一株唾液乳杆菌LSChen及其应用

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一株唾液乳杆菌(lactobacillussalivarius)lschen及其应用。

背景技术：

铜绿假单胞菌(pseudomonasaeruginosa，pa)是一种革兰氏阴性、无芽孢杆菌，也被称为绿脓杆菌。该菌广泛分布于空气、水、土壤、动物和人的皮肤、肠道等，是一种常见的条件致病菌。研究表明，pa产生的毒素有内毒素、色素以及外毒素a等，其中绿脓菌素(pyocyanine，pyo)是pa非常重要的毒力因子之一。

由于铜绿假单胞菌的感染会造成伤口、肺部等感染，目前采用的抗生素治疗造成菌株耐药性的发生，并且铜绿假单胞菌一旦形成生物膜，具有很强的抗药性，抗生素的治疗效果不显著，并且还会造成反复感染。目前仍缺乏一种有效防治铜绿假单胞菌所致污染或疾病的食品或者食品添加剂或药物。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一株唾液乳杆菌(lactobacillussalivarius)lschen及其应用。本发明所述唾液乳杆菌lschen群体感应信号分子ai-2表达量高，能够有效拮抗铜绿假单胞菌，抑制铜绿假单胞菌绿脓菌素的表达，且还能高效降解亚硝酸盐，实现泡菜的高效制备。

本发明提供了一株唾液乳杆菌lschen，所述唾液乳杆菌lschen的保藏编号为cctcc：m2020159。

本发明还提供了上述技术方案所述唾液乳杆菌lschen在制备拮抗铜绿假单胞菌的食品或食品添加剂或药物中的应用。

本发明还提供了上述技术方案所述唾液乳杆菌lschen在制备抑制铜绿假单菌形成生物膜的食品或食品添加剂或药物中的应用。

本发明还提供了上述技术方案所述唾液乳杆菌lschen在制备防治铜绿假单胞菌所致污染或疾病的药物中的应用。

本发明还提供了上述技术方案所述唾液乳杆菌lschen在制备抑制铜绿假单胞菌绿脓菌素表达的食品或食品添加剂或药物中的应用。

本发明还提供了上述技术方案所述的唾液乳杆菌lschen在降解亚硝酸盐中的应用。

本发明还提供了上述技术方案所述的唾液乳杆菌lschen在制备泡菜中的应用。

本发明还提供了上述技术方案所述的唾液乳杆菌lschen在高表达群体感应信号分子ai-2中的应用。

本发明还提供了上述技术方案所述唾液乳杆菌lschen的培养方法，包括以下步骤：将唾液乳杆菌lschen接种于mrs培养基，在37℃培养。

优选的是，所述培养包括静止培养；所述培养的时间为18～24h。

本发明提供了一株唾液乳杆菌lschen。本发明所述唾液乳杆菌lschen群体感应信号分子ai-2表达量高，能够有效拮抗铜绿假单胞菌，抑制铜绿假单胞菌绿脓菌素的表达，抑制铜绿假单菌生长，抑制其形成生物膜，降低感染率，起到预防或协助治疗由铜绿假单胞菌引起感染的作用，且还能高效降解亚硝酸盐，实现泡菜的高效制备。

生物保藏说明

唾液乳杆菌(lactobacillussalivarius)lschen，于2020年5月29日保藏于中国典型培养物保藏中心，单位简称为cctcc，地址为中国武汉，武汉大学，保藏编号为cctccno：m2020159。

附图说明

图1为本发明提供的唾液乳杆菌lschen的显微观察图；

图2为本发明提供的唾液乳杆菌lschen的生长曲线；

图3为本发明提供的发酵过程中亚硝酸盐含量变化结果；

图4为本发明提供的发酵过程中总酸变化结果图；

图5为本发明提供的发酵过程中ph变化结果图；

图6为本发明提供的发酵完成时感官得分图；

图7为本发明提供的乳酸菌抑制铜绿假单胞菌生长情况；

图8本发明提供的乳酸菌抑制铜绿假单胞菌绿脓菌素的表达情况；

图9为本发明提供的乳酸菌抑制铜绿假单胞菌生物膜形成的情况；

图10为本发明提供的乳酸菌上清液信号分子ai-2表达情况；

图11为本发明提供的唾液乳杆菌lschen系统发育树。

具体实施方式

本发明提供了一株唾液乳杆菌(lactobacillussalivarius)lschen，所述唾液乳杆菌lschen的保藏编号为cctcc：m2020159。本发明所述菌株筛选自湖南省怀化市麻阳县的农家泡菜。唾液乳杆菌lschen为革兰氏阳性菌，氧化氢酶试验为阴性，呈短杆状，大小为0.569～0.601μm×0.564～0.589μm，不产生色素。lschen具有降解亚硝酸盐能力，降解率为97.14±0.01％，可用于制备泡菜，显微观察图如图1所示。本发明所述的16srrna的核苷酸序列如seqidno.1所示，系统发育树如图11所示。且本发明所述唾液乳杆菌lschen群体感应信号分子ai-2表达量高，能够有效拮抗铜绿假单胞菌，抑制铜绿假单胞菌绿脓菌素的表达，抑制铜绿假单菌生长，抑制其形成生物膜，降低感染率，起到预防或协助治疗由铜绿假单胞菌引起感染的作用。

本发明还提供了上述技术方案所述唾液乳杆菌lschen在制备拮抗铜绿假单胞菌的食品或食品添加剂或药物中的应用。本发明所述唾液乳杆菌lschen抑制铜绿假单胞菌的效果比较明显，抑菌圈直径达到20mm左右。

本发明还提供了上述技术方案所述唾液乳杆菌lschen在制备抑制铜绿假单菌形成生物膜的食品或食品添加剂或药物中的应用。本发明所述唾液乳杆菌lschen能够显著抑制铜绿假单胞菌的生物膜形成。

本发明还提供了上述技术方案所述唾液乳杆菌lschen在制备防治铜绿假单胞菌所致污染或疾病的药物中的应用。

本发明还提供了上述技术方案所述唾液乳杆菌lschen在制备抑制铜绿假单胞菌绿脓菌素表达的食品或食品添加剂或药物中的应用。本发明所述唾液乳杆菌lschen能够显著抑制铜绿假单胞菌绿脓菌素的表达。

本发明还提供了上述技术方案所述的唾液乳杆菌lschen在降解亚硝酸盐中的应用。本发明所述唾液乳杆菌lschen的亚硝酸盐降解率高，与实施例筛选过程中的其它菌株之间存在显著性差异，且本发明所述唾液乳杆菌lschen既能通过酸作用降解亚硝酸盐，也能利用酶作用降解亚硝酸盐，降解能力较强，可以在低酸食品(7＞ph＞4.5)中应用，也可以在高酸性食品(ph＜4.5)中应用。

本发明还提供了上述技术方案所述的唾液乳杆菌lschen在制备泡菜中的应用。本发明所述唾液乳杆菌lschen接种发酵可以显著降低亚硝峰与泡菜成品中亚硝酸盐含量，缩短发酵时间；接种发酵的总酸含量明显大于自然发酵的总酸含量；接种lschen菌株后可以快速降低泡菜的ph，抑制其他杂菌的生长，降低亚硝酸盐的产生，促进泡菜成熟；乳酸菌接种发酵的泡菜色泽、质地均优于自然发酵的泡菜，滋味和香气相差不大。

本发明还提供了上述技术方案所述的唾液乳杆菌lschen在高表达群体感应信号分子ai-2中的应用。本发明唾液乳杆菌lschen产生信号分子ai-2的能力较强。

本发明还提供了上述技术方案所述唾液乳杆菌lschen的培养方法，包括以下步骤：将唾液乳杆菌lschen接种于mrs培养基，在37℃培养。在本发明中，所述培养优选包括静止培养。在本发明中，所述培养的时间优选为18～24h，更优选为18h。

下面结合具体实施例对本发明所述的一株唾液乳杆菌(lactobacillussalivarius)lschen及其应用做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。

实施例1

生长曲线及ph的测定:

将乳酸菌活化三代后，以1％的接种量接种至mrs培养液中，在37℃恒温培养箱中培养24h，每隔2h测定od600的吸光值以及测定相应的ph。将不含菌株的mrs培养液作为空白对照，每个试样设置3个平行。

图2为唾液乳杆菌lschen的生长曲线。lschen在前4个小时，生长处于延滞期，这一时期细胞数量几乎未增长；4～16h，生长速度增快，处于对数生长期，生长代谢都很旺盛；16h后乳酸菌生长进入稳定期。培养液的初始ph为6.0，在0～4hph值下降缓慢，4～16h迅速下降，16h之后培养液的ph值逐渐趋于稳定，并保持在3.7左右。lschen培养液的ph值下降趋势与乳酸菌生长的上升趋势基本保持一致。

实施例2

1lschen降解亚硝酸能力的研究

(1)降解亚硝酸盐的菌株的初筛

表1培养液ph与亚硝酸盐含量变化

注：同一列不同字母上标表示差异显著性(p<0.05)

对从泡菜样品中分离出的15株乳酸菌进行筛选，结果如表1所示。其中lschen、s-5-4、s-5-3、s-5-5和s-5-15株菌具有较强的亚硝酸盐的清除能力，在含500mg·l^-1的亚硝酸盐培养基中培养24h后，亚硝酸盐降解率分别为97.14％、92.0％、91.03％、9.019％、89.49％。lschen菌株亚硝酸盐降解率最大，经duncan’s多重检验分析，lschen菌株的亚硝酸盐降解率与其它菌株在显著水平α＝0.05上存在显著性差异。本实施例这5株菌在培养24h后，培养液的ph值均小于4.0，其余10株菌的ph菌在4.0～4.2的范围内。结果表明，本发明所述乳酸菌对亚硝酸盐的降解以酸降解为主。

(2)降解亚硝酸盐乳酸菌的复筛

为了找到适用于非高酸性食品的乳酸菌，利用乳酸菌代谢产生的其它物质降解亚硝酸盐。本实施例通过向亚硝酸盐培养基中添加caco3的方式(在亚硝酸盐筛选培养液中加入2％的碳酸钙吸收有机酸，使培养液ph值控制在5.1～5.5，消除酸的影响)，利用caco3中和乳酸菌产生的酸，提高培养液ph的原理，对表1中降解率较高的5株菌进行复筛，实验结果如表2所示。

表2培养液ph与亚硝酸盐含量变化

注：同一列不同字母上标表示差异显著性(p<0.05)

如表2所示，lschen菌株亚硝酸盐降解率最大，可达94.59％，经duncan’s多重检验分析，lschen这株菌与其它菌株之间存在显著性差异。由于lschen菌株在初筛与复筛中亚硝酸盐降解率均最高，因此确定lschen菌株为本次实验的目标菌株。本次实验中乳酸菌在培养24h后，培养液的ph值均在5.38～5.52的范围内。本次实验中乳酸菌降解亚硝酸盐以酶降解为主。

结果说明筛选到的lschen既能通过酸作用降解亚硝酸盐，也能利用酶作用降解亚硝酸盐，具有较强的亚硝酸盐降解能力，因此，lschen既可以在低酸食品(7＞ph＞4.5)中应用，也可以在高酸性食品(ph＜4.5)中应用。

实施例3

泡菜中的应用

萝卜泡菜配方：萝卜600g，自然发酵发酵液900g(含4％食盐，2％白砂糖)/接种发酵发酵液900g(含4％食盐，2％白砂糖，1％唾液乳杆菌lschen菌液)

制作流程：原料→清洗→晾干→切分→装坛→发酵液浸泡→发酵。

原料：选择新鲜白萝卜，无异味，无缺损。

切分：白萝卜切成约1cm×1cm×5cm条状备用。

唾液乳杆菌lschen菌悬液制备：活化至第三代的乳酸菌培养液，5000r·min^-1离心15min，弃上清液，用10ml无菌生理盐水重悬后，再次离心，重复操作3次。

装坛：将萝卜条装入无菌发酵罐中。

发酵：30℃密封避光发酵。

测定：每隔24h分别测定自然发酵与乳酸菌接种发酵泡菜中的亚硝酸盐含量，ph值及总酸度。直到发酵完成。发酵完成标志：发酵液ph值降至3.5～3.8并保持相对稳定，总酸度保持相对稳定。

(1)发酵过程中亚硝酸盐含量变化

图3为发酵过程中亚硝酸盐含量变化结果。如图3所示，在30℃下，发酵白萝卜亚硝酸盐含量呈先上升后下降的趋势。在白萝卜发酵初始阶段，也存在亚硝酸盐含量，含量为0.096mg·kg^-1，这可能与白萝卜生长过程中积累的亚硝酸盐含量有关。自然发酵白萝卜在发酵第2d出现亚硝峰，峰值为73.5mg·kg^-1。发酵第7d，亚硝酸盐含量降至最低值，为3.81mg·kg^-1，小于国标中可使用泡菜中亚硝酸盐最大值。接种lschen后发酵第一天亚硝酸盐含量最高为0.57mg·kg^-1，发酵第三天就趋于平缓大约在0.14mg·kg^-1左右，整个七天无亚硝酸峰，接种发酵的泡菜亚硝酸盐含量最大值为0.57mg·kg^-1、最小值为0.137mg·kg^-1，几乎不出现亚硝峰。通过本实验可知，乳酸菌接种发酵可以显著降低亚硝峰与成品中亚硝酸盐含量，避免亚硝峰的出现，可以安全食用。

(2)发酵过程中总酸与ph变化

图4为发酵过程中总酸变化结果图，如图4所示，发酵白萝卜的初始总酸含量为0.16g·100g^-1。接种发酵的萝卜在0～3d内总酸呈快速上升趋势，第3d总酸能达到8.1g·100g^-1以上，此后总酸含量逐渐趋于稳定。接种发酵萝卜发酵结束时，总酸含量为8.2g·100g^-1。自然发酵萝卜结束发酵时总酸为3.9g·100g^-1。接种发酵的总酸含量明显大于自然发酵的总酸含量。

图5为发酵过程中ph变化结果图，如图5所示，发酵白萝卜的初始ph均为5.21，接种发酵与自然发酵的ph最终都稳定在3.5左右。在0～7d随着发酵时间的延长，无论是自然发酵还是接种发酵ph都呈下降趋势。在0～2d，接种发酵ph急剧下降，2d后趋于稳定。接种发酵的白萝卜泡菜2d即可制成，自然发酵的白萝卜泡菜需发酵5d才可完成。接种lschen菌株发酵的白萝卜泡菜，可以快速降低泡菜的ph，抑制其他杂菌的生长，降低亚硝酸盐的产生，促进泡菜成熟。

(3)泡菜感官评价

图6为发酵完成时感官得分图，如图6所示，乳酸菌接种发酵的泡菜色泽、质地均优于自然发酵的泡菜。自然发酵的泡菜发酵液的色泽在发酵过程中由无色透明逐渐变为浅黄色，再变为深黄色。接种发酵的泡菜发酵液色泽由无色透明逐渐变为乳白色，但仍然较为澄清。接种发酵的泡菜脆性优于自然发酵的泡菜，香气与滋味相差不大。

实施例4

1lschen抑制铜绿假单胞菌的生长

在灭菌的平板中加入适量2％琼脂培养基，放入牛津杯。加入含有浓度约为10⁶cfu·ml^-1铜绿假单胞菌的lb培养基10ml，取200μl乳酸菌上清液(乳酸菌37℃培养后18h，6000r/min10min离心，0.22μl过滤获得无菌乳酸菌上清液)加入到牛津杯孔中，37℃培养后18h，测定抑菌圈直径。判定标准：抑菌圈直径4mm判定为不敏感；抑菌圈直径5～10mm判定为低度敏感；抑菌圈直径11～15mm判定为中度敏感；抑菌圈直径大于15mm判定为高度敏感。

图7为乳酸菌抑制铜绿假单胞菌生长情况，以mrsph4.0上清液为对照，由图7和表3可知，lschen抑菌圈直径达到20mm左右，抑制铜绿假单胞菌的效果比较明显。

表3乳酸菌上清液对pa的抑菌效果

2lschen抑制铜绿假单胞菌的绿脓菌素的表达

将铜绿假单胞菌加入到定量lb培养基中使铜绿假单胞菌的浓度约为10⁶cfu·ml^-1，再加入1：1的乳酸菌上清液，混匀，培养18h后，6000r/min，离心10min后获得上清液，分装至2ml冻干瓶中，冻干24h。冻干后加入3ml氯仿和1ml0.2mol/lhcl进行萃取，静置分层取hcl层测od520值，以铜绿假单胞菌的绿脓菌素表达量为对照。

图8为乳酸菌抑制铜绿假单胞菌的绿脓菌素的表达情况，从图8可以看出lschen和l23(植物乳杆菌)都能够比较显著抑制铜绿假单胞菌绿脓菌素的表达，zx5无抑制效果，而n34和l1促进了绿脓菌素的表达。

3lschen拮抗铜绿假单胞菌生物膜形成

将活化到三代的铜绿假单胞菌稀释100倍，以90％接种量接种到无菌96孔细胞培养板中，将乳酸菌无菌上清液按10％接种量到每个孔中。置于37℃恒温培养箱培养至24h，去除发酵液，每孔用生理盐水轻轻冲洗，重复清洗多次。晾干酶标板后，再用浓度为1％的结晶紫染液对96孔板进行染色，15min后，倒出染液，再用生理盐水重复冲洗96孔板数次直至孔板透明，停止冲洗。待酶标板再次晾干后，每孔再加入200μl脱色剂，使用酶标仪测定其od600值。以od600值表示生物膜的生成量，以mrs抑制铜绿假单胞菌产生的生物膜为对照。

图9为乳酸菌抑制铜绿假单胞菌的生物膜的形成情况，从图9可以看出，五株乳酸菌都能很显著的抑制铜绿假单胞菌的生物膜形成，去除mrs培养基的影响，抑制率高达60％左右，但没有显著差异性。

实施例5

将bb170按2％接种于海生培养基，30℃培养12h，至菌体od600为0.8～1.2，然后用新鲜的ab培养基以1：100稀释bb170培养液，充分震荡混匀后备用。将乳酸菌上清液、bb152无菌上清液、dh5α无菌上清液和bb170培养液分别作为待测样品、阳性对照、阴性对照和介质对照，各做4个平行。按体积比1：100与上述稀释过的bb170培养液混合培养3.5h，用多功能酶标仪测定化学发光值。信号分子ai-2的强度用相对荧光强度表示计算公式如下：

阴性对照组荧光强度＝阴性对照荧光强度/阳性对照荧光强度

待测组相对荧光强度＝待测样品荧光强度/介质对照荧光强度

图10为乳酸菌上清液ai-2的表达量，从图10可知，lschen和zx5产生信号分子ai-2的能力较强，而n34的表达ai-2能力较弱，l23无表达。ai-2作为乳酸菌种间交流信号分子，受乳酸菌qs系统的调控，影响乳酸菌的多项重要生理功能。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110>衡阳师范学院

<120>一株唾液乳杆菌lschen及其应用

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1500

<212>dna

<213>唾液乳杆菌lschen(lactobacillussalivariuslschen)

<400>1

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