富铬富锌醋酸杆菌及其制备方法和应用

富铬富锌醋酸杆菌及其制备方法和应用
1.技术领域
2.本发明属于医药领域，具体涉及一种富铬富锌醋酸杆菌及其制备方法和应用。
3.

背景技术：

4.糖尿病（diabetes mellitus，dm）是一种慢性糖代谢障碍的疾病，2017年世界糖尿病患病人口约为4.25亿(20～79岁)，预计到2045年，糖尿病患病人数将增长至6.29亿。糖尿病及其并发症所造成的病痛和疾病负担是困扰全球人民的重大健康问题和社会经济问题。而我国的糖尿病患病人口高居世界第一，且有逐年递增的趋势。糖尿病患者常可发生一些严重并发症，如糖尿病肾病、糖尿病眼病、心血管系统病变等，严重危害人类的生命与健康。ii型糖尿病( type 2 diabetes mellitus，t2dm) 占全部糖尿病患者的90%～95%，故t2dm在糖尿病流行病学研究中处于重要位置。多年来众多学者对糖尿病病因和防治方法做了大量的研究，但糖尿病病因还未完全明确，发病机理复杂，机制仍未完全阐明，尚无有效根治药物。目前糖尿病的综合防治措施主要有控制饮食、加强锻炼、药物治疗；用于治疗的药物主要是化学药物，生物药物非常少。有报道是红茶菌是酵母菌、乳酸菌和醋酸菌的共生物，利用其代谢物与红茶制备的保健饮品能降血糖、降血压、降血脂等，对“三高”患者有一定的辅助疗效，其中降糖活性成分主要为茶多酚和d
‑
葡萄糖二酸
‑
1,4
‑
内酯（dsl），这2种成分均不是细菌的代谢产物，细菌代谢物降糖的作用未能充分体现，比如醋酸杆菌尚有nadh
‑
辅酶和葡萄糖醛酸脱氢酶等，它们在醋酸杆菌通过糖酵解等分解葡萄糖的途径中有重要作用，而红茶菌却未能充分利用好这些代谢酶的作用提高降糖的效果，只能作为一种辅助治疗的保健饮品。因此，如何才能利用好醋酸杆菌对葡萄糖的代谢能力，提高nadh
‑
辅酶和葡萄糖醛酸脱氢酶等代谢酶的含量发挥良好的降糖作用，这是醋酸杆菌成为降血糖药物首先要解决的关键问题。
5.

技术实现要素：

6.解决的技术问题：为了解决治疗t2dm生物药品奇缺的问题，提高醋酸杆菌降血糖的效果，本发明提供一种富铬富锌醋酸杆菌及其制备方法和应用，制备得的富铬富锌醋酸杆菌nadh
‑
辅酶和葡萄糖醛酸脱氢酶及胞内铬、锌等微量元素明显提升，对胰岛细胞有一定的修复作用，促进胰岛素的分泌，降血糖效果良好，可作为治疗t2dm的候选药物。
7.技术方案：一种富铬富锌巴氏醋酸杆菌的制备方法，包括如下步骤：第一步，复苏巴氏醋酸杆菌并液体增菌培养，使菌液浓度为od
600
0.9~1.5；第二步，培养用富铬富锌的巴氏醋酸杆菌液体培养基培养，其中三氯化铬、氯化锌的浓度均为64~128μg/ml，菌液初始浓度为1
×
104cfu/ml，250转/分，摇培培养48小时；第三步，重复第二步的培养1~3次；第四步，收集菌液，离心弃上清，pbs洗涤沉淀，沉淀物即为富铬富锌的巴氏醋酸杆菌。
8.优选的，上述用于富铬富锌巴氏醋酸杆菌培养的培养基中三氯化铬、氯化锌的浓度均为64μg/ml。
9.优选的，上述富铬富锌巴氏醋酸杆菌重复培养次数为1次。
10.上述制备方法制得富铬富锌巴氏醋酸杆菌。
11.上述富铬富锌巴氏醋酸杆菌在制备治疗糖尿病药物中的应用。
12.治疗糖尿病药物，有效成分为上述富铬富锌巴氏醋酸杆菌。
13.有益效果：本发明成功制备富铬富锌巴氏醋酸杆菌，产率比较高；其次，本发明富铬富锌巴氏醋酸杆菌制备方法简单、成本低；第三，本发明制备的富铬富锌巴氏醋酸杆菌可用于治疗t2dm，降糖效果明显、毒副作用小、对胰岛细胞有修复作用，可以缓解治疗t2dm生物药品奇缺的问题。
14.附图说明
15.图1为富铬富锌巴氏醋酸杆菌nadh
‑
辅酶、葡萄糖醛酸脱氢酶、铬和锌含量；图2为富铬富锌巴氏醋酸杆菌对糖尿病小鼠的降糖作用；图3为富铬富锌巴氏醋酸杆菌促胰岛组织、细胞的修复作用；图4为富铬富锌巴氏醋酸杆菌对糖尿病小鼠的体重的恢复作用；图5为富铬富锌巴氏醋酸杆菌促胰岛min6细胞生长作用；图6为富铬富锌巴氏醋酸杆菌促胰岛min6细胞分泌胰岛素作用；图7为富铬富锌巴氏醋酸杆菌对葡萄糖的分解能力；图8为富铬富锌巴氏醋酸杆菌安全性检测。
16.具体实施方式
17.实施例 1第一步，复苏巴氏醋酸杆菌并液体增菌培养，使菌液浓度为od
600
0.9~1.5，约为3
×
108~5
×
108cfu/ml；第二步，富铬富锌培养，用富铬富锌的巴氏醋酸杆菌液体培养基（三氯化铬、氯化锌的浓度均为64μg/ml），菌液初始浓度为1
×
104cfu/ml，250转/分，摇培培养48小时；第三步，重复第二步的培养，1次；第四步，收集菌液，离心弃上清，pbs洗涤沉淀，沉淀物即为富铬富锌的巴氏醋酸杆菌。
18.实施例 2第一步，复苏巴氏醋酸杆菌并液体增菌培养，使菌液浓度为od
600
0.9~1.5，约为3
×
108~5
×
108cfu/ml；第二步，富铬富锌培养，用富铬富锌的巴氏醋酸杆菌液体培养基（三氯化铬、氯化锌的浓度均为64μg/ml），菌液初始浓度为1
×
104cfu/ml，250转/分，摇培培养48小时；第三步，重复第二步的培养，2次；第四步，收集菌液，离心弃上清，pbs洗涤沉淀，沉淀物即为富铬富锌的巴氏醋酸杆菌。
19.实施例 3
第一步，复苏巴氏醋酸杆菌并液体增菌培养，使菌液浓度为od
600
0.9~1.5，约为3
×
108~5
×
108cfu/ml；第二步，富铬富锌培养，用富铬富锌的巴氏醋酸杆菌液体培养基（三氯化铬、氯化锌的浓度均为128μg/ml），菌液初始浓度为1
×
104cfu/ml，250转/分，摇培培养48小时；第三步，重复第二步的培养，1次；第四步，收集菌液，离心弃上清，pbs洗涤沉淀，沉淀物即为富铬富锌的巴氏醋酸杆菌。
20.实施例 4富铬富锌巴氏醋酸杆菌辅酶和金属含量检测、活性、安全性等评价1.材料1.1 样品富铬富锌巴氏醋酸杆菌用实施例1制备。
21.1.2 菌株、细胞巴氏醋酸杆菌: 购自广东省微生物菌种保藏中心，编号gim1.67；min6细胞：武汉大学细胞保藏中心。
22.1.3 培养基和主要试剂：葡萄糖，广东光华科技股份有限公司，批号：20200403；酵母膏，北京奥博星生物技术有限责任公司，批号：20200422；碳酸钙、上海泰坦科技股份有限公司，批号：p1260108；琼脂，北京索莱宝科技有限公司，批号：310c022；无水乙醇，上海麦克林生化科技有限公司，批号：c11974944；三氯化铬：上海麦克林生化科技有限公司，批号：c10717130；氯化锌: 上海麦克林生化科技有限公司,批号：c10730413；50ml离心管、ep管，江苏乐馨康医疗器械有限公司；stz：链脲佐菌素，上海麦克林生化科技有限公司,批号:c20pa038100b；柠檬酸: 上海麦克林生化科技有限公司，批号：c10723907；柠檬酸钠：上海麦克林生化科技有限公司，批号：c10712912；ph广泛试纸：杭州试三科技有限公司；盐酸二甲双胍片：北京京丰制药集团有限公司，生产批号2004032；（罗氏活力）血糖试纸：罗氏血糖健康医护公司，批号：26020933等。
23.1.4 实验动物：c57bl/6（购自长沙市天勤生物技术有限公司）。
24.1.5 主要仪器：电子天平，梅特勒
‑
托利多国际有限公司，型号：mp6001；罗氏活力型血糖仪（accu
‑
chek performa）；超低温冰箱：海尔公司；超纯水机，四川优普超纯科技有限公司，型号：uph
‑
ii
‑
20tn；电热恒温鼓风干燥箱，上海齐欣科学仪器有限公司，型号：dhg
‑
9240al；酶标仪；高压蒸气灭菌锅，致微（夏门）仪器有限公司，型号：gi54dp；生物安全柜，苏州安泰空气技术有限公司，型号：bsc
‑
1304iia2；离心机，上海安亭高速台式离心机，型号：tgl
‑
16gb；组织破碎仪、电子天平、灌胃针、剪刀等。
25.1.6耗材：ep管、tip头、离心管等。
26.2.方法与结果2.1富铬富锌巴氏醋酸杆菌辅酶和金属含量检测（1）收集富铬富锌巴氏醋酸杆菌
①
富铬富锌巴氏醋酸杆菌菌悬液od值测量在洁净操作台里，取100μl富铬富锌巴氏醋酸杆菌悬液置无菌96孔微量板中，富铬富锌巴氏醋酸杆菌培养液作为空白对照，消除本底。酶标仪600nm波长下，测量巴氏醋酸杆菌悬液和富铬富锌巴氏醋酸杆菌培养液，分别计为od1和od2，最后富铬富锌巴氏醋酸杆菌
悬液的od值= od1
‑ꢀ
od2。
27.②
离心在洁净操作台里，将富铬富锌巴氏醋酸杆菌菌悬液转移至50ml无菌离心管中，配平离心， 8000r离心10分钟。
28.③
收集富铬富锌巴氏醋酸杆菌将离心好的50ml无菌离心管取出，弃上清。离心所得的沉淀即为经铬和锌诱导培养的巴氏醋酸杆菌，即富铬富锌巴氏醋酸杆菌。
29.④
洗涤在洁净操作台里，向50ml离心管中加入1ml无菌pbs，加样枪轻轻吹打混匀。
30.⑤
ep称重备用在洁净操作台里取出一只1.5ml无菌ep管称重，重量计为m1，备用。
31.⑥
离心收集富铬富锌巴氏醋酸杆菌在洁净操作台里，将洗涤好的菌悬液转移至ep管中，13000r 离心1分钟后，弃上请并称沉淀物的重量，记为m2。
32.⑦
富铬富锌巴氏醋酸杆菌配成浓度为0.1mg/ml所得的富铬富锌巴氏醋酸杆菌沉淀质量即为m=m2‑
m1。向沉淀中加入无菌up水，使富铬富锌醋酸杆菌的浓度为0.1mg/ml。
33.（2）检测富铬富锌巴氏醋酸杆菌铬和锌的含量收集的样本送上海微谱分析测试中心，用icp
‑
ms方法检测铬和锌的含量，金属铬含量为28.58～34.34mg/kg，金属锌含量为5.35～7.52mg/kg，明显高于非诱导培养的巴氏醋酸杆菌铬1.05～2.29mg/kg、锌0.18～0.26mg/kg，见图1（a）。
34.（3）检测富铬富锌巴氏醋杆nadh辅酶含量收集富铬富锌巴氏醋杆，使用碧云天的“nad+/nadh检测试剂盒(wst
‑
8法)”，按照试剂盒使用说明书操作。富铬富锌巴氏醋杆nadh辅酶含量为5.13～7.26μm，明显高于非培养的巴氏醋酸杆菌的0.86～1.02μm，见图1（b）。
35.（4）检测富铬富锌巴氏醋杆葡萄糖脱氢酶含量收集富铬富锌巴氏醋杆，使用索莱宝的“葡萄糖脱氢酶（gcdh)检测试剂盒
ꢀ”
，按照试剂盒使用说明书操作。富铬富锌巴氏醋杆葡萄糖脱氢酶含量为446.812～567.138u/g，明显高于非培养的巴氏醋酸杆菌的54.126～93.651u/g，见图1（c）。
36.2.2富铬富锌巴氏醋酸杆菌对糖尿病小鼠的作用评价（1）构建糖尿病小鼠模型和给药治疗
①
柠檬酸盐缓冲液的配制：将2.10g柠檬酸加入双蒸水100ml配成柠檬酸母液，称为a液；将2.94g柠檬酸三钠加入双蒸水100ml配成柠檬酸钠母液，称为b液； 将a、b液按1:1.32（也有按1：1）比例混合，ph计测定ph值，调定溶液ph=4.2至4.5，即是所需配制stz的0.1mol/l柠檬酸钠缓冲液。
37.②
选取动物：spf级c57bl/6j雌性6周龄小鼠70只，重量20
±
2g，适应性喂养5天，小鼠自由进食，自由饮水。随机取6只小鼠做为正常对照组，其余均为造模小鼠。
38.③
链脲佐菌素（streptozotocin，stz）造模给药：称取120mg的stz，加入24ml的0.1mol/l柠檬酸钠缓冲液，（相当于5mg/ml的浓度）避光操作，冰面环境放置，提前给小鼠禁
食10个小时，然后按0.15ml/10克小鼠体重给药(相当于75mg/kg)。采用腹腔注射方式给药，连续3天。每次腹腔注射stz前，在抽取stz药液的时候，要注意用1毫升的注射器先对药液进行吹打，使其沉淀的stz混匀。保持前后注射同等的stz浓度。每次腹腔注射完stz之后，还要保持90分钟的禁食不禁水状态。造模型给药结束后第7天，（小鼠采血之前先禁食不禁水10小时）从尾静脉取血，用罗氏血糖仪测小鼠的空腹血压值（fbg），将fbg≥16.7mmol/l的小鼠认定为糖尿病病理模型构建成功。
39.④
分组与给药：将糖尿病小鼠按血糖值由高至低编号，采用均衡随机法把成模型的小鼠分为模型组（pbs），阳性药对照组（二甲双胍）、金属铬加锌组（按富铬富锌醋酸杆菌的最高含量计算铬和锌浓度分别是1
×
10
‑7mg/ml、2
×
10
‑8mg/ml）、醋酸杆菌组（od=1）、富铬富锌醋酸杆菌组（od=1）。每组6只小鼠，每只灌胃0.5ml。
40.造模型成功后，第2d开始灌胃给药干预，每天给药一次，连续给药15d。正常对照组，模型组均给予等量的pbs水，阳性药对照组给二甲双胍片（研磨成粉状，用ro水配制成混悬液，按0.320g/kg.d灌胃），金属铬加锌组用三氯化铬和氯化锌配置。
41.⑤
一般情况观察给药15d的时间里，每天观察小鼠的活动精神情况，进食与饮水里，大小便、垫料干湿程度等。
42.（2）富铬富锌巴氏醋酸杆菌降糖活性评价按每3天检测一次空腹血糖值，富铬富锌醋酸杆菌组（od=1）糖尿病小鼠血糖明显下降，并优于阳性药对照组（二甲双胍）和金属铬加锌组，见图2。
43.（3）富铬富锌巴氏醋酸杆菌促胰岛组织、细胞的修复作用给药治疗15天后，小鼠禁食10小时，眼球采血，处死小鼠，采集胰腺组织，甲醛固定后切片做he染色，显微镜下观察发现富铬富锌醋酸杆菌组（od=1）胰岛细胞凋亡较少，胰岛结构萎缩和空泡少见；免疫组化检测凋亡相关的bax基因，胰岛细胞凋亡明显减少；电镜切片后观察发现胰岛超微结构损伤减轻，内质网扩张范围较小，线粒体轻微肿胀，自噬空泡数量明显减少。该组胰岛组织细胞恢复明显优于阳性药对照组（二甲双胍），见图3。
44.（4）为富铬富锌巴氏醋酸杆菌对糖尿病小鼠的体重的恢复作用按每3天记录一次小鼠体重，富铬富锌醋酸杆菌组（od=1）糖尿病小鼠体重恢复良好，但与阳性药对照组（二甲双胍）无明显差异，见图4。
45.2.3富铬富锌巴氏醋酸杆菌对胰岛细胞min6的作用评价（1）富铬富锌巴氏醋酸杆菌对胰岛细胞min6生长作用收集富铬富锌醋酸杆菌（od=10），超声破碎后保存于
‑
20℃备用。复苏胰岛细胞min6，调整细胞浓度为1
×
105cfu/ml，培养基分别用5mmol/l和25mmol/l的高糖1640培养基，加入96孔板，90μl/孔，培育12小时后加入收集富铬富锌醋酸杆菌（od=10），稀释10倍加10μl，相当于菌量1
×
107cfu/ml，设阳性药对照组（二甲双胍）和阴性药物对照组（pbs），加药后24小时，用碧云天的cck
‑
8试剂盒检测细胞毒性，发现富铬富锌醋酸杆菌组促进min6细胞生长明显优于阳性对照组和阴性对照组，在25mmol/l的高糖1640培养基中尤为明显，见图5。
46.（2）富铬富锌巴氏醋酸杆菌促胰岛min6细胞分泌胰岛素作用收集富铬富锌醋酸杆菌（od=10），超声破碎后保存于
‑
20℃备用。复苏胰岛细胞
min6，调整细胞浓度为1
×
105/ml加入6孔板，1.98ml/孔，培养基分别用5mmol/l和25mmol/l的高糖1640培养基，培育12小时后加入收集富铬富锌醋酸杆菌（od=10）20μl，相当于菌量1
×
107cfu/ml，设阳性药对照组（二甲双胍）和阴性药物对照组（pbs），加药后24小时，收集细胞上清液，用酶免的“小鼠胰岛素酶联免疫分析试剂盒”检测胰岛素含量。富铬富锌醋酸杆菌（od=10）组细胞上清胰岛素明显高于阳性对照组和阴性对照组，在25mmol/l的高糖1640培养基中尤为明显，见图6。
47.2.3富铬富锌巴氏醋酸杆菌对葡萄糖的分解能力检测收集富铬富锌醋酸杆菌和巴氏醋酸杆菌，调整起始浓度均为1
×
104cfu/ml，用血糖仪检测液体培养基的葡萄糖浓度，30℃培养12小时、24小时、36小时、48小时后，富铬富锌醋酸杆菌组培养基葡萄糖含量明显降低，降低比例高于巴氏醋酸杆菌组，见图7。
48.2.4富铬富锌巴氏醋酸杆菌安全性检测收集富铬富锌醋酸杆菌，调整od=10，每次给小鼠灌胃1ml，每天3次，连续灌胃7天，检测小鼠体重和脏器的病理变化，未发现体重有明显变化，肝、脾、肾、胃脏器未发现有病理损伤，见图8。