恶臭假单胞菌基因工程菌及其构建方法和应用

本发明属于微生物及基因工程技术领域，具体涉及恶臭假单胞菌基因工程菌及其构建方法和应用。

背景技术：

鼠李糖脂作为一种高效的生物表面活性，可以显著降低界面表面张力，乳化性能优异，可促进烃类、油脂类等疏水底物的降解，具有高生物降解性及环境友好的特性，已在化工，医药，化妆，石油后期采收和环境污染治理等行业中获得广泛的应用。

铜绿假单胞菌(pseudomonasaeruginosa)是研究的最多的鼠李糖脂产生菌，可以在疏水性底物例如植物油上生长，其鼠李糖脂生产机制明晰。但是，铜绿假单胞菌又名绿脓杆菌，是一种人体机会性致病菌，会带来一系列的安全问题，不能大规模工业化应用。因此，人们期望利用相对安全的工业微生物进行鼠李糖脂的生产。

鼠李糖脂的异源生产可以将鼠李糖脂的生物合成与复杂的群体感应调控分开。其中，恶臭假单胞菌（pseudomonasputidakt2440）是一种gras认证环境安全的非致病性假单胞菌种，遗传背景清晰，产物的生物合成过程不受细胞群体感应的影响，可进行外源诱导物的人工调控合成。同时具有出色的降解芳香族化合物的能力以及在恶劣条件下的强大生存能力，因此是生物修复，代谢工程和生物催化的理想底盘，并且很多基因组编辑方法已应用于恶臭假单胞菌。鼠李糖脂的生产菌铜绿假单胞菌可以很好的利用植物油生长并生产，然而，恶臭假单胞菌本身并不能利用植物油生长。

技术实现要素：

本发明的目的在于实现由安全的工业微生物高效利用植物油进行鼠李糖脂的生产。

为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种恶臭假单胞菌基因工程菌，所述基因工程菌通过在宿主菌中表达铜绿假单胞菌来源的鼠李糖脂合成相关基因簇rhlirba获得；所述基因簇rhlirba的核苷酸序列如seqidno：1或seqidno：2所示。

进一步的，所述基因簇rhlirba构建在质粒pbbrmcs-5上。

进一步的，所述宿主菌为恶臭假单胞菌kt2440。

本发明的另一目的在于提供上述恶臭假单胞菌基因工程菌的构建方法，包括：

（1）根据基因簇rhlirba序列设计引物，以铜绿假单胞菌基因组dna为模板，扩增出rhlirba全序列，酶切一步克隆方式插入质粒，获得表达质粒；

（2）制备宿主菌电转感受态，将表达质粒电转至宿主菌电转感受态细胞中，获得所述恶臭假单胞菌基因工程菌。

本发明的又一目的在于提供上述恶臭假单胞菌基因工程菌在产鼠李糖脂中的应用。

本发明所述基因工程菌能够以植物油为碳源发酵。

所述基因工程菌在添加庆大青霉素的种子培养基中进行种子培养。

进一步的，所述基因工程菌在180-200rpm、ph7.0-7.2、30℃条件下发酵培养。

进一步的，所述基因工程菌所产鼠李糖脂为单鼠李糖脂。

进一步的，所述基因工程菌发酵培养的培养基组分为：菜籽油60g/l；硝酸钠7.7g/l；氯化钠1.0g/l；氯化钾0.1g/l；氯化钙0.01g/l；磷酸二氢钾3.5g/l；磷酸氢二钠3.5g/l；硫酸镁0.26g/l；硫酸铁0.001g/l；酵母粉0.5g/l；微量元素：3.8ml/l；

微量元素组成：三氯化铁0.08g/l；硫酸锌0.75g/l；硫酸铜0.075g/l；硫酸锰0.75g/l；硼酸0.15g/l。

本发明扩增出不同来源恶臭假单胞菌的rhlirba基因簇，针对两种不同来源rhlirba所构建的质粒pbbrmcs5-rhlirba(f.kt1115)和pbbrmcs5-rhlirba(f.pao1)均可在恶臭假单胞菌kt2440中表达并可产生鼠李糖脂生物表面活性剂，且只产生单鼠李糖脂（rha-c10-c10），原始铜绿假单胞菌菌合成的是成分复杂的单双鼠李糖脂混合物。其中p.putidakt2440-pbbrmcs5-rhlirba(f.kt1115)可以更好的利用植物油生产更多的鼠李糖脂。同时，恶臭假单胞菌为gras认证安全菌株，所述恶臭假单胞菌工程菌株，避免了铜绿假单胞菌的致病性，提高了培养生产过程的安全性；避免了铜绿假单胞菌中鼠李糖脂合成受细胞群体感应调控的特点；能够利用廉价的植物油为碳源合成鼠李糖脂；产物单一，只合成单鼠李糖脂（rha-c10-c10）。

附图说明

图1为p.putidakt2440-pbbrmcs5-rhlirba(f.kt1115)和kt2440-pbbrmcs5-rhlirba(f.pao1)发酵结果图。

图2为表达质粒图谱；a：pbbrmcs5-rhlirba(f.kt1115)质粒；b：pbbrmcs5-rhlirba(f.pao1)质粒。

图3为p.aeruginosakt1115，p.putidakt2440-pbbrmcs5-rhlirba(f.kt1115)和p.putidakt2440-pbbrmcs5-rhlirba(f.pao1)发酵产物薄层色谱（tlc）分析图。

具体实施方式

下面的实施例将对本发明所提供的方法予以进一步的说明，但本发明不限于所列出的实施例，还应包括在本发明所要求的权利范围内其它任何公知的改变。

实施例使用的宿主菌为恶臭假单胞菌（pseudomonasputida）kt2440，购自中国微生物菌种保藏中心。

实施例1恶臭假单胞菌工程菌构建方法

1、p.aeruginosakt1115与p.aeruginosapao1来源的提供鼠李糖脂合成关键基因的克隆

根据鼠李糖脂合成相关的基因簇（rhlirba）序列设计引物，正向引物为5’-gactcactatagggcgaattggagctcccgtcctgtgaaatctggca-3’，引物5’端引入26bp同源臂（pbbrmcs-5中saci酶切位点上游，下划线标出）；5’-cggtatcgataagcttgatatcgaattcgagcatgcggcaggagaagcg-3’，引物5’端引入26bp同源臂（pbbrmcs-5中ecori酶切位点下游，下划线标出）。分别以铜绿假单胞菌p.aeruginosapao1和p.aeruginosakt1115基因组dna为模板，扩增出鼠李糖脂合成相关的基因簇（rhlirba）全序列。两种rhlirba核昔酸序列分别如seqidno：1、seqidno：2所示。

2、鼠李糖脂生产质粒的构建

所用表达质粒载体为pbbrmcs-5。将pbbrmcs-5质粒进行双酶切（ecori-hf，saci-hf，购自南京伟沃生物科技有限公司），使用南京诺唯赞生物科技股份有限公司clonexpress®iionestepcloningkit非连接酶依赖型单片段快速克隆试剂盒，将两种来源的rhlirba分别连接到载体pbbrmcs5，将其转化到e.colidh5α感受态细胞中。e.colidh5α感受态细胞购自南京良纬生物科技有限公司。菌落pcr筛选阳性克隆，提质粒送至北京擎科生物科技有限公司测序，测序正确后命名该质粒pbbrmcs5-rhlirba(f.kt1115)和pbbrmcs5-rhlirba(f.pao1)，同时即得到e.colidh5α-pbbrmcs5-rhlirba(f.kt1115)和e.colidh5α-pbbrmcs5-rhlirba(f.pao1)。得到两种来源的鼠李糖脂生产质粒，两种质粒图谱如图2。

3、鼠李糖脂合成恶臭假单胞菌工程菌的构建

制备恶臭假单胞菌kt2440电转感受态细胞：从-80℃冰箱里取出p.putidakt2440菌种，在没有添加抗生素lb固体培养基上划线，30℃倒置培养16-20h，挑取单菌落至5mllb液体培养基于30℃，200r/min摇床过夜培养；以1:100转接至含50mllb液体培养基的摇瓶中，30℃，200r/min摇床培养至od600nm=0.6~0.75，立即冰浴20min。用4℃离心机以5000r/min、10min收集菌体，用300mmm蔗糖洗涤液洗涤菌体3次。菌体浓缩300倍每100μl分装并用于一次转化。

将50ng上述1所得两种鼠李糖脂生产质粒分别加至p.putidakt2440感受态细胞中，轻轻混匀，转移至预先遇冷的1mm内径的电转杯中，以1.2kv、200ω、25μf的条件电击转化。将900μl的soc混匀后加至1.5ml聚丙烯离心管，以30℃，200r/min摇床培养1h.菌体以10^-3倍稀释涂布在庆大霉素的终浓度为30mg/l的lb固体培养基上，30℃倒置过夜培养。

得到合成鼠李糖脂的恶臭假单胞菌基因工程菌株kt2440-pbbrmcs5-rhlirba(f.kt1115)和kt2440-pbbrmcs5-rhlirba(f.pao1)。

实施例2产鼠李糖脂恶臭假单胞菌工程菌发酵验证

上述两种恶臭假单胞菌工程菌的应用，具体步骤为：

1、发酵过程控制

将菌株在含30mg/l庆大青霉素的lb固体培养基上划线，30℃培养18h。挑取恶臭假单胞菌工程菌kt2440-pbbrmcs5-rhlirba(f.kt1115)单菌接种于5ml含30mg/l庆大青霉素的液体lb试管中，30℃，200r/min振荡培养过夜后，按1%的接种量接种于50ml含30mg/l庆大青霉素的液体lb摇瓶中，30℃，200r/min，振荡培养至对数期。

lb固体培养基配方为：酵母粉5g/l、蛋白胨10g/l、nacl10g/l、琼脂粉15g/l，加水补足体积；lb培养基配方为：酵母粉5g/l、蛋白胨10g/l、nacl10g/l，加水补足体积。121℃高压湿热灭菌15分钟。

将上述培养好的菌种按体积比5%的接种量接种入500ml装有100ml发酵培养基的摇瓶中，并添加庆大青霉素（30mg/l），30℃，200r/min振荡培养140-144h，得到发酵液。

发酵培养基配方为：菜籽油60g/l；硝酸钠7.7g/l；氯化钠1.0g/l；氯化钾0.1g/l；氯化钙0.01g/l；磷酸二氢钾3.5g/l；磷酸氢二钠3.5g/l；硫酸镁0.26g/l；硫酸铁0.001g/l；酵母粉0.5g/l；微量元素：3.8ml/l，加水补足体积，ph值7.0-7.2。微量元素组成：三氯化铁0.08g/l；硫酸锌0.75g/l；硫酸铜0.075g/l；硫酸锰0.75g/l；硼酸0.15g/l。121℃高压湿热灭菌15分钟。

用相同的培养方法对工程菌kt2440-pbbrmcs5-rhlirba(f.pao1)进行发酵。

以上摇瓶发酵均设一式三份进行实验。

2、发酵液中残余植物油的提取和检测

残余植物油的提取：取上述步骤1中收集的发酵液0.75ml于1.5ml离心管，加入0.75ml正己烷，震荡1min，静置分层，将上层有机相转移至已知质量的1.5ml离心管。

残余植物油的检测：将上述装有有机相的1.5ml离心管敞开干燥，称其质量，减去管重，得残余植物油质量。

恶臭假单胞菌基因工程菌株kt2440-pbbrmcs5-rhlirba(f.kt1115)和kt2440-pbbrmcs5-rhlirba(f.pao1)所消耗菜籽油分别为33.5g/l，22.2g/l。

3、发酵液中鼠李糖脂的提取

将上述步骤1中收集的发酵液于低温高速离心机4℃，10000r/min离心20min，取上清液，用hc1溶液调节上清液ph至1.0-2.0，静置于4℃冰箱过夜；低温高速离心机4℃，10000r/min离心20min，取沉淀，并用ph2.0的盐酸溶液洗涤沉淀3次，用3ml氯仿：乙醇（2:1，v/v）萃取3次，合并收集有机相，干燥后得到粉末为发酵产物的粗提物，用于tlc和lc-ms测定。

4、发酵液中鼠李糖脂的定性（tlc和lc-ms）

薄层色谱（tlc）初步确定发酵产物：上述3提取所得干燥的鼠李糖脂产物溶于乙酸乙酯，将5μl该溶液点在硅胶tlc板上。对照组为铜绿假单胞菌发酵液中提取的单双鼠李糖脂混合物，展开剂为氯仿：甲醇：乙酸（65：15：2），显色剂为80%（体积分数）的浓硫酸。将干燥的板在80℃下孵育30分钟，结果图3所示。

液质联用（lc-ms）确定发酵产物：流动相由a相(甲酸：甲醇=1:1000)和b相(甲酸：乙腈=1:1000)组成，流速：0.3ml/min；柱温：30℃，进样量0.3ul。梯度洗脱程序：0min，10%b；3min，10%b；33min，90%b；65min，90%b。hplc/q-t0f-ms系统使用esi离子源，在正离子模式下采集数据。离子采集范围：0-1000m/z。

结果表明，本发明中两种产鼠李糖脂的表达质粒能够实现在恶臭假单胞菌利用植物油产鼠李糖脂，所产鼠李糖脂为单鼠李糖脂。

5、鼠李糖脂的定量检测

采用蔥酮-硫酸法检测发酵液中鼠李糖脂的浓度，具体操作如下：精确称取0.20g蒽酮溶于100ml体积分数为80%的浓硫酸中，得蒽酮-硫酸溶液（避光，现配现用）。取0.5ml适当稀释后的样品待测液在冰浴中加入2ml蒽酮-硫酸溶液，充分混合，再沸水浴10min后，取出放入冰水浴冷却至室温。控制紫外吸收波长为620nm，利用酶标仪测试反映液吸光度，代入用标准鼠李糖制作的标准曲线中计算鼠李糖脂浓度，空白组用蒸馏水做对照。

产鼠李糖脂恶臭假单胞菌基因工程菌株kt2440-pbbrmcs5-rhlirba(f.kt1115)和kt2440-pbbrmcs5-rhlirba(f.pao1)发酵液中鼠李糖脂含量分别为：7.04g/l，5.68g/l。

结果表明，kt2440-pbbrmcs5-rhlirba(f.kt1115)和kt2440-pbbrmcs5-rhlirba(f.pao1)均可利用植物油生产鼠李糖脂，其中p.putidakt2440-pbbrmcs5-rhlirba(f.kt1115)可以更好的利用植物油生产更多的鼠李糖脂。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

序列表

<110>南京工业大学

<120>恶臭假单胞菌基因工程菌及其构建方法和应用

<130>xb21042803

<160>2

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>4204

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

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