基于SARS-CoV-2假病毒的中和抗体检测方法与流程

本发明涉及基因工程和分子生物学领域，具体涉及一种基于sars-cov-2假病毒的中和抗体检测方法。本发明还涉及一种重组载体，一种类病毒颗粒，以及一种细胞株。本发明还涉及检测sars-cov-2类病毒感染力的方法以及检测sars-cov-2抗体中和活性的方法。

背景技术：

假病毒(pseudovirus)是病毒衣壳蛋白或者包膜蛋白包裹携带有报告基因的异源核酸形成的类似于真病毒的具有感染性的病毒颗粒，由于被包裹的核酸不具有复制形成病毒的全部核酸序列，所以假病毒只有一轮的感染力，操作比较安全。高滴度的假病毒是保持实验稳定性的重要因素。假病毒的滴度提高除了对膜蛋白基因序列进行改造优化外，也可对假病毒感染的细胞进行改造，以提高病毒的感染效率。

furin是一种存在于全部的脊椎动物和部分无脊椎动物中的i型跨膜蛋白，由794个氨基酸组成；包括n端信号肽(signalpeptide)、前肽(propeptide)、催化域(catalyticdomain)、保守的p结构域、富含cys的结构域、跨膜结构域和细胞质结构域。furin能够切割前体蛋白，对维持细胞内环境的稳定至关重要。除此之外，furin还被许多病毒和细菌所利用，与某些疾病的发生息息相关。而sars-cov-2在s1内(核苷酸位置23619-23632)具有独特的4个氨基酸插入(681-prra-684)，这种插入(prra)为furin提供了潜在的识别和切割位点，使sars-cov-2s蛋白的切割效率显著提高。sars-cov-2也利用血管紧张素转换酶2(ace2)作为受体与宿主细胞表面结合。

sars-cov-2假病毒中和抗体检测方法中，需要一种能够提高sars-cov-2假病毒的感染效率的方法，以减少病毒使用量，且稳定、高效、且成本小的sars-cov-2假病毒中和抗体检测方法。

技术实现要素：

本申请的发明人经过大量实验和反复摸索，构建了表达或过表达ace2蛋白和furin蛋白的细胞株。进一步的，应用该细胞株建立了稳定、高效，且低成本的检测sars-cov-2类病毒感染力的方法以及检测sars-cov-2抗体中和活性的方法。

因此，在第一方面，本发明提供了一种重组载体，其含有编码ace2蛋白和/或furin蛋白的核苷酸序列。

在某些实施方案中，所述ace2蛋白和furin蛋白为天然的哺乳动物(例如，人)的ace2蛋白和furin蛋白。

在某些实施方案中，所述ace2蛋白的氨基酸序列如seqidno:1所示。在某些实施方案中，所述furin蛋白的氨基酸序列如seqidno:2所示。

本发明的载体可以是克隆载体，也可以是表达载体。在某些实施方案中，本发明的载体是例如质粒，粘粒，噬菌体，柯斯质粒等等。在某些实施方案中，所述载体能够在宿主细胞(例如哺乳动物的细胞，例如人的细胞)内表达本发明的蛋白或如上所述的融合蛋白。

在某些实施方案中，所述重组载体为表达载体。在某些实施方案中，所述重组载体由质粒构建。在某些实施方案中，所述质粒选自plv，pcdna3.1+、pcag3.1和pcmv3.1。

在某些实施方案中，所述重组载体还包含编码furin蛋白信号肽的核苷酸序列和/或编码ace2蛋白信号肽的核苷酸序列。

在某些实施方案中，所述furin蛋白信号肽的氨基酸序列如seqidno:3所示。在某些实施方案中，所述ace2蛋白信号肽的氨基酸序列如seqidno:4所示。

在另一方面，本发明提供了一种类病毒颗粒，所述类病毒颗粒含有ace2蛋白和/或furin蛋白。

在某些实施方案中，所述类病毒颗粒由如前所述的重组载体与核酸组分共转染哺乳动物细胞而包装得到。在本发明中，如前所述的重组载体自组装形成了所述类病毒颗粒的外壳。在某些实施方案中，所述类病毒颗粒还含有核酸组分。此类核酸组分例如被包裹在如前所述的重组载体自组装形成的外壳内。

在某些实施方案中，所述核酸组分选自下述的任意一项或多项：

(a)外源dna，或者编码外源蛋白或多肽的外源dna，或者编码rna的外源dna；

(b)一种载体，其任选地包含(a)中所述的外源dna；

(c)外源rna，或者编码外源蛋白或多肽的外源rna；

(d)一种载体，其任选地包含(c)中所述的外源rna。

在某些实施方案中，所述核酸组分为包装质粒。

在另一方面，本发明提供了一种细胞株，所述细胞表达或过表达ace2蛋白和furin蛋白。

在某些实施方案中，所述细胞株由如前所述的类病毒颗粒转染哺乳动物细胞而得到。

在某些实施方案中，所述哺乳动物的细胞为人的细胞，例如，造血细胞，上皮细胞，肝细胞，肿瘤细胞，神经细胞。在某些实施方案中，所述细胞为293t细胞。

在某些实施方案中，所述细胞株的基因组中整合有编码ace2蛋白和furin蛋白的核苷酸序列。

在某些实施方案中，所述ace2蛋白和furin蛋白为天然人ace2蛋白和天然人furin蛋白。

在某些实施方案中，所述ace2蛋白的氨基酸序列如seqidno:1所示。在某些实施方案中，所述furin蛋白的氨基酸序列如seqidno:2所示。

在某些实施方案中，所述细胞株的基因组中还整合有编码furin蛋白信号肽的核苷酸序列和/或编码ace2蛋白信号肽的核苷酸序列。

在某些实施方案中，所述furin蛋白信号肽的氨基酸序列如seqidno:3所示。在某些实施方案中，所述ace2蛋白信号肽的氨基酸序列如seqidno:4所示。

在某些实施方案中，所述细胞株的保藏号编号为cctccno:c202189。

在另一方面，本发明提供了一种制备如前所述的细胞株的方法，所述方法包括：

(1)将编码ace2蛋白的第一核酸组分和编码furin蛋白的第二核酸组分共转染哺乳动物细胞；任选地，将第三核酸组分与所述第一核酸组分和第二核酸组分共转染哺乳动物细胞，获得类病毒颗粒；

(2)将所述类病毒颗粒转染哺乳动物细胞；

(3)筛选步骤(2)获得的细胞，获得的阳性细胞即为所述细胞株。

在某些实施方案中，在步骤(1)中，所述第三核酸组分含有类病毒颗粒所需的一个或多个基因或元件。在某些实施方案中，所述一个或多个基因或元件包含gag基因、env基因和/或pol基因。在某些实施方案中，在步骤(3)中，通过抗生素或荧光标记筛选所述培养获得的细胞。

在某些实施方案中，所述抗生素为潮霉素或杀稻瘟菌素。

在某些实施方案中，所述第一核酸组分和第二核酸组分包含于相同的载体或不同的载体中。

在某些实施方案中，所述第一核酸组分、第二核酸组分和第三核酸组分包含于相同的载体或不同的载体中。

在另一方面，本发明提供了一种检测sars-cov-2类病毒感染力的方法，所述方法包括，将如前所述的细胞株与sars-cov-2类病毒接触，并测试病毒滴度。

在某些实施方案中，所述方法包括，将如前3所述的细胞株与sars-cov-2类病毒接触并孵育，加入荧光检测试剂，检测荧光值并计算类病毒滴度。

在另一方面，本发明提供了一种检测sars-cov-2抗体中和活性的方法，所述方法包括，在将sars-cov-2类病毒颗粒与如前所述的细胞株接触之前、同时或之后，将所述类病毒颗粒或细胞株与所述抗体接触。

在另一方面，本发明提供了一种试剂盒，其包括一种或多种选自下列的组分：如前所述的重组载体，如前所述的类病毒颗粒，如前所述的细胞株；

任选地，其还包含选自下述中的一项或多项：

(1)编码权利要求1所述的重组载体的第一核酸分子；

(2)含有类病毒颗粒所需的基因或元件的一个或多个辅助核酸分子。在某些实施方案中，所述一个或多个辅助核酸分子包含gag基因、env基因和/或pol基因。

在某些实施方案中，所述试剂盒还包含用于将核酸分子转移入宿主细胞中的试剂，和/或，用于插入核酸分子的载体。在某些实施方案中，所述宿主细胞为哺乳动物(例如，人)的细胞。在某些实施方案中，所述宿主细胞为293t细胞。任选地，所述试剂盒还包含宿主细胞。

在某些实施方案中，所述一个或多个辅助核酸分子包含于相同的载体或不同的载体中。

在某些实施方案中，所述一个或多个辅助核酸分子与所述第一核酸分子包含于相同的载体或不同的载体中。

在某些实施方案中，所述试剂盒还包括sars-cov-2类病毒和/或转染试剂。

在某些实施方案中，所述转染试剂选自：lipofectamine2000、lipofectamine3000、pei，或其任何组合。

在某些实施方案中，所述sars-cov-2类病毒与所述细胞株的选用量分别为小于1200tcid50的类病毒和小于5*10⁴/well的细胞株。在某些实施方案中，所述sars-cov-2类病毒与所述细胞株的选用量分别为300tcid50的类病毒和1*10⁴/well的细胞株。

在某些实施方案中，所述试剂盒用于检测sars-cov-2类病毒的感染力。

在某些实施方案中，所述试剂盒用于检测sars-cov-2抗体的中和活性。

在另一方面，本发明提供了一种筛选能够抑制sars-cov-2感染细胞的候选药物的方法，所述方法包括，在将sars-cov-2类病毒颗粒与如前所述的细胞株接触之前、同时或之后，将所述类病毒颗粒或细胞株与所述候选药物接触。

在另一方面，本发明提供了如前所述的重组载体、如前所述的类病毒颗粒、如前所述的细胞株、如前所述的试剂盒用于检测sars-cov-2类病毒的感染力或者用于检测sars-cov-2抗体的中和活性的用途。

在另一方面，本发明提供了制备如前所述的类病毒颗粒的方法，其包括：

(a)用下述物质转染宿主细胞：

(1)编码权利要求1的重组载体的第一核酸分子；

(2)含有形成类病毒颗粒(例如hiv病毒样颗粒或siv病毒样颗粒)所需的基因或元件的一个或多个辅助核酸分子；优选地，所述一个或多个辅助核酸分子包含gag基因、pol基因和/或env基因；和

(b)在允许蛋白表达的条件下培养所述宿主细胞，以产生类病毒颗粒。

在某些实施方案中，所述细胞为哺乳动物(例如，人)的细胞。在某些实施方案中，所述细胞为293t细胞。

术语定义

在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的分子遗传学、核酸化学、化学、分子生物学、生物化学、细胞培养、微生物学、细胞生物学、基因组学和重组dna等操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。

如本文中所使用的，术语“sars-cov-2”为“严重急性呼吸综合征冠状病毒2(severeacuterespiratorysyndromecoronavirus2)”的简称，旧称为“新型冠状病毒”或“2019-ncov”，其属于β冠状病毒属，为含包膜的单链正义rna病毒。sars-cov-2的基因组序列是本领域技术人员已知的，可参见例如genbank：mn908947。sars-cov-2至少含有三种膜蛋白，包括表面刺突蛋白(s)、整合膜蛋白(m)和膜蛋白(e)。sars-cov-2的受体与sars-cov一样，均是通过s蛋白上的受体结合结构域(receptorbindingdomain,rbd)与宿主细胞上的血管紧张素转移酶2(ace2)特异性结合后，病毒进行膜融合和入胞，s蛋白在病毒感染细胞过程中起着至关重要的作用。

如本文中所使用的，术语“新型冠状病毒肺炎”和“covid-19”是指，因sars-cov-2感染而导致的肺炎，二者具有相同的含义，可互换使用。

如本文中所使用的，术语“野生的”或“天然的”可互换地使用。当这些术语用于描述核酸分子、多肽或蛋白时，其表示该核酸分子、多肽或蛋白在自然界中存在，发现于自然界，并且未经过人工的任何修饰或加工。如本文中所使用的，天然的ace2蛋白是指天然存在的，具有生物学活性的ace2蛋白。类似地，天然的furin蛋白同理。本领域技术人员可以方便地从各种公共数据库(例如genbank数据库)获得spike蛋白的氨基酸序列。例如，天然的ace2蛋白的氨基酸序列可如seqidno：1所示；天然的furin蛋白的氨基酸序列可如seqidno：2所示。

如本文中所使用的，术语“假病毒”和“类病毒”二者具有相同的含义，可互换使用；其是指，由病毒蛋白自组装形成的一种类似于病毒的颗粒，其不包裹核酸或者包裹了其他核酸，从而，所述假病毒或类病毒虽然能够感染宿主细胞，但不具有自主复制能力。因此，与真正的病毒相比，其生物安全性高。假病毒的包装系统一般由两部分组成，即包装组分和表达组分。包装组分由病毒(例如，hiv-1)基因组去除了包装、逆转录和整合所需的遗传信息而构建，提供假病毒颗粒所必须的蛋白；表达组分则与包装组分互补，含有包装、逆转录和整合所需的遗传信息，同时含有外源目的基因。将包装组分与载体组分共同转染宿主细胞，即可在细胞上清中收获假病毒颗粒。

如本文中所使用的，术语“骨架质粒”和“包装质粒”具有相同的含义，可以互换使用。如本领域技术人员通常理解的，病毒载体系统(特别是慢病毒载体系统)可以由两部分组成，即，包装成分(例如包装质粒或骨架质粒)和载体成分(例如，携带目的基因的重组表达载体)；其中，包装成分(例如包装质粒或骨架质粒)可提供转录和包装遗传物质(例如rna)到重组的假病毒颗粒内所需要的所有辅助蛋白。由此，可通过下述方式产生高滴度的假病毒颗粒：用重组表达载体和包装质粒共转染细胞，然后在细胞中进行假病毒的包装，随后包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中。此类包装质粒或骨架质粒是本领域技术人员熟知的，例如，以hiv-1为基础构建的骨架质粒：包括但不限于，psg3.δenv(weix等人，antibodyneutralizationandescapebyhiv-1.nature422:307-312,2003)和nl4-3.fluc.r-.e-(connorri,等人，vprisrequiredforefficientreplicationofhumanimmunodeficiencyvirustype-1inmononuclearphagocytes.virology206:935–944,1995)，以及本申请实施例中构建的psg3.δenv.fluc和psg3.δenv.cmvfluc。

如本文中所使用的，术语“载体”是指，可将多聚核苷酸插入其中的一种核酸运载工具。当载体能使插入的多核苷酸编码的蛋白获得表达时，载体称为表达载体。载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色体，例如酵母人工染色体(yac)、细菌人工染色体(bac)或p1来源的人工染色体(pac)；噬菌体如λ噬菌体或m13噬菌体及动物病毒等。可用作载体的动物病毒包括但不限于，逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如sv40)。一种载体可以含有多种控制表达的元件，包括但不限于，启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因。另外，载体还可含有复制起始位点。

如本文中所使用的，术语“宿主细胞”是指，可用于导入载体的细胞，其包括但不限于，如大肠杆菌或枯草菌等的原核细胞，如酵母细胞或曲霉菌等的真菌细胞，如s2果蝇细胞或sf9等的昆虫细胞，或者如纤维原细胞，cho细胞，cos细胞，nso细胞，hela细胞，bhk细胞，hek293细胞或人细胞等的动物细胞。

本领域技术人员将理解，表达载体的设计可取决于诸如待转化的宿主细胞的选择、所希望的表达水平等因素。一种载体可以被引入到宿主细胞中而由此产生转录物、蛋白质、或肽，包括由如本文所述的蛋白、融合蛋白、分离的核酸分子等。

如本文中所使用的，术语“有效量”是指能够有效实现预期目的的量。例如，预防或治疗疾病(例如轮状病毒感染)有效量是指，能够有效预防、阻止或延迟疾病(例如轮状病毒感染)的发生、或缓解、减轻或治疗已有的疾病(例如由轮状病毒感染所导致的疾病)的严重程度的量。测定这样的有效量在本领域技术人员的能力范围之内。例如，对于治疗用途有效的量将取决于待治疗的疾病的严重度、患者自己的免疫系统的总体状态、患者的一般情况例如年龄，体重和性别，药物的施用方式，以及同时施用的其他治疗等等。

如本文中所使用的，术语“中和抗体”是指具有中和活性的抗体。术语“中和活性”是指抗体或抗体片段具有与病毒上的抗原蛋白相结合，从而阻止病毒感染细胞和/或病毒子代的成熟和/或病毒子代的释放的功能活性，具有中和活性的抗体或抗体片段可以阻止病毒的扩增，从而抑制或消除病毒的感染。

如本文所使用的，术语“表达”是指来某一核酸片段(例如，dna，mrna)的转录和稳定积累，其还指mrna翻译成多肽。

如本文所使用的，术语“过表达”是指表达高于相同或相关基因的内源表达。如果异源基因的表达高于与之相当的内源基因的表达，则异源基因被过表达。

如本文所使用的，术语“转化”或“转染”的意思是，将“外来”(即异源)基因、dna或rna序列引入到宿主细胞中，从而使宿主细胞会表达所引入的基因或序列，以产生期望的物质，通常是由所引入基因或序列编码的蛋白或酶。已知的转染方法包括根癌土壤杆菌介导的或者发根土壤杆菌介导的转化，磷酸钙转化，聚凝胺转化，原生质体融合，电穿孔，超声方法(例如，声致穿孔)，脂质体转化，显微注射，裸dna，质粒载体，病毒载体，基因枪(微粒轰击)，碳化硅whiskerstm介导的转化，气雾剂集束，或peg转化等。

发明的有益效果

与现有技术相比，本申请的所构建的细胞株293t-ace2-furin能够提高sars-cov-2假病毒的感染效率。在同等病毒感染效率下，能够降低细胞使用量的同时降低病毒的使用量。进一步的，应用该细胞株建立了稳定、高效且低成本的假病毒感染力检测方法以及抗体中和活性检测方法。

下面将结合附图和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将理解，下列附图和实施例仅用于说明本发明，而不是对本发明的范围的限定。根据附图和优选实施方案的下列详细描述，本发明的各种目的和有利方面对于本领域技术人员来说将变得显然。

附图说明

图1显示了重组载体plv-ace2的示意图。

图2显示了重组载体plv-furin的示意图。

图3显示了293t-ace2-furin细胞与293t细胞中ace2的qpcr检测结果。

图4显示了293t-ace2-furin细胞与293t细胞中furin的qpcr检测结果。

图5显示了假病毒感染细胞293t-ace2、293t-furin和293t-ace2-furin的荧光值(rlu)。

图6显示了假病毒感染细胞huh7和293t-ace2-furin的荧光值(rlu)。

图7显示了不同浓度的假病毒感染不同浓度的细胞293t-ace2-furin和细胞huh7的荧光值(rlu)。

图8显示了在不同细胞量和病毒量下中和抗体的id50检测结果。

图9显示了在不同细胞量和病毒量下细胞的抑制率。

关于生物材料保藏的说明

人肾上皮细胞293t-ace2-furin已在位于湖北省武汉市武昌区武汉大学保藏中心(武汉大学第一附属小学对面)的中国典型培养物保藏中心(cctcc,chinacenterfortypeculturecollection)进行保藏，其具有保藏号cctccno:c202189，且保藏时间为2021年4月13日。

序列信息

本发明涉及的部分序列的信息提供于下面的表1中。

表1.序列信息

具体实施方式

现参照下列意在举例说明本发明(而非限定本发明)的实施例来描述本发明。

除非特别指明，否则基本上按照本领域内熟知的以及在各种参考文献中描述的常规方法进行实施例中描述的实验和方法。例如，本发明中所使用的免疫学、生物化学、化学、分子生物学、微生物学、细胞生物学、基因组学和重组dna等常规技术，可参见萨姆布鲁克(sambrook)、弗里奇(fritsch)和马尼亚蒂斯(maniatis)，《分子克隆：实验室手册》(molecularcloning:alaboratorymanual)，第2次编辑(1989)；《当代分子生物学实验手册》(currentprotocolsinmolecularbiology)(f.m.奥苏贝尔(f.m.ausubel)等人编辑，(1987))；《酶学方法》(methodsinenzymology)系列(学术出版公司)：《pcr2：实用方法》(pcr2:apracticalapproach)(m.j.麦克弗森(m.j.macpherson)、b.d.黑姆斯(b.d.hames)和g.r.泰勒(g.r.taylor)编辑(1995))，以及《动物细胞培养》(animalcellculture)(r.i.弗雷谢尼(r.i.freshney)编辑(1987))。

另外，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。本领域技术人员知晓，实施例以举例方式描述本发明，且不意欲限制本发明所要求保护的范围。本文中提及的全部公开案和其他参考资料以其全文通过引用合并入本文。

实施例1.293t-ace2-furin细胞的构建与验证

如图1所示，将编码ace2蛋白的信号肽(seqidno:4)、ace2蛋白(seqidno:1)以及flag标签(seqidno:9)的核苷酸序列连接到plv质粒(购自载体家，货号ecoli(vb200421-1213bkd))上，构建重组载体plv-ace2。类似地，如图2所示，将编码furin蛋白信号肽(seqidno:3)、furin蛋白(seqidno:2)以及myc标签(seqidno:10)的核苷酸序列连接到plv质粒(购自载体家，货号ecoli(vb200420-1476wpj))上，构建重组载体plv-furin。将上述重组载体plv-ace2和plv-furin包装成慢病毒(ace2过表达慢病毒：购自载体家，货号lvs(vb200421-1213bkd)-c；furin过表达慢病毒：购自载体家，货号lvs(vb200420-1476wpj)-c)，48h之后收集病毒并浓缩纯化测定其病毒滴度，最后用纯化后的病毒感染293t细胞，通过潮霉素150ug/ml以及杀稻瘟菌素15ug/ml去筛选，直至空白对照全死光，即获得在293t上过稳定表达ace2和furin的细胞株(将其命名为人肾上皮细胞293t-ace2-furin，以下简称293t-ace2-furin细胞)。

通过qpcr验证稳转细胞株是否成功。具体步骤如下：

1、使用qiaampviralrnaminikit(250)52906试剂盒进行病毒核酸的提取，具体操作如下：

1)将超离后的病毒液用1×pbs进行20倍稀释；

2)吸取310μlbufferave加入到装有310μg冷冻carrierrna的管子中，配成1μg/μl的溶液，充分溶解后，将其分成合适的等分，-20℃冻存，反复冻融不要超过3次；

3)检查bufferavl的沉淀情况，必要的话可置于80℃温育至沉淀溶解；

4)按照表2及公式计算一批样品所需的bufferavl-carrierrnaave混合物的体积，轻柔地颠倒混匀10次，不要涡旋，避免产生泡沫；

5)吸取560μl准备好的bufferavl(含有5.6μlcarrierrnaave)到1.5mlep管中；

6)将140μl样品加入上述管中，混匀15s，室温孵育10min；

7)瞬时离心，将盖子上的液滴甩回管底；

8)加入560μl无水乙醇(96-100％)，混匀15s，瞬时离心，将盖子上的液滴甩回管底。(如果样品量大于140μl，按比例增加无水乙醇的量。该步骤要充分混匀，形成均一溶液以保证产量)；

9)吸取630μl到column中(注意不要碰到柱子的边缘)，盖上盖子，6000×g(8000rpm)离心1min，把column放到干净的收集管中；

10)重复以上步骤，直至所有裂解液均上柱；

11)加入500μlaw1(确保已加入无水乙醇)，8000rpm离心1min，将column放到新的收集管中(即使样品量大于140μl，也无需增加aw1的量)；

12)加入500μlaw2(确保已加入无水乙醇)，14000rpm离心3min；

13)弃掉废液，换新的收集管，14000rpm离心1min；

14)换1.5mlep管，在column中加入30μlave，室温静置1min，8000rpm离心1min。洗脱的病毒rna在-20℃或-70℃可稳定保存1年。

表2.bufferavl与carrierrnaave混合体积表

2、使用invitrogensuperscriptiiifirst-strandsynthesissystemforrt-pcr(50kit)18080-051试剂盒进行逆转录，具体操作如下：

1)使用前将试剂先混匀并离心；

2)8μl提取的病毒rna，1μl50μmoligo(dt)，1μl10mmdntp，组成反应a液，混匀，65℃反应5min。

3)准备cdna合成反应b液，如表3所示：

表3.b液组分

4)将a液和b液混匀，50℃反应50min，85℃反应5min。

5)结束后，加入1μlrnaseh，37℃反应20min。

6)最后将cdna置于-20℃备用。

3、使用takaratbgreenpremixextaqii(tlirnasehplus)rr820a染料法real-timepcr进行病毒定量，具体操作如下：

标准曲线的建立：

1)合成上、下游引物，具体序列如表1和表4所示：

表4.引物的序列

2)将质粒标准品进行梯度稀释(50000ng/μl～3.2ng/μl)，作为模板加入反应体系中，设置3个复孔，反应体系如表5所示：

表5.反应体系

反应条件：预变性95℃30s；pcr反应95℃3s，60℃30s，读取荧光数据，40个循环。反应进行熔解曲线分析。

3)根据读取的荧光数据，由系统软件自动分析循环阈值(cyclethreshold,ct)，并生成标准曲线。

待测样品定量分析：

1)按照标准曲线的反应体系及条件进行待测样品的定量分析；

2)反应完毕后根据融解曲线分析pcr产物的特异性，并由abi7500fastrt-pcr仪分析定量结果。

qpcr结果如图3和图4所示，293t-ace2-furin细胞与293t细胞相比ace2和furin的表达均提高了100倍以上。

实施例2.假病毒在不同细胞中的感染力比较

按照实施例1的方法，分别制备过稳定表达ace2的细胞株和过稳定表达furin的细胞株，并分别命名为细胞293t-furin和细胞293t-ace2。本实施例意欲测试细胞株293t-furin、293t-ace2和293t-ace2-furin的感染效力。

假病毒感染力测试步骤如下：

1)封边：将96孔板四周的36个孔中加入260ul高压灭菌水封边，减少因边缘孔培养基蒸发带来的误差。

2)向孔b2-g2中加入150μl假病毒原液。

3)其余的54孔中加入100μl培养基，孔b10-g10作为细胞对照(cc)。

4)之后从孔b2-g2开始，向孔b3-g3至b9-g9各孔进行3倍倍比稀释，最后孔b9-g9取出的50μl液体弃去。

5)将100μl293t-furin、293t-ace2和293t-ace2-furin细胞悬液(1×10⁵cells/ml)加入96孔板中间的60孔中。

6)将上述96孔放于5％co2，37℃孵箱中，培养24小时后检测。

7)每孔吸弃100μl液体，加入100μlbright-glotm荧光检测试剂，避光室温放置2min后，反复吹打，转移150μl液体至白板中。

8)使用perkinelmerensight多功能成像酶标仪读取荧光值(rlu)。

9)以细胞对照的3倍为cutoff值，用reed-muench法计算假病毒滴度。

用sars-cov-2假病毒(该假病毒为本实验室自行构建，该假病毒的具体构建过程及其它信息参考文献natureprotocolquantificationofsars-cov-2neutralizingantibodybyapseudotypedvirus-basedassay2020nov；15(11):3699-3715.doi:10.1038/s41596-020-0394-5.epub2020sep25.)感染以上稳转的细胞株，结果如图5显示，在感染相同量的sars-cov-2假病毒情况下，与细胞293t-ace2和293t-furin相比，细胞293t-ace2-furin的荧光值提高了20倍左右。

实施例3.中和抗体检测方法的建立

本实施例进一步探索sars-cov-2假病毒在huh-7和293t-ace2-furin细胞的感染力。假病毒感染力测试步骤同实施例2的描述，其中，加入相同量(1200tcid50和2*10⁴/well)的huh-7细胞和过表达ace2和furin的293t-ace2-furin细胞。

酶标仪读取的结果如图6所示，293t-ace2-furin的荧光值是huh-7的5倍以上，证明选用293t-ace2-furin细胞可显著提高病毒的感染力。

进一步的，本实施例比较了不同稀释度的sars-cov-2假病毒在293t-ace2-furin细胞和huh-7细胞上的荧光值，假病毒感染力测试步骤同实施例2的描述。结果如图7所示，我们发现当使用293t-ace2-furin细胞时，仅仅加入300tcid50的病毒量和1*10⁴/well的细胞量，其假病毒感染效率就与huh-7细胞上加入1200tcid50病毒量和2*10⁴/well的细胞量的荧光值相当。也就是说，当使用293t-ace2-furin细胞时，假病毒的使用量是原先使用量的四分之一，而细胞使用量是原先使用量的二分之一。

接着，以293t-ace2-furin和huh-7分别作为中和抗体检测的效应细胞，比较不同sars-cov-2假病毒加入量和不同细胞加入量对中和抗体检测的影响。采用了4种不同的sars-cov-2抗体，分别命名为sample1-4，其中，sample1为rbd蛋白自免小鼠血清1，sample2为rbd蛋白自免小鼠血清2(sample1和2为本实验室自己免疫的小鼠血清，其具体的制备方法和过程参考《抗体制备与使用实验指南》)，sample3为js016(上市单抗)，sample4为dxp-593丹序生物单抗。首先，将4种抗体分别与sars-cov-2假病毒共同孵育1小时，然后加入huh-7和293t-ace2-furin细胞进行侵染，假病毒感染力测试步骤同实施例2的描述。

结果如图8所示，sample1的id50(即50％抑制浓度：抑制50％假病毒时，抗体或血清的稀释倍数)的变化范围在0.5-1.1之间，使用293t-ace2-furin细胞(加入300tcid50的病毒量和1*10⁴/well的细胞量)的id50是huh-7细胞(加入1200tcid50的病毒量和2*10⁴/well的细胞量)的1.05倍；sample2的id50的变化范围在0.3-0.8之间，使用293t-ace2-furin细胞(加入300tcid50的病毒量和1*10⁴/well的细胞量)的id50是huh-7的(加入1200tcid50的病毒量和2*10⁴/well的细胞量)0.8倍；sample3的id50的变化范围在0.35-1.1之间，使用293t-ace2-furin细胞(加入300tcid50的病毒量和1*10⁴/well的细胞量)的id50是huh-7的(加入1200tcid50的病毒量和2*10⁴/well的细胞量)1.1倍；sample4的id50的变化范围在0.35-0.75之间，293t-ace2-furin细胞(加入300tcid50的病毒量和1*10⁴/well的细胞量)的id50是huh-7的(加入1200tcid50的病毒量和2*10⁴/well的细胞量)0.65倍。

如图9所示，使用293t-ace2-furin细胞时，加入300tcid50的病毒量和1*10⁴/well的细胞量的抑制率拟合曲线r²均大于0.99，从病毒加入量和细胞加入量最节省原则，以及与huh-7比较id50来看，选用300tcid50的病毒量和1*10⁴/well的293t-ace2-furin细胞量为最优选择。

综上，本发明成功构建了过表达furin和ace2的293t细胞，使中和抗体检测时病毒使用量从1.2*10³tcid50/孔减少至0.3*10³tcid50/孔，从而建立了一种稳定、高效、且成本小的sars-cov-2假病毒中和抗体检测方法。

尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，但本领域技术人员将理解：根据已经公布的所有教导，可以对细节进行各种修改和变动，并且这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部分为由所附权利要求及其任何等同物给出。

序列表

<110>中国食品药品检定研究院

<120>基于sars-cov-2假病毒的中和抗体检测方法

<130>idc210075

<160>10

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>805

<212>prt

<213>artificial

<220>

<223>ace2蛋白

<400>1

metsersersersertrpleuleuleuserleuvalalavalthrala

151015

alaglnserthrileglugluglnalalysthrpheleuasplysphe

202530

asnhisglualagluaspleuphetyrglnserserleualasertrp

354045

asntyrasnthrasnilethrglugluasnvalglnasnmetasnasn

505560

alaglyasplystrpseralapheleulysgluglnserthrleuala

65707580

glnmettyrproleuglngluileglnasnleuthrvallysleugln

859095

leuglnalaleuglnglnasnglyserservalleusergluasplys

100105110

serlysargleuasnthrileleuasnthrmetserthriletyrser

115120125

thrglylysvalcysasnproaspasnproglnglucysleuleuleu

130135140

gluproglyleuasngluilemetalaasnserleuasptyrasnglu

145150155160

argleutrpalatrpglusertrpargsergluvalglylysglnleu

165170175

argproleutyrgluglutyrvalvalleulysasnglumetalaarg

180185190

alaasnhistyrgluasptyrglyasptyrtrpargglyasptyrglu

195200205

valasnglyvalaspglytyrasptyrserargglyglnleuileglu

210215220

aspvalgluhisthrpheglugluilelysproleutyrgluhisleu

225230235240

hisalatyrvalargalalysleumetasnalatyrprosertyrile

245250255

serproileglycysleuproalahisleuleuglyaspmettrpgly

260265270

argphetrpthrasnleutyrserleuthrvalpropheglyglnlys

275280285

proasnileaspvalthraspalametvalaspglnalatrpaspala

290295300

glnargilephelysglualaglulysphephevalservalglyleu

305310315320

proasnmetthrglnglyphetrpgluasnsermetleuthrasppro

325330335

glyasnvalglnlysalavalcyshisprothralatrpaspleugly

340345350

lysglyasppheargileleumetcysthrlysvalthrmetaspasp

355360365

pheleuthralahishisglumetglyhisileglntyraspmetala

370375380

tyralaalaglnpropheleuleuargasnglyalaasngluglyphe

385390395400

hisglualavalglygluilemetserleuseralaalathrprolys

405410415

hisleulysserileglyleuleuserproasppheglngluaspasn

420425430

gluthrgluileasnpheleuleulysglnalaleuthrilevalgly

435440445

thrleuprophethrtyrmetleuglulystrpargtrpmetvalphe

450455460

lysglygluileprolysaspglntrpmetlyslystrptrpglumet

465470475480

lysarggluilevalglyvalvalgluprovalprohisaspgluthr

485490495

tyrcysaspproalaserleuphehisvalserasnasptyrserphe

500505510

ileargtyrtyrthrargthrleutyrglnpheglnpheglngluala

515520525

leucysglnalaalalyshisgluglyproleuhislyscysaspile

530535540

serasnserthrglualaglyglnlysleupheasnmetleuargleu

545550555560

glylyssergluprotrpthrleualaleugluasnvalvalglyala

565570575

lysasnmetasnvalargproleuleuasntyrphegluproleuphe

580585590

thrtrpleulysaspglnasnlysasnserphevalglytrpserthr

595600605

asptrpserprotyralaaspglnserilelysvalargileserleu

610615620

lysseralaleuglyasplysalatyrglutrpasnaspasnglumet

625630635640

tyrleupheargserservalalatyralametargglntyrpheleu

645650655

lysvallysasnglnmetileleupheglyglugluaspvalargval

660665670

alaasnleulysproargileserpheasnphephevalthralapro

675680685

lysasnvalseraspileileproargthrgluvalglulysalaile

690695700

argmetserargserargileasnaspalapheargleuasnaspasn

705710715720

serleuglupheleuglyileglnprothrleuglyproproasngln

725730735

proprovalseriletrpleuilevalpheglyvalvalmetglyval

740745750

ilevalvalglyilevalileleuilephethrglyileargasparg

755760765

lyslyslysasnlysalaargserglygluasnprotyralaserile

770775780

aspileserlysglygluasnasnproglypheglnasnthraspasp

785790795800

valglnthrserphe

805

<210>2

<211>794

<212>prt

<213>artificial

<220>

<223>furin蛋白

<400>2

metgluleuargprotrpleuleutrpvalvalalaalathrglythr

151015

leuvalleuleualaalaaspalaglnglyglnlysvalphethrasn

202530

thrtrpalavalargileproglyglyproalavalalaasnserval

354045

alaarglyshisglypheleuasnleuglyglnilepheglyasptyr

505560

tyrhisphetrphisargglyvalthrlysargserleuserprohis

65707580

argproarghisserargleuglnarggluproglnvalglntrpleu

859095

gluglnglnvalalalysargargthrlysargaspvaltyrglnglu

100105110

prothraspprolyspheproglnglntrptyrleuserglyvalthr

115120125

glnargaspleuasnvallysalaalatrpalaglnglytyrthrgly

130135140

hisglyilevalvalserileleuaspaspglyileglulysasnhis

145150155160

proaspleualaglyasntyraspproglyalaserpheaspvalasn

165170175

aspglnaspproaspproglnproargtyrthrglnmetasnaspasn

180185190

arghisglythrargcysalaglygluvalalaalavalalaasnasn

195200205

glyvalcysglyvalglyvalalatyrasnalaargileglyglyval

210215220

argmetleuaspglygluvalthraspalavalglualaargserleu

225230235240

glyleuasnproasnhisilehisiletyrseralasertrpglypro

245250255

gluaspaspglylysthrvalaspglyproalaargleualagluglu

260265270

alaphepheargglyvalserglnglyargglyglyleuglyserile

275280285

phevaltrpalaserglyasnglyglyarggluhisaspsercysasn

290295300

cysaspglytyrthrasnseriletyrthrleuserileserserala

305310315320

thrglnpheglyasnvalprotrptyrserglualacysserserthr

325330335

leualathrthrtyrserserglyasnglnasnglulysglnileval

340345350

thrthraspleuargglnlyscysthrgluserhisthrglythrser

355360365

alaseralaproleualaalaglyileilealaleuthrleugluala

370375380

asnlysasnleuthrtrpargaspmetglnhisleuvalvalglnthr

385390395400

serlysproalahisleuasnalaasnasptrpalathrasnglyval

405410415

glyarglysvalserhissertyrglytyrglyleuleuaspalagly

420425430

alametvalalaleualaglnasntrpthrthrvalalaproglnarg

435440445

lyscysileileaspileleuthrgluprolysaspileglylysarg

450455460

leugluvalarglysthrvalthralacysleuglygluproasnhis

465470475480

ilethrargleugluhisalaglnalaargleuthrleusertyrasn

485490495

argargglyaspleualailehisleuvalserprometglythrarg

500505510

serthrleuleualaalaargprohisasptyrseralaaspglyphe

515520525

asnasptrpalaphemetthrthrhissertrpaspgluaspproser

530535540

glyglutrpvalleugluilegluasnthrserglualaasnasntyr

545550555560

glythrleuthrlysphethrleuvalleutyrglythralaproglu

565570575

glyleuprovalproprogluserserglycyslysthrleuthrser

580585590

serglnalacysvalvalcysglugluglypheserleuhisglnlys

595600605

sercysvalglnhiscysproproglyphealaproglnvalleuasp

610615620

thrhistyrserthrgluasnaspvalgluthrileargalaserval

625630635640

cysalaprocyshisalasercysalathrcysglnglyproalaleu

645650655

thraspcysleusercysproserhisalaserleuaspprovalglu

660665670

glnthrcysserargglnserglnserserarggluserproprogln

675680685

glnglnproproargleuproprogluvalglualaglyglnargleu

690695700

argalaglyleuleuproserhisleuprogluvalvalalaglyleu

705710715720

sercysalapheilevalleuvalphevalthrvalpheleuvalleu

725730735

glnleuargserglypheserpheargglyvallysvaltyrthrmet

740745750

aspargglyleuilesertyrlysglyleuproproglualatrpgln

755760765

gluglucysproseraspserglugluaspgluglyargglygluarg

770775780

thralapheilelysaspglnseralaleu

785790

<210>3

<211>26

<212>prt

<213>artificial

<220>

<223>furin蛋白的信号肽

<400>3

metgluleuargprotrpleuleutrpvalvalalaalathrglythr

151015

leuvalleuleualaalaaspalaglngly

2025

<210>4

<211>17

<212>prt

<213>artificial

<220>

<223>ace2蛋白的信号肽

<400>4

metsersersersertrpleuleuleuserleuvalalavalthrala

151015

ala

<210>5

<211>20

<212>dna

<213>artificial

<220>

<223>ace2-f

<400>5

gcagccacacctaagcattt20

<210>6

<211>20

<212>dna

<213>artificial

<220>

<223>ace2-r

<400>6

aaatggcagagtcccaacaa20

<210>7

<211>20

<212>dna

<213>artificial

<220>

<223>furin-f

<400>7

atgactactccgcagatggg20

<210>8

<211>20

<212>dna

<213>artificial

<220>

<223>furin-r

<400>8

cagcgtcccatagttgttgg20

<210>9

<211>8

<212>prt

<213>artificial

<220>

<223>flag标签

<400>9

asptyrlysaspaspaspasplys

15

<210>10

<211>10

<212>prt

<213>artificial

<220>

<223>myc标签

<400>10

gluglnlysleuileserglugluaspleu

1510