易实现实验平台的共享，有助于dip基因座试剂盒的普及应用。
4.目前，大多数商品化试剂盒的研究仍以五色荧光标记为主，受荧光素种类和目标扩增片段长度限制，单个反应体系中所能容纳的基因座数目受限，能涵盖的遗传信息量有限。我们应用六色荧光标记技术在单个反应中扩增分析更多数目的基因座，在提高试剂盒的鉴定效能的同时，也能够节约试剂消耗，节省人力成本，提高单次dna鉴定效率；也能够兼容不同类型的基因座同时进行检测分析，能够提供更丰富的遗传信息，在法医学实际应用中有利于更精确地进行鉴定，比如：性染色体基因座的引入，能够对性别进行更准确的鉴定；str基因座多态性高，体系纳入mini str基因座在提高整个体系鉴别效能的同时，也有助于降解检材分型检测。目前，dip基因座相关的商品化试剂盒较少，且其鉴别效能仍有待进一步提高。因此，开发一组鉴别效能更高的、适用于高度降解检材检测的、包含mini str基因座及常染色体和性染色体上更多dip基因座的六色荧光标记复合扩增检测体系，在法医学实际检案中具有重要意义。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供一种用于降解检材（<200bp）分型的人类常染色体上59个dip基因座和2个mini str基因座、y染色体上2个dip基因座及1个性别鉴别基因amel的六色荧光标记复合扩增检测试剂盒，可为法医物证检材，尤其是降解检材的法医个体识别及亲子鉴定等提供新的技术支持。
6.为了实现本发明，本发明采用了以下技术方案。
7.本发明提供了一种用于降解检材分型的人类常染色体与性染色体基因座相组合的六色荧光标记复合扩增检测试剂盒，所述分型体系试剂包含：master mix、primer mix、nuclease
‑
free water、control dna 9948、size
‑
500、6
‑
dye matrix standards和去离子甲酰胺溶液。master mix具体成分包含有：taq酶、tris
‑
hcl缓冲液、kcl、mgcl2及bsa。primer mix具体成分为64对特异性pcr引物和dntp。
8.本发明提供的分型体系包含常染色体上59个dip基因座和2个mini str基因座、y染色体上2个dip基因座及一个性别鉴别基因amel。所述常染色体上59个dip基因座是rs35828751、rs10562732、rs11283102、rs10563906、rs3830338 、rs3082950、rs2308292、rs6481、rs10649306、rs3083268、rs10546179、rs55965654、rs35567218、rs2308000、rs60922184、rs4024564、rs111626822、rs10556197、rs34899580、rs55678559、rs35173752、rs10625985、rs10532209、rs3043804、rs10594574、rs1610921、rs3833559、rs5833522、rs35453727、rs3061475、rs10540867、rs71102499、rs34802628、rs10536238、rs6145346、rs144378883、rs148501393、rs67787836、rs35713041、rs3059221、rs3030496、rs10535391、rs10579944、rs36119043、rs1611025、rs56160634、rs71698233、rs67365630、rs35464887、rs3076465、rs10581929、rs66739142、rs34731870、rs61681053、rs33928328、rs5877451、rs3988323、rs10610764、rs59629990；所述的2个mini str基因座是d3s1358和d1s1656;所述的y染色体上2个dip基因座是：rs199815934和rs759551978；所述的性别鉴别基因为amel。
9.为了进一步实现本发明的目的，本发明所述的64个基因座的扩增子长度控制在200bp以内，适用于检测降解生物检材。
10.本发明采用了六色荧光标记检测技术（6
‑
fam、joe、tamra、rox、alexa594和alexa633），将上述的64个基因座分成五组，其中基因座amel、rs35828751、rs10562732、rs11283102、rs10563906、rs3830338 、rs3082950、rs2308292、rs6481、rs10649306、rs3083268、rs10546179、rs55965654、rs759551978、rs59629990用6
‑
fam（蓝色）标记；基因座rs35567218、rs2308000、rs60922184、rs4024564、rs111626822、rs10556197、rs34899580、rs55678559、rs35173752、rs10625985、rs10532209、rs3043804、rs10594574、rs1610921、rs3833559、rs5833522、rs35453727用joe（绿色）标记；基因座rs199815934、rs3061475、rs10540867、rs71102499、rs34802628、rs10536238、rs6145346、rs144378883、rs148501393、rs67787836、rs35713041、rs3059221、rs3030496、rs10535391、rs10579944、rs36119043、rs1611025用tamra（黄色）标记；基因座rs56160634、rs71698233、rs67365630、rs35464887、rs3076465、rs10581929、rs66739142、rs34731870、rs61681053、rs33928328、rs5877451、rs3988323、rs10610764用rox（红色）标记；mini str基因座d3s1358和d1s1656用alexa594（紫色）标记；分子量内标为size
‑
500分子量内标，采用alexa633（橙色）。
11.本发明建立的包含64个基因座的六荧光标记复合扩增同步检测体系，扩增反应总体积为10
µ
l，具体成分配比为：人源生物样本dna 1
µ
l（或者可直接扩增的样本1.0
‑
1.2mm2）、master mix 2
µ
l、primer mix 2
µ
l及nuclease
‑
free water补齐至10
µ
l。具体扩增反应程序为：95℃，5min；94℃，10s，63℃，90s，共2个循环；94℃，10s、60℃，90s，共25个循环；60℃，15min。
12.本发明采用的待测人源样本可以是从人类体液或者组织（如：血痕、血液、唾液、口腔拭子、带毛囊的毛发、精液、组织等）中提取的基因组dna，提取方法可以是chelex
‑
100法、酚氯仿法、磁珠法等方法进行提取及定量；也可以是直接对多种免提取检材（如：血液、血滤纸、血纱布、fta卡、带毛囊的发根、唾液卡等）进行直接扩增。
13.本发明用毛细管电泳遗传分析仪（包括但不限于3100系列、3130系列、3500系列遗传分析仪）对pcr产物进行毛细管电泳和分型检测。具体步骤如下：取1
µ
l的上述复合pcr产物、0.5
µ
l的size
‑
500分子量内标及8.5
µ
l的去离子甲酰胺充分混匀后，在95℃变性3 min，冰上迅速冰冷3 min（或者使用pcr反应程序95℃/3 min，4℃/3 min），然后在毛细管电泳遗传分析仪上对64个基因座进行分型检测。电泳结束后，用genemapper
® id
‑
x软件处理检测到的数据，并获得64个基因座的分型图谱和分型数据。
14.与现有的试剂盒相比，本发明具有如下优势。
15.（1）本发明提供的检测体系是采用六色荧光标记技术，一次性实现了对常染色体上59个dip基因座和2个mini str基因座、y染色体上2个dip基因座及1个性别鉴定基因amel的稳定、灵敏、特异、高效的复合扩增分析，增加了体系中基因座的检测数量，提高了试剂盒的鉴定效能。
16.（2）本发明选取了常染色体dip基因座和性染色体基因座组合，具有极好的兼容性。体系中引入的y染色体上2个dip基因座，能够对性别进行更准确的鉴定；同时常染色体上2个mini str基因座，多态性高，在提高整个体系的鉴别效能的同时，也有助于降解检材分型检测。
17.（3）本发明选取的常染色体59个dip基因座的等位基因频率在东亚群体中遗传分化系数（f
‑
statistics，f
st
）较小，适用于东亚地区多个族群的鉴定。
18.（4）本发明64个基因座的扩增子长度控制在200bp以内，检测降解生物检材时基因座的检出数量增加，适用于高度降解检材的检测分析。
19.（5）本发明的检测体系可利用常用毛细管电泳遗传分析仪，容易在基层法医dna实验室推广应用。
附图说明
20.图1. 为使用本发明检测dna标准品9948的分型检测结果。
21.图2. 为本发明所构建的检测体系的等位基因分型标准物。
具体实施方式
22.下面对本发明的具体实施步骤进一步地详细说明。
23.实施步骤1：常染色体和性染色体上64个基因座的甄选。
24.基于snp数据库（build 154）和既往文献报道，按照如下标准筛选常染色体dip基
因座：（1）位于内含子区域，与基因表达无关；（2）插入或缺失核苷酸序列长度在2
‑
10bp之间；（3）dbsnp中最小等位基因频率＞0.2；（4）候选基因座要处于连锁平衡，位于不同染色体上或者同一条染色体上的基因座间的物理距离超过10 mb；（5）在千人基因组数据库中的两个中国汉族群体（chb和chs）中：等位基因频率在0.3
‑
0.7之间；符合哈迪
‑
温伯格平衡定律；（6）等位基因频率在千人基因组数据库中的5个东亚群体中的f
st
值较小，小于0.06；（7）基因座侧翼序列处无特殊结构的核苷酸序列或影响基因座分型检测的其他遗传标记，且能设计出合适的复合pcr引物，扩增片段的长度小于200bp。另外，y染色体dip基因座和ministr筛选自既往文献报道，且扩增片段的长度小于200bp。根据上述筛选原则，本发明甄选的64个基因座的相关信息如表1所示，包括常染色体伤59个dip基因座和2个ministr基因座、y染色体上2个dip基因座及一个性别鉴定基因amel。
25.表1：本发明中所包含的64基因座的信息。
序号基因座分型图谱中命名缺失/插入或重复序列染色体位置(grch37)1amelamelx,yx:11311533
‑
11318881
ꢀꢀꢀꢀ
y:6733959
‑
67798152rs35828751b1.1
‑
>tt1:1845072583rs10562732b1.2taca>
‑
1:1121543184rs11283102b1.3
‑
>gctcacttt1:624778425rs10563906b1.4atat>
‑
2:343525746rs3830338 b1.5gagtctc>
‑
3:731097457rs3082950b1.6
‑
>aa4:214413848rs2308292b1.7taagt>
‑
4:1078897729rs6481b1.8
‑
>gtgga22:3570189910rs10649306b1.9
‑
>gtta1:1742426111rs3083268b1.10ca>
‑
4:17323090812rs10546179b1.11at>
‑
4:6224204613rs55965654b1.12agaa>
‑
7:15776099414rs759551978b1.13agat>
‑
y:2176531215rs59629990r1.14aatt>
‑
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‑
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‑
5:787126418rs60922184g1.3ctc>
‑
7:8411145419rs4024564g1.4ca>
‑
3:14335611220rs111626822g1.5
‑
>ag9:697572721rs10556197g1.6ag>
‑
9:13189338022rs34899580g1.7
‑
>aa5:16434350123rs55678559g1.8ctaa>
‑
10:12225102224rs35173752g1.9aag>
‑
10:8426039325rs10625985g1.10
‑
>at10:10111893826rs10532209g1.11cca>
‑
11:3598388627rs3043804g1.12ct>
‑
12:8052497228rs10594574g1.13ct>
‑
12:57713315
29rs1610921g1.14gcttataa>
‑
12:9732871530rs3833559g1.15at>
‑
2:5547338731rs5833522g1.16ca>
‑
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‑
13:2823788133rs199815934y1.1ttctc>
‑
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‑
12:2159761435rs10540867y1.3at>
‑
13:9995754636rs71102499y1.4
‑
>aa13:6460678137rs34802628y1.5cctc>
‑
13:11105544638rs10536238y1.6tt>
‑
14:9306351839rs6145346y1.7aaac>
‑
14:5413162640rs144378883y1.8ctt>
‑
15:3429473141rs148501393y1.9atcttca>
‑
16:8464447742rs67787836y1.10at>
‑
19:718482243rs35713041y1.11ct>
‑
17:917942044rs3059221y1.12agcaat>
‑
18:6202681745rs3030496y1.13
‑
>tt7:11482873346rs10535391y1.14att>
‑
2:23491011247rs10579944y1.15tatt>
‑
2:21086943048rs36119043y1.16ct>
‑
7:13777206149rs1611025y1.17aag>
‑
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‑
18:1332409851rs71698233r1.2aga>
‑
6:16303168652rs67365630r1.3act>
‑
8:14107635853rs35464887r1.4ttta>
‑
9:2093019054rs3076465r1.5attt>
‑
11:10322724355rs10581929r1.6at>
‑
2:17046595756rs66739142r1.7ctttt>
‑
15:6750653457rs34731870r1.8aag>
‑
21:3900221458rs61681053r1.9
‑
>aggccta11:1987431659rs33928328r1.10gtg>
‑
8:3334520360rs5877451r1.11gtg>
‑
6:7605672561rs3988323r1.12ct>
‑
8:1842582462rs10610764r1.13aata>
‑
8:9660696363d3s1358d3s1358[tcta][tctg][tcta]3:45582205
‑
4558233564d1s1656d1s1656[ccta][tcta]1:230905305
‑
230905457
[0026]
实施步骤2：64个基因座的复合扩增引物设计。
[0027]
（1）使用primer 5.0软件设计扩增引物。随着复合扩增系统中引物数量的增加，不同基因座引物之间的相互干扰也越来越严重，反应体系的动力学变得越来越复杂。对于复合扩增体系，尤其是本发明中包含64个基因座的复合扩增体系，对引物序列的特异性、引物二级结构、引物与靶序列结合的稳定性及引物扩增效率等的要求极高，因此，需要通过设计
大量的引物序列进行复杂的测试及反复优化复合扩增系统中引物之间的浓度比例，最终在保证不降低试剂盒特异性及灵敏度的情况下，得到了特异高效的扩增引物。
[0028]
（2）将上述引物按照如下分组方式对基因座进行不同颜色的荧光标记：第一组（6
‑
fam）包括基因座amel、rs35828751、rs10562732、rs11283102、rs10563906、rs3830338 、rs3082950、rs2308292、rs6481、rs10649306、rs3083268、rs10546179、rs55965654、rs759551978、rs59629990；第二组（joe）包括基因座rs35567218、rs2308000、rs60922184、rs4024564、rs111626822、rs10556197、rs34899580、rs55678559、rs35173752、rs10625985、rs10532209、rs3043804、rs10594574、rs1610921、rs3833559、rs5833522、rs35453727；第三组（tamra）包括基因座rs199815934、rs3061475、rs10540867、rs71102499、rs34802628、rs10536238、rs6145346、rs144378883、rs148501393、rs67787836、rs35713041、rs3059221、rs3030496、rs10535391、rs10579944、rs36119043、rs1611025；第四组（rox）包括基因座rs56160634、rs71698233、rs67365630、rs35464887、rs3076465、rs10581929、rs66739142、rs34731870、rs61681053、rs33928328、rs5877451、rs3988323、rs10610764；第五组（alexa594）包括基因座d3s1358和d1s1656。
[0029]
实施步骤3：包含64个基因座的复合扩增体系的构建。
[0030]
（1）对于同时扩增64个基因座的复合扩增体系，为实现稳定且均衡的分型检测结果，需要对64个基因座引物对配比浓度、退火温度、热循环参数、模板dna量等pcr反应条件进行优化。
[0031]
（2）准备待测人源样本，可以是从人类体液/组织（如：血痕、血液、唾液、口腔拭子、带毛囊的发根、精液、肌肉组织等）中提取的基因组dna，提取方法可以是chelex
‑
100法、酚氯仿法、磁珠法等方法进行提取及定量；也可以是直接对多种免提取检材（如：血液、血滤纸、血纱布、fta卡、带毛囊的发根、唾液卡等）进行直接扩增。
[0032]
（3）本发明最终得到的最优扩增反应总体积为10
µ
l，具体成分配比如下所示。
[0033]
具体扩增程序如下所示。
[0034]
实施步骤4：64个基因座复合扩增产物的荧光检测。
[0035]
（1）扩增产物在毛细管电泳遗传分析仪上进行荧光检测，具体步骤如下：取上述复
合pcr产物1
µ
l、size
‑
500分子量内标0.5
µ
l 和去离子甲酰胺8.5
µ
l充分混匀后进行变性处理。
[0036]
经过95℃变性3 min，迅速冰冷3 min（或者使用pcr程序 95℃，3 min，4℃，3 min）后，采用毛细管电泳遗传分析仪（包括但不限于3100系列、3130系列、3500系列遗传分析仪）对64个基因座进行荧光检测。
[0037]
（2）毛细管电泳结束后，用genemapper
® id
‑
x软件处理检测到的数据，并获得64基因座的分型图谱和数据。具体实施方式为：（1）打开genemapper id
®
‑
x软件，导入本发明构建的panel和bin文件，建立相应的analysis method，新建size standard；（2）导入毛细管电泳数据，选择相应的panel、bin、analysis method和size standard等分析参数，对待测样本的64个位点的电泳结果进行判读。
[0038]
上述实施例仅是本发明的优选实施方式，需要指出的是，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和等同替换，这些对本发明权要求进行改进和等同替换后的技术方案，均落入本发明的保护范围。