一种深海古菌单链DNA结合蛋白SSB及其制备方法和应用

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种深海古菌单链dna结合蛋白ssb及其制备方法和应用。

背景技术：

dna修饰酶在核酸检测与分子诊断中有着重要应用。目前聚合酶链式反应(polymerasechainreaction,以下简称为pcr)技术广泛应用于各种核酸扩增与检测领域，极大地促进了核酸诊断技术、现代基因工程、重组蛋白质工程的发展。pcr过程会出现引物二聚体，从而降低了pcr的扩增产量和产物特异性，还会造成荧光法检测核酸的假阳性信号。改善pcr性能的技术主要包括优化pcr反应体系组分，例如通过加入二甲基亚砜(dmso)、优化镁离子浓度等。目前这些技术并不能有效解决引物二聚体的问题。

作为pcr技术的核心试剂，dna聚合酶活性的调控与改良是pcr的核心。热启动dna聚合酶常常用来消除引物二聚体的产生。热启动dna聚合酶在低温下没有活性，只有95度热激活后才能释放出dna聚合酶活性，从而消除dna聚合酶在常温下延伸引物二聚体的缺点。然而某些引物二聚体在pcr退火温度下仍能够保持稳定的双链结构，导致dna聚合酶无法完全消除引物二聚体非特异性扩增的缺陷。

消除引物二聚体的另一种策略是将引物单链dna保护起来，使其不能够彼此形成引物二聚体，从而也就不能够被dna聚合酶延伸成长的引物二聚体。目前采用的策略通常是加入单链dna结合蛋白。然而普通单链dna结合蛋白结合单链dna的活性较低，需要利用大量的单链dna结合蛋白。

cn103820415b公开了一种热启动dna聚合酶的制备方法，包括如下步骤：获得单链dna结合蛋白、taqdna聚合酶单克隆抗体以及taqdna聚合酶；将所述单链dna结合蛋白、所述taqdna聚合酶单克隆抗体以及所述taqdna聚合酶组分按照比例混合；所述单链dna结合蛋白、所述taqdna聚合酶单克隆抗体以及所述taqdna聚合酶的含量分别都为20～40％，本发明还涉及由以上方法制备的热启动dna聚合酶及其使用方法。本发明制备的热启动dna聚合酶还可以解决热启动pcr技术中容易出现的dna损伤、产物污染、封闭不完全导致热启动效果不好的问题。但是，本专利需要以单链dna结合蛋白为原料，无法解决新型单链dna结合蛋白的制备问题。

cn106701738b公开了一种等温解开双链dna的方法以及基于该方法制备单链dna的方法。等温解开双链dna的技术方案为利用重组酶结合单链dna探针形成复合物，复合物识别双链dna中与单链dna探针同源的序列并侵入双链dna，从而实现双链dna的等温开链，随后单链dna探针和双链中一条链互补配对，而单链结合蛋白结合另一条链稳定开链结构。基于该方案及单链dna探针3’-末端可以被连接酶和聚合酶等酶识别的特性，本发明还提出了制备单链dna的方案，并详细介绍了通过连接酶或延伸酶制备单链dna的方案。以上技术方案均可在等温条件下完成，且无需atp循环系统，甚至atp可被datp替代，所用酶来源广泛、易于获得，为等温技术以双链dna作为研究对象提供了一个通用平台。但是该方法条件较为苛刻，制备方法难度较大。

技术实现要素：

本发明的目的在于提出一种深海古菌单链dna结合蛋白ssb及其制备方法和应用，本发明制得的深海古菌单链dna结合蛋白ssb具有单链dna结合力高、热稳定性较高等特点，用于pcr和等温核酸扩增反应，能显著降低多种商品化dna聚合酶的pcr扩增目的基因时引物二聚体的产生，提高扩增产量。

本发明的技术方案是这样实现的：

本发明提供一种深海古菌单链dna结合蛋白ssb的制备方法，包括以下步骤：

s1.构建深海古菌单链dna结合蛋白ssb的重组表达质粒；

s2.重组表达深海古菌单链dna结合蛋白ssb；

s3.亲和纯化深海古菌单链dna结合蛋白ssb；

s4.凝胶电泳实验检测深海古菌单链dna结合蛋白ssb的单链dna结合活性。

作为本发明的进一步改进，具体包括以下步骤：

s1.构建深海古菌单链dna结合蛋白ssb的重组表达质粒：

基于深海热液微生物样本的宏基因组信息和深海古菌单链dna结合蛋白ssb基因序列，进行蛋白活性位点改造，并优化改造后的深海古菌单链dna结合蛋白ssb的稀有密码子，采用全基因合成技术合成深海古菌单链dna结合蛋白ssb基因，并将该基因克隆到原核表达载体中，构建深海古菌单链dna结合蛋白ssb重组表达质粒；

s2.重组表达深海古菌单链dna结合蛋白ssb：

将构建的深海古菌单链dna结合蛋白ssb重组表达质粒转化到宿主中，得到深海古菌单链dna结合蛋白ssb重组表达菌株；再利用诱导剂启动深海古菌单链dna结合蛋白ssb的诱导表达；

s3.亲和纯化深海古菌单链dna结合蛋白ssb：

将表达了深海古菌单链dna结合蛋白ssb的菌体，重悬于非变性蛋白裂解液，超声波破碎菌体，离心收集深海古菌单链dna结合蛋白ssb的大肠杆菌裂解上清液；再利用固定化镍离子亲和色谱获得电泳纯的深海古菌单链dna结合蛋白ssb；

s4.凝胶电泳实验检测深海古菌单链dna结合蛋白ssb的单链dna结合活性：

将不同浓度的深海古菌单链dna结合蛋白ssb与荧光标记的单链dna，保温处理，利用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，检测其结合单链dna的能力。

作为本发明的进一步改进，步骤s1中所述原核表达载体为pet28或其它原核表达载体。

作为本发明的进一步改进，步骤s2中所述宿主为大肠杆菌表达宿主bl21(de3)、bl21(de3)plyss中的至少一种。

作为本发明的进一步改进，步骤s2中所述诱导剂为iptg。

作为本发明的进一步改进，所述的利用诱导剂iptg启动深海古菌单链dna结合蛋白ssb的诱导表达的具体条件为：先将深海古菌单链dna结合蛋白ssb重组表达菌株培养至od600＝0.6-1.0，再加入0.02-1mmol/l诱导剂iptg培养，进行诱导表达。

作为本发明的进一步改进，所述培养条件为25-37℃温度下培养3-6h或12-25℃温度下培养12-24h。

作为本发明的进一步改进，步骤s4中所述保温处理条件为25-37℃保温5-30min。

本发明进一步保护一种上述的制备方法制得的深海古菌单链dna结合蛋白ssb，所述深海古菌单链dna结合蛋白ssb蛋白序列如seqidno.1所示。

本发明进一步保护上述深海古菌单链dna结合蛋白ssb的应用，所述应用包括pcr制备dna聚合酶和lamp等温核酸扩增反应。

作为本发明的进一步改进，所述dna聚合酶包括taqdna聚合酶、koddna聚合酶、bstdna聚合酶。

为了提高单链dna结合蛋白对单链dna的结合能力，本发明从深海微生物宏基因组中筛选到了一种新型的单链dna结合蛋白——深海古菌单链dna结合蛋白ssb。利用重组蛋白诱导表达技术，制备本发明中的深海古菌单链dna结合蛋白ssb。本发明的ssb蛋白结合单链dna的活性非常高，而且具有一定热稳定性，能够显著降低pcr中引物二聚体的产生。

本发明具有如下有益效果：本发明深海古菌单链dna结合蛋白ssb可用于改善pcr扩增效果，可以大大提高pcr扩增产量，特别适用于长片段dna的pcr扩增反应，具体如下：

(1)通用性好，由于采用深海古菌单链dna结合蛋白ssb结合引物单链的方式抑制引物二聚体的形成，该方法即适用于pcr反应，也适用于抑制lamp，rpa等核酸等温扩增技术中引物二聚体的产生。

(2)操作条件简单。将深海古菌单链dna结合蛋白ssb与引物预先混合在一起，即可快速结合引物，防止引物间形成引物二聚体。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是深海古菌单链dna结合蛋白ssb结合单链dna的表达纯化结果；

图2是深海古菌单链dna结合蛋白ssb结合单链dna的活性测定图；

图3是深海古菌单链dna结合蛋白ssb对taq酶pcr引物二聚体产量的抑制效果图。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

深海古菌单链dna结合蛋白ssb的制备方法包括下列步骤：

1)构建深海古菌单链dna结合蛋白ssb的重组表达质粒：

基于深海微生物宏基因组序列的深海古菌单链dna结合蛋白ssb的氨基酸序列，改造活性位点氨基酸，设计合成改造后的深海古菌单链dna结合蛋白ssb基因，并插入pet28表达载体，并使深海古菌单链dna结合蛋白ssb的n端带有来源于pet28载体的6个连续组氨酸亲和纯化标签，用于固定化镍离子亲和层析纯化。

2)重组表达深海古菌单链dna结合蛋白ssb：

将深海古菌单链dna结合蛋白ssb重组表达质粒转化至大肠杆菌表达宿主bl21(de3)，得到深海古菌单链dna结合蛋白ssb的重组表达菌株。将表达菌株培养至od600＝0.6，加入0.5mm诱导剂iptg，在37℃温度下培养3小时，诱导深海古菌单链dna结合蛋白ssb表达；

深海古菌单链dna结合蛋白ssb的氨基酸序列(氮端→碳端)如seqidno:1所示。

3)深海古菌单链dna结合蛋白ssb亲和纯化。

将步骤2)诱导后的大肠杆菌离心收集后，菌体重新悬浮于蛋白裂解液(20mmtris-hcl,ph7.9,300mmnacl,0.5mmdtt，10％甘油)，超声波破碎菌体，离心收集含有深海古菌单链dna结合蛋白ssb的菌体裂解上清液，利用固定化镍离子亲和纯化树脂纯化深海古菌单链dna结合蛋白ssb，结果见图1。图1结果表明，经诱导表达与固定化镍离子亲和层析纯化，得到的深海古菌单链dna结合蛋白ssb的纯度达到电泳纯(大于85％)，可以用于pcr应用。

4)检测深海古菌单链dna结合蛋白ssb的单链dna结合活性。

在20ul反应体系(20mmtris-hcl，ph8.3，50mmnacl，2mmmgcl2，1mmdtt)中加入1pmole荧光标记的35nt寡核苷酸单链(5’fam-cagccaggtgtctcactaagccgactcgccacagt)底物，与不同浓度的深海古菌单链dna结合蛋白ssb(1，2，4，6，8pmole)在37℃保温10分钟，然后将反应物进行10％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，检测深海古菌单链dna结合蛋白ssb结合单链dna的能力。结果见图2。图2结果表明深海古菌单链dna结合蛋白ssb具有很强的单链dna结合活性，当ssb蛋白的加入量大于等于1pmole时(也就是ssb蛋白与单链dna的分子比大于等于1)，所有的单链dna都能够被ssb蛋白结合。

5)将制备的深海古菌单链dna结合蛋白ssb应用于taqdna聚合酶的pcr反应中。

pcr扩增目的基因选择大肠杆菌三磷酸甘油醛脱氢酶(gapdh)基因，pcr反应缓冲液(50μl)：10mmtris-hcl(ph8.3at25℃),20mmkcl,10mm(nh4)2so4,0.01％(v/v)tween20,and2mmmgcl2；其它组分为0.2mmdntp，0.3μm引物，20ng大肠杆菌基因组dna，2.5单位taqdna聚合酶。将pcr反应产物中的引物二聚体进行定量，并与不加深海古菌单链dna结合蛋白ssb的实验组进行对比，结果见图3。由图3可见，当加入的深海古菌ssb量与引物分子数相当时，基本上没有引物二聚体生成，当不加深海古菌ssb或加入量较少时，会有较多量的引物二聚体生成。

与现有技术相比，本发明深海古菌单链dna结合蛋白ssb可用于改善pcr扩增效果，可以大大提高pcr扩增产量，特别适用于长片段dna的pcr扩增反应，具体如下：

(1)通用性好，由于采用深海古菌单链dna结合蛋白ssb结合引物单链的方式抑制引物二聚体的形成，该方法即适用于pcr反应，也适用于抑制lamp，rpa等核酸等温扩增技术中引物二聚体的产生。

(2)操作条件简单。将深海古菌单链dna结合蛋白ssb与引物预先混合在一起，即可快速结合引物，防止引物间形成引物二聚体。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>上海交通大学

中国大洋矿产资源研究开发协会（中国大洋事务管理局）

<120>一种深海古菌单链dna结合蛋白ssb及其制备方法和应用

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>123

<212>prt

<213>深海古菌(无)

<400>1

metpropheilelysvallysaspleulysprolyslysglnprogly

151015

ileaspileilevalargvalilealalysasngluproargserval

202530

lysthrlystyrglymetserargvalcysaspleulysvalglyasp

354045

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65707580

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100105110

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