基于LAMP技术的河鲀及其制品快速鉴定方法

基于lamp技术的河鲀及其制品快速鉴定方法
技术领域
1.本发明涉及一种生物检测领域，尤其涉及基于lamp技术的河鲀及其制品快速鉴定方法寄 该方法使用的引物对和试剂盒。


背景技术：

2.河鲀鱼(pufferfish)作为我国等亚洲沿海地区的传统美食，具有非常高的营养价值和经 济价值。但野生河鲀含有剧毒，食用不当可造成严重的中毒甚至死亡。市场上存在河鲀鱼冒 充其他水产品出售的现象，严重损害消费者的生命健康。仅凭形态学方法很难对河鲀制品进 行鉴别，因此急需建立河鲀物种及其制品的快速、准确的分子鉴定方法。
3.食品鉴定主要有传统形态学方法、理化分析以及分子生物学方法。经过深加工的食品， 完全不具备活体状态下的形态后，形态学鉴定的方法完全不能使用。食品的理化分析是指借 助测量工具或仪器，针对蛋白质和脂肪等性质进行分析，常见方法有酶联免疫吸附分析 (elisa)、免疫荧光技术(ift)和高效液相色等方法。但是这些方法往往需要较为新鲜的样品， 一旦食品变质，就会对鉴定结果产生影响。此外，近些年新兴的无损检测技术也受到越来越 多的关注。该技术可以利用光学、电磁学和声学的技术，对食品的表面或内部的结构和性质 进行检测。例如：x射线法、太赫兹技术和红外光谱法。这些方法虽然快速、无损、信息量 大，但是其仪器的维护成本和模型的建立与改进需要的后期成本和技术门槛太高。
4.为此，申请人申请的中国发明专利申请(cn108950007a，公开号：20181207)以4种我 国东部沿海地区常见的河鲀为研究对象，即河鲀有黄鳍东方鲀(takifugu xanthopterus)、 暗纹东方鲀(takifugu fasciatus)、菊黄东方鲀(takifuguflavidus)和红鳍东方鲀 (takifugu rubripes)，筛选构建适合的dna条形码coi序列，并在此基础上，设计2对hrm 引物，提供一种基于coi序列的河鲀及其他鱼肉制品的hrm快速鉴定方法。
5.环介导等温扩增技术(loop
‑
mediated isothermal amplification,lamp)由notomi等 于2000年提出，是一种新型的核酸等温扩增技术，即在恒温条件下利用一种具有链置换功能 的dna聚合酶(bst dna polymerase)进行核酸的快速扩增。其引物设计主要针对目的片段 5’端和3’端的6个区域设计2对特异性引物，包括1对内引物(fip、bip)、1对外引物 (f3、b3)。在60～65℃的恒定温度下，内引物识别相应的位点并延伸，同时外引物在bst dnapolymerase的作用下将内引物形成的链置换出来，形成一个哑铃状结构的dna片段，为后续 反应提供模板。之后内引物对其进行识别、延伸，最终形成一系列茎环结构和多环花椰菜结 构的dna片段混合物。
6.在动物源食品方面，特别是在禽畜肉等食品中，已经有大量研究证实lamp技术是切实可 行的。wang等(wang j,wan y,chen g,et al.colorimetric detection of horse meatbased on loop
‑
mediated isothermal amplification(lamp)[j].food analytical methods, 2019,12(11):2535
‑
2541.)以coi基因为目标建立基于hnb及neutral red(中性红)染 料的马肉成分lamp比色检测方法，可在1h内检测牛肉中的马肉成分，检出限达6pg，
并 且通过使用市场销售的dna直接提取液，可将现场检测控制在2h。zhang等(zhang c,zhangx,liao g,et al.species
‑
specific tm
‑
lamp and trident
‑
like lateral flow biosensorfor on
‑
site authenticity detection of horse and donkey meat[j].sensors and actuatorsb
‑
chemical,2019,301:127039.)基于tm
‑
lamp(tag
‑
labeled multiplex loop
‑
mediatedisothermal amplification)和lfb(lateral flow biosensor)建立了马肉和驴肉的现场检 测方法，检测限低至40pg，可在40min完成现场检测。谭贵良等针对猪牛、鸡、鸭的cytb 基因分别设计了特异性lamp引物，建立了食用植物油和餐厨废弃油中动物源成分的lamp检 测方法，可分别检测出动物油脂与餐厨废弃油中含量为1％和5％的动物源成分。girish等 (girish p s,barbuddhe s b,kumari a,et al.rapid detection of pork using alkalinelysis
‑
loop mediated isothermal amplification(al
‑
lamp)technique[j].food control, 2020,110:107015.)基于d
‑
loop序列建立了猪肉成分的lamp检测方法，灵敏度为0.5ng/μl， 可检测出混合样品中0.1％的猪肉成分，通过碱裂解法快速提取dna，结合lamp检测，将检测 时间缩短在120min，即便是经高温处理的样品也依然适用。冼钰茵等(冼钰茵,易敏英,张 璜等.环介导等温扩增技术快速检测肉及肉制品中的牛源性成分[j].食品工业科技,2016, 37(7):278
‑
282.)以牛源性线粒体cytb基因为模板，建立了肉及肉制品中牛源性成分的lamp 检测方法，对市场上12种牛肉及牛肉制品进行检测，结果显示检测限为0.1％。而在水产品 方面，有关于lamp技术的应用还较少。saull等(saull j,duggan c,hobbs g,et al.thedetection of atlantic cod(gadus morhua)using loop mediated isothermal amplificationin conjunction with a simplified dna extraction process[j].food control,2016,59: 306
‑
313.)开发了大西洋鳕鱼的lamp快速鉴定方法，结合简单的dna前处理，大大缩短了样 品的检测时间。并且灵敏度高，能检测到混合样品中0.1％的鳕鱼成分。spielmann等 (spielmann g,ziegler s,haszprunar g,et al.using loop
‑
mediated isothermalamplification for fast species delimitation in eels(genus anguilla),with specialreference to the european eel(anguilla anguilla)[j].food control,2019,101: 156
‑
162.)基于cytb、d
‑
loop序列分别建立了针对鳗鲡属物种以及鳗鲡的lamp快速鉴定方 法，可以用于鳗鲡鱼卵的鉴定。两种方法的检测限均达到500pg，无假阳性反应。tatulli 等(tatulli g,cecere p,maggioni d,et al.a rapid colorimetric assay for on
‑
siteauthentication of cephalopod species[j].biosensors
‑
basel,2020,10(12):1
‑
8.)将 dna快速提取与lamp技术相结合，可在30min实现了头足类物种的快速鉴定。在河鲀物种 上目前还未见相关报道。


技术实现要素：

[0007]
为了解决上述的技术问题，本技术的第一个目的是提供一种基于lamp技术的河鲀及其制 品快速鉴定方法，该方法不同于dna条形码及hrm分析，lamp反应的条件简单、速度快、 灵敏度高，无需借助复杂的大型仪器即可完成，能够被广泛运用于河鲀及其制品的现场检测。
[0008]
为了实现上述的目的，本技术采用了以下的技术方案：
[0009]
基于lamp技术的河鲀及其制品快速鉴定方法，该方法包括以下的步骤：
[0010]
1)河鲀鱼样品的dna提取使用海洋动物组织基因组dna提取试剂盒进行，制备好的基因 组溶液置于
‑
20℃保存；
[0011]
2)基于coi序列设计1组针对东方鲀属物种的引物；或者，基于d
‑
loop序列设计了1 组针对暗纹东方鲀的引物；
[0012]
基于coi序列的引物序列如下：
[0013][0014]
基于d
‑
loop序列的引物序列如下：
[0015][0016]
3)lamp反应采用20μl的反应体系，具体成分如下：
[0017][0018][0019]
4)开始反应前，在反应液面上加入20μl石蜡油；反应条件为：65℃反应60min，80℃ 灭活10min；
[0020]
5)lamp反应产物的检测采用两种方式之一：
[0021]
①
电泳检测；用1
×
tae缓冲液配置浓度为2％的琼脂糖凝胶，取10μl反应产物与2μl 6
×
lodding buffer混合后加入上样孔，120v电泳30min；电泳结束后，通过凝胶成像 系统观察，若存在梯度条带则反应为阳性；
[0022]
②
染料法检测：lamp反应前在pcr管管盖或管壁上滴加5μl 100
×
sybr green i染 料，待反应结束后混匀，若颜色由橙色变为绿色则反应为阳性。
[0023]
进一步，本发明还提供了一种lamp技术的河鲀及其制品快速鉴定用引物对，该引物对的 引物序列如下：
[0024][0025]
该引物对基于coi序列设计，针对东方鲀属物种。
[0026]
进一步，本发明还提供了一种lamp技术的河鲀及其制品快速鉴定用引物对，该引物对的 引物序列如下：
[0027][0028]
该引物对d
‑
loop序列设计，针对暗纹东方鲀。
[0029]
进一步，本发明还提供了一种lamp技术的河鲀及其制品快速鉴定用试剂盒，该试剂盒 包括所述的引物对。
[0030]
本发明由于采用了上述的技术方案，基于coi序列和d
‑
loop序列分别设计两组特异性 lamp引物组(引物lampcoi及lampcr)。实验结果显示：引物lampcoi可对6种东方 鲀属河鲀物种进行扩增，与非东方鲀属的2种河鲀、7种非河鲀样品均不发生反应；引物 lampcr只与暗纹东方鲀物种发生特异性反应，与其他河鲀及非河鲀样品不发生反应。两组 引物的灵敏度均为0.1％，而检测限达到10pg。将两组引物用于市售商品的物种鉴定：在30 种河鲀制品中，均检测到东方鲀属物种成分，12
‑
14号、21
‑
30号样品则被鉴定为暗纹东方鲀； 而在20种无标签鱼肉制品中，只有17
‑
20号样品检测到含有东方鲀属物种成分。另外，本发 明采用了sybr green i染料对lamp反应结果进行可视化。为避免开盖检测以及染料对反 应的影响，因此在反应前将染料滴加在管盖或管壁上，待反应结束后与反应液混合，观察颜 色变化。结果证明该方法操作简单，且可视化效果明显，非常适用于现场条件的检测。
附图说明
[0031]
图1为引物lampcoi的特异性试验结果；注：a、b为电泳图谱，c、d为染料可视化 结果。m：100bp dna ladder；n：阴性对照；1
‑
8分别为暗纹东方鲀、红鳍东方鲀、黄鳍东 方鲀、星点东方鲀、弓斑东方鲀、双斑东方鲀、纹腹叉鼻鲀、怀氏兔头鲀；9
‑
15分别为猪肉、 牛肉、羊肉、鸡肉、鸭肉、虾肉、大黄鱼肉。
[0032]
图2为引物lampcr的特异性试验结果。注：a、b为电泳图谱，c、d为染料可视化 结果。m：100bp dna ladder；n：阴性对照；1
‑
8分别为暗纹东方鲀、红鳍东方鲀、黄鳍东 方鲀、星点东方鲀、弓斑东方鲀、双斑东方鲀、纹腹叉鼻鲀、怀氏兔头鲀；9
‑
15分别为猪肉、 牛肉、
羊肉、鸡肉、鸭肉、虾肉、大黄鱼肉。
[0033]
图3为引物lampcoi与lampcr的灵敏度试验结果；注：m：100bp dna ladder； n：阴性对照；1
‑
9:dna含量分别为100％、50％、25％、10％、5％、1％、0.5％、0.1％、0.01％。
[0034]
图4为引物lampcoi与lampcr的检测限试验结果；注：m：100bp dna ladder； n：阴性对照；1
‑
7dna含量分别为100ng、10ng、1ng、100pg、10pg、1pg、0.1pg。
[0035]
图5为快速dna粗提取方法实验结果；注：m：100bp dna ladder；n：阴性对照1
×ꢀ
为未稀释，10
×
为10倍稀释，100
×
为100倍稀释，1000
×
为1000倍稀释。
[0036]
图6为市售河鲀制品的lamp检测结果；注：n：阴性对照；1
‑
30：30种市售河鲀制品。
[0037]
图7为20种无标签鱼类产品的lamp检测结果；注：n：阴性对照；1
‑
20：20种无标签 鱼肉制品样本。
具体实施方式
[0038]
一、材料与方法
[0039]
1、材料、试剂与仪器
[0040]
实验材料：8种河鲀样品(暗纹东方鲀、红鳍东方鲀、黄鳍东方鲀、星点东方鲀、弓斑东方 鲀、双斑东方鲀、纹腹叉鼻鲀、怀氏兔头鲀)及30种市售河鲀制品同2.1.1，7种非河鲀肉类(猪肉、牛肉、羊肉、鸡肉、鸭肉、虾肉、大黄鱼肉)以及20种无标识鱼类产品同3.1.1。 仪器：生物样品均质仪(bioprep
‑
24)购自杭州奥盛仪器有限公司，其他相关仪器同2.1.1。 试剂：ctab裂解液(2％ctab、0.02m na2edta、1.4m nacl、2％pvp、0.1m tris
‑
hcl ph8.2)、0.5m naoh裂解液(0.5m naoh、10mm na2edta)、3m盐酸胍裂解液(3m盐酸 胍、0.1m tris
‑
hcl、0.05m na2edta，ph 6.4)、bst dna polymerase large fragment购自 南京诺唯赞生物科技股份有限公司、sybr green i(pcr级)购自北京索莱宝科技有限公司、 dntp mixture购自日本takara公司、甜菜碱、石蜡油等。
[0041]
二、实验方法
[0042]
2.1 dna快速提取
[0043]
河鲀鱼样品的dna提取使用海洋动物组织基因组dna提取试剂盒进行。取河鲀鱼背部肌 肉0.05g，用液氮研磨至粉末状后参照试剂盒使用说明进行提取；河鲀制品的dna提取采用 ctab试剂裂解，并采用酚
‑
氯仿抽提，具体方法如下：
[0044]
1)取0.05g样品于研钵中液氮研磨至粉末状，转移至2ml离心管中；
[0045]
2)向离心管中加入1ml ctab裂解液，20μl蛋白酶k(20mg/ml)溶液，4μl rnase a (100mg/ml)溶液，混匀后置于56℃水浴，至组织完全裂解；
[0046]
3)向充分裂解的溶液中加入500μl酚/氯仿异/戊醇(25:24:1)，振荡后在4℃，12500rpm 离心10min。离心后的溶液分为三层，将上层溶液小心转移到另一无菌离心管中，加 入500μl氯仿/异戊醇(24:1)，振荡混匀，4℃，12500rpm离心10min；
[0047]
4)将上清液转移到另一无菌离心管中，加入等体积的异丙醇振荡混匀，4℃，12500rpm 离心10min，弃上清；
[0048]
5)向沉淀加入500μl 70％乙醇溶液，振荡，4℃，12500rpm离心5min，弃上清；再加 入500μl无水乙醇，振荡，4℃，12500rpm离心5min，弃上清；
[0049]
6)将离心管倒置于吸水纸上，室温干燥；
[0050]
7)干燥后，加入50
‑
100μl无菌水或te溶液溶解dna。
[0051]
制备好的基因组溶液用核酸蛋白分析仪检测，置于
‑
20℃保存。
[0052]
为进一步缩短市售河鲀制品检测所需的时间，因此采用dna快速提取方法简化样品前 处理的流程。首先对河鲀dna快速提取的裂解液进行筛选：
[0053]
称取0.05g暗纹东方鲀肌肉于2ml离心管中，分别加入500μl 0.5m naoh裂解液、3 m盐酸胍裂解液、ctab裂解液；
[0054]
向离心管中加入20颗1mm研磨珠，置于自动均质仪中以4m/s的速度震荡1min，静 置9min；
[0055]
简短离心后，吸取50μl上清液，加入ddh2o，进行10倍梯度稀释(1
×
、10
×
、100
×
、 1000
×
)；
[0056]
将所得稀释液立即进行lamp扩增(反应体系及条件同4.1.2.2)并以电泳法观察结果。
[0057]
2.2 lamp引物设计
[0058]
本发明基于coi序列设计了1组针对东方鲀属物种的引物，基于d
‑
loop序列设计了1 组针对暗纹东方鲀的引物，引物序列见表1。
[0059]
表1 lamp引物表
[0060][0061]
2.3 lamp反应体系及产物检测
[0062]
lamp反应采用20μl的反应体系，具体成分见表2。开始反应前，在反应液面上加入 20μl石蜡油。反应条件为：65℃反应60min，80℃灭活10min。lamp反应产物的检测采 用两种方式：
①
电泳检测；用1
×
tae缓冲液配置浓度为2％的琼脂糖凝胶，取10μl反应产 物与2μl 6
×
lodding buffer混合后加入上样孔，120v电泳30min。电泳结束后，通过凝胶 成像系统观察，若存在梯度条带则反应为阳性；
②
染料法检测：lamp反应前在pcr管管盖 或管壁上滴加5μl 100
×
sybr green i染料，待反应结束后混匀，若颜色由橙色变为绿色则 反应为阳性。
[0063]
表2 lamp反应体系
[0064][0065][0066]
2.4 lamp反应的特异性
[0067]
为验证上述引物是否能特异性检测目标物种而不会对其他dna产生假阳性扩增，以8 种河鲀样品(暗纹东方鲀、红鳍东方鲀、黄鳍东方鲀、星点东方鲀、弓斑东方鲀、双斑东方 鲀、纹腹叉鼻鲀、怀氏兔头鲀)和7种非河鲀肉类(猪肉、牛肉、羊肉、鸡肉、鸭肉、虾肉、 大黄鱼肉)样品的dna进行lamp特异性试验。以2.3所述反应体系及条件，分别用这两 组引物对15个物种的dna进行lamp反应，结果通过荧光法和电泳法分别进行验证。
[0068]
2.5 lamp反应的灵敏度及检测限
[0069]
lamp反应灵敏度的测试，以暗纹东方鲀及大黄鱼的混合dna溶液为检测对象进行。 将浓度为50ng/μl的暗纹东方鲀dna与大黄鱼dna以100％、50％、25、10％、5％、1％、 0.5％、0.1％、0.01％的比例进行混合，分别与两组lamp引物进行反应，扩增结果以电泳法 进行验证。
[0070]
lamp反应检测限的测试，以暗纹东方鲀dna为检测对象进行。将标准dna溶液以10 倍梯度进行稀释后，分别用两组引物进行lamp反应，使得lamp反应体系中dna含量分 别为100ng、10ng、1ng、100pg、10pg、1pg、0.1pg。由于sybr green i染料法在极低 浓度dna模板的lamp反应中变色不明显，容易造成误判，因此检测限实验的结果通过电 泳法进行验证。
[0071]
2.6.市售河鲀制品及无标签鱼肉产品的lamp检测
[0072]
为简化dna提取的流程，使其更适用于现场检测。以2.1中筛选得到的dna快速提取 方法对30种市售河鲀制品及20种无标签鱼肉制品的dna进行粗提取，采用上述lamp反 应条件及引物进行lamp反应，结果以染料可视化方法进行检验，根据反应结果判断是否含 有河鲀成分或存在标签不符的现象。
[0073]
三、结果与分析
[0074]
3.1 lamp的特异性试验结果
[0075]
实验以8种河鲀物种及7种非河鲀肉类提取的dna为模板，对lampcoi、lampcr 两套lamp引物的特异性进行了验证，结果如图1、2。电泳及染料可视化结果显示，引物 lampcoi与6种东方鲀属物种的反应产物在凝胶电泳中呈现出梯度状条带，染料可视化结 果的颜色由橙黄色变为黄绿色，而与纹腹叉鼻鲀、怀氏兔头鲀则不发生反应，结果呈阴性； 在7种非河鲀的肉类的反应中，所有样品均未出现阳性反应。引物lampcr则只在暗纹东方 鲀的dna中出现阳性结果，在其他7种河鲀及7种非河鲀肉类中均未出现阳性结果。说明 引物
lampcoi对东方鲀属物种具有良好的特异性，而对东方鲀属以外的河鲀或其他物种则 不会进行扩增；引物lampcoi则可以对暗纹东方鲀物种进行特异性扩增。
[0076]
3.2 lamp的灵敏度试验结果
[0077]
为验证该方法的检测灵敏度，以暗纹东方鲀与大黄鱼不同比例的混合dna为模拟样品 进行lamp反应，实验结果如图3。两组引物的反应结果相似，在暗纹东方鲀dna含量为 100％
‑
0.5％的反应中，均出现了明显的梯度状条带。在dna含量为0.1％时，条带亮度减弱， 但仍然可以观测到反应呈阳性。而当dna含量为0.01％时，几乎观测不到电泳条带。因此， 认为该方法的灵敏度为0.1％。
[0078]
3.3 lamp的检测限试验结果
[0079]
为确定两组lamp引物的检测限，以暗纹东方鲀dna为检测对象，将标准dna溶液以 10倍梯度进行稀释后，分别用两组引物进行lamp反应，每个反应体系中dna含量分别为 100ng、10ng、1ng、100pg、10pg、1pg、0.1pg。通过电泳法对反应结果进行检测，结果 如图4所示。两组引物都呈现了相似的反应结果，在dna含量在100ng
‑
10pg时，均可观 察到梯度状条带。而当dna含量低于10pg时，则未出现明显的扩增。因此该方法对东方鲀 属物种和暗纹东方鲀物种的检测限为10pg。
[0080]
3.4快速dna粗提取方法筛选结果
[0081]
为简化dna提取流程，缩短对市售商品的检测时间，对dna快速粗提取的裂解液以及 粗提液的稀释倍数进行了探索，结果如图5。对比三种裂解液的粗提液及10倍稀释液，均能 观察到lamp阳性反应。其中0.5m的naoh组与3m盐酸胍组的条带较亮，而ctab组的 条带较暗。当稀释倍数上升至100倍、1000倍时，ctab组几乎观察不到电泳条带，而naoh 组与盐酸胍组的还能观察到电泳条带存在，但盐酸胍组的亮度下降明显。因此，选择0.5m 的naoh溶液作为裂解液，用于市售商品的快速dna粗提取。
[0082]
3.5市售河鲀制品的lamp检测结果
[0083]
采用引物lampcoi、lampcr分别对30种市售河鲀制品进行了检测(见表3)，染料可 视化结果如图6。在引物lampcoi的检测结果中，所有的样品均出现颜色变化，反应呈阳 性，表明所有河鲀制品中都含有东方鲀属河鲀成分。而引物lampcr的检测结果中，仅12
‑
14 号、21
‑
30号的样品出现阳性反应，说明其中含有暗纹东方鲀成分；而1
‑
11号、17
‑
20号的样 品中虽然未检出含有暗纹东方鲀成分，但结合引物lampcoi的反应结果来看，其中含有暗 纹东方鲀以外的其他东方鲀属河鲀成分。以上结果与dna条形码方法及hrm分析的结论相 似，且均与其商品标签相符。因此，结合dna快速提取的lamp方法可用于河鲀制品中河 鲀成分的检测。
[0084]
3.6标签鱼肉制品的lamp检测结果
[0085]
采用引物lampcoi、lampcr分别对20种市售无标签鱼肉制品进行了检测(见表4)， 染料可视化结果如图7。其中，引物lampcr在所有样品都不发生颜色变化，结果呈阴性， 因此这20种鱼肉制品中都不含有暗纹东方鲀成分。而17
‑
20号样品在与引物lampcoi的反 应中出现阳性结果，说明其中含有东方鲀属物种成分，但具体含有的物种还无法判断。经dna 条形码与hrm分析验证(中国发明专利申请(cn108950007a，公开号：20181207)，17
‑
20 号样品实际为黄鳍东方鲀。
[0086]
表3 30种市售河鲀制品的lamp反应结果
[0087][0088]
注：“+”表示结果为阳性，
“‑”
表示结果为阴性。
[0089]
表4 20种无标签鱼肉制品的lamp检测结果
[0090][0091]
注：“+”表示结果为阳性，
“‑”
表示结果为阴性。
[0092]
四、讨论
[0093]
本技术不同于dna条形码及hrm分析，lamp反应的条件简单、速度快、灵敏度高， 无需借助复杂的大型仪器即可完成，因此被广泛运用于多种肉源食品的现场检测。本技术设 计并验证了两套可分别检测东方鲀属物种、暗纹东方鲀物种的lamp引物(lampcoi、 lampcr)，特异性强，灵敏度为0.1％，检测限为10pg。此外，为进一步缩短商业样品检测 时间，利用lamp反应对抑制剂耐受能力较强的特点，将其与dna快速提取方法使用，成 功在1.5h内检测出河鲀制品中的河鲀成分。运用该方法对30种市售河鲀制品以及20种无标 签鱼肉制品进行检测，所有河鲀制品均检测到东方鲀属物种成分，12
‑
14号、21
‑
30号样品被 确定含有暗纹东方鲀物种成分；在无标签鱼肉制品中，17
‑
20号样品被检测出含有东方鲀属物 种。
[0094]
lamp反应结果的判断方法对检测时间与检测效率也有很大影响。目前lamp反应结果 的判断方法包括：电泳法、染料法、浊度法、横向流动试纸及微流控芯片等。电泳法虽然结 果可靠，但不适用实验室外环境的检测，且需要进行开盖检测，容易造成气溶胶污染。浊度 法虽然简单，但凭肉眼很难比对浊度的细微差别，往往还需要借助浊度仪进行判断。本发明 采用了sybr green i染料对lamp反应结果进行可视化。为避免开盖检测以及染料对反应 的影响，因此在反应前将染料滴加在管盖或管壁上，待反应结束后与反应液混合，观察颜色 变化。结果证明该方法操作简单，且可视化效果明显，非常适用于现场条件的检测。