一种多能性干细胞的表观遗传稳定性研究方法与流程

本发明属于干细胞研究技术领域，具体涉及一种多能性干细胞的表观遗传稳定性研究方法。

背景技术：

多能性(pluripotency)，是指具有形成机体内超过一种类型细胞的能力，但往往是针对特定细胞系列的。一般一个系统具有几种质上不同的作用而言，特别是在发生构造学上，正在发育的一部分胚，具有几个不同的发生过程，表现出具有形成不同形态的能力；同时也指已经具有一定的形态和机能的细胞或组织，由于内在或外在条件的变化而能显示出其他各种不同的形态和机能的能力。前者适用尚未定型的胚区，例如脊椎动物原肠形成前的外胚叶就具有多能性。后者的情况适用于变形或变态，例如两栖类眼睛的色素层具有多能性。此外，在系统发生学或生理学领域中的多能概念，按上述情况而使用。

干细胞是一类具有无限的或者永生的自我更新能力的细胞、能够产生至少一种类型的、高度分化的子代细胞。

表型(phenotype)，又称性状，是指一个生物体(或细胞)可以观察到的性状或特征，是特定的基因型与环境相互作用的结果。包括个体形态、功能等各方面的表现，如身高、肤色、血型、酶活力、药物耐受力乃至性格等。经典遗传学(genetics)是指由于基因序列改变(如基因突变等)所引起的基因功能的变化，从而导致表型发生可遗传的改变；而表观遗传学(epigenetics)则是指在基因的dna序列没有发生改变的情况下，基因功能发生了可遗传的变化，并最终导致了表型的变化。

因此多能性干细胞的表观遗传稳定性的影响因素是目前亟需的研究目标，以明确多能性干细胞表观遗传稳定性与定向分化的关系和作用机理。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是克服现有的缺陷，提供一种多能性干细胞的表观遗传稳定性研究方法，以解决上述背景技术中提出的多能性干细胞的表观遗传稳定性的影响因素问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种多能性干细胞的表观遗传稳定性研究方法，包括以下步骤：

步骤一：取一只孕期13.5天的母鼠，断颈法处死后，取出子宫，放置在装有培养液的培养皿中，将子宫内的鼠体取出，并取出内部的胚胎，将取出的胚胎放置在另一个装有培养液的培养皿中；

步骤二：将子宫内的鼠体去头、四肢、尾和肝脏，随后用清洗液清洗两次后剪碎，并放置在另一个培养皿中，将清洗液吸出，入3mlpbs，2m10.05％的胰酶/edta，三分钟后，加入5ml成纤维细胞培养液终止胰酶消化，900rpm,10min，将上端的清液去除，加入2-3ml成纤维细胞培养液，重悬细胞沉淀，补充培养液，并放置在培养皿中进行培养，第二天更换培养液，获得原代胚胎成纤维细胞，并标记为p0代，再传代至p4-p5代后方可作为饲养层细胞；

步骤三：在p2代的细胞密度为80％左右时，用丝裂霉素处理，取出一部分，留下2ml左右，并加入丝裂霉素，使其浓度约为10μg/ml，随后放入培养箱中培养两小时，控制培养箱中氧气的密度为5-21％的范围内，两小时后将细胞取出，进行冻存备用处理；

步骤四：将冻存处理的细胞取出后，使用亲和富集法对细胞进行预处理，预处理完成后，对细胞进行亚硫酸氢盐处理后，pcr扩增，随后dna纯化与回收，随后进行t/a克隆处理；

步骤五：最后对t/最后对t/a克隆处理后的细胞放入观察箱1中进行测序，并与原序列做对比并分析，对数据进行记录。

优选的，所述步骤二中，当原代胚胎成纤维细胞传至p4-p5代后，使用丝裂霉素处理或经射线照射处理后，方可作为饲养层细胞。

优选的，所述步骤四中，亲和富集法预处理为将基因组dna超声波打断并变性后，使用5-甲基胞喀啶特异性抗体富集甲基化片段，再分离纯化得到甲基化dna片段。

优选的，所述步骤四中，对细胞进行亚硫酸氢盐处理后，原dna样本中的胞密啶(c)可转化为尿密啶(u)，而5-甲基胞喀啶脱氨基转化为尿喀啶的几率极低，因此便于对尿嘧啶(u)进行检测。

优选的，所述步骤四中，t/a克隆处理为利用tap酶能够在pcr产物的3’末端加上一个非模版依赖的a，而t载体是一种带有3’t突出端的载体，在连接酶的作用下，可以快速的、一步到位的把pcr产物直接插入到质粒载体的多克隆位点(mcs)中。

优选的，所述t载体是一种高效克隆pcr产物(ta克隆)的专用质粒载体，为线性化载体，无需酶切可直接与具有a末端的pcr产物连接。

一种多能性干细胞的表观遗传稳定性研究方法，包括观察箱，所述观察箱一侧上端设置有观察镜，所述观察箱一侧表面中间部分分别设置有显示器和控制按键，所述观察窗一侧表面下端通过铰链铰接有箱门，所述箱门表面设置有把手，所述观察箱另一侧表面设置有散热网，所述观察箱下端四角均设置有移动轮，所述移动轮设置有四个，四个所述移动轮上均安装有制动装置。

优选的，所述观察箱内部底端设置有电机箱，所述电机箱内部设置有转动电机，所述转动电机上端传动连接有托盘，所述观察箱内部固定连接有隔板，所述隔板下端设置有显微摄像装置，所述观察箱内部一侧表面设置有紫外线消毒灯。

与现有技术相比，本发明提供了一种多能性干细胞的表观遗传稳定性研究方法，具备以下有益效果：

1、本发明通过采用孕期13.5天的母鼠，一方面老鼠中的小白鼠的基因序列和人类的差不多，它的全基因组和人类的相似度极高，很多人类难以治愈的疾病可以在小白鼠身上找到相似性状，从而加以实验发现治病基因，另一方面实验专用白鼠的生物学意义较大，培育出的小鼠几乎完全没有个体差异(生理上)，生理上没有个体差异是否意味着气质上没有差异尚不明了，不过选择纯系实验白鼠主要还是为了尽可能的减少先天的个体差异；

2、本发明通过对细胞进行亚硫酸氢盐处理，使原dna样本中的胞密啶(c)可转化为尿密啶(u)，而5-甲基胞喀啶脱氨基转化为尿喀啶的几率极低，因此便于对尿嘧啶(u)进行检测。

附图说明

附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制，在附图中：

图1为本发明提出的多能性干细胞的表观遗传稳定性研究方法的系统流程图；

图2为本发明提出的多能性干细胞的表观遗传稳定性研究方法中观察箱的结构示意图；

图3为本发明提出的多能性干细胞的表观遗传稳定性研究方法中观察箱的剖视图；

图中：1、观察箱；2、移动轮；3、箱门；4、把手；5、显示器；6、控制按键；7、观察镜；8、散热网；9、电机箱；10、转动电机；11、托盘；12、紫外线消毒灯；13、显微摄像装置；14、隔板。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明提供一种技术方案：一种多能性干细胞的表观遗传稳定性研究方法，包括以下步骤：

步骤一：取一只孕期13.5天的母鼠，断颈法处死后，取出子宫，放置在装有培养液的培养皿中，将子宫内的鼠体取出，并取出内部的胚胎，将取出的胚胎放置在另一个装有培养液的培养皿中；

步骤二：将子宫内的鼠体去头、四肢、尾和肝脏，随后用清洗液清洗两次后剪碎，并放置在另一个培养皿中，将清洗液吸出，入3mlpbs，2m10.05％的胰酶/edta，三分钟后，加入5ml成纤维细胞培养液终止胰酶消化，900rpm,10min，将上端的清液去除，加入2-3ml成纤维细胞培养液，重悬细胞沉淀，补充培养液，并放置在培养皿中进行培养，第二天更换培养液，获得原代胚胎成纤维细胞，并标记为p0代，再传代至p4-p5代后方可作为饲养层细胞；

步骤三：在p2代的细胞密度为80％左右时，用丝裂霉素处理，取出一部分，留下2ml左右，并加入丝裂霉素，使其浓度约为10μg/ml，随后放入培养箱中培养两小时，控制培养箱中氧气的密度为5-21％的范围内，两小时后将细胞取出，进行冻存备用处理；

步骤四：将冻存处理的细胞取出后，使用亲和富集法对细胞进行预处理，预处理完成后，对细胞进行亚硫酸氢盐处理后，pcr扩增，随后dna纯化与回收，随后进行t/a克隆处理；

步骤五：最后对t/最后对t/a克隆处理后的细胞放入观察箱1中进行测序，并与原序列做对比并分析，对数据进行记录。

步骤二中，当原代胚胎成纤维细胞传至p4-p5代后，使用丝裂霉素处理或经射线照射处理后，方可作为饲养层细胞。

步骤四中，亲和富集法预处理为将基因组dna超声波打断并变性后，使用5-甲基胞喀啶特异性抗体富集甲基化片段，再分离纯化得到甲基化dna片段。

步骤四中，对细胞进行亚硫酸氢盐处理后，原dna样本中的胞密啶(c)可转化为尿密啶(u)，而5-甲基胞喀啶脱氨基转化为尿喀啶的几率极低，因此便于对尿嘧啶(u)进行检测。

步骤四中，t/a克隆处理为利用tap酶能够在pcr产物的3’末端加上一个非模版依赖的a，而t载体是一种带有3’t突出端的载体，在连接酶的作用下，可以快速的、一步到位的把pcr产物直接插入到质粒载体的多克隆位点(mcs)中。

t载体是一种高效克隆pcr产物(ta克隆)的专用质粒载体，为线性化载体，无需酶切可直接与具有a末端的pcr产物连接。

一种多能性干细胞的表观遗传稳定性研究方法，包括观察箱1，观察箱1一侧上端设置有观察镜7，观察箱1一侧表面中间部分分别设置有显示器5和控制按键6，观察窗1一侧表面下端通过铰链铰接有箱门3，箱门3表面设置有把手4，观察箱1另一侧表面设置有散热网8，观察箱1下端四角均设置有移动轮2，移动轮2设置有四个，四个移动轮2上均安装有制动装置。

观察箱1内部底端设置有电机箱9，电机箱9内部设置有转动电机10，转动电机10上端传动连接有托盘11，观察箱1内部固定连接有隔板14，隔板14下端设置有显微摄像装置13，观察箱1内部一侧表面设置有紫外线消毒灯12。

实施例一

一种多能性干细胞的表观遗传稳定性研究方法，包括以下步骤：

步骤一：取一只孕期13.5天的母鼠，断颈法处死后，取出子宫，放置在装有培养液的培养皿中，将子宫内的鼠体取出，并取出内部的胚胎，将取出的胚胎放置在另一个装有培养液的培养皿中；

步骤二：将子宫内的鼠体去头、四肢、尾和肝脏，随后用清洗液清洗两次后剪碎，并放置在另一个培养皿中，将清洗液吸出，入3mlpbs，2m10.05％的胰酶/edta，三分钟后，加入5ml成纤维细胞培养液终止胰酶消化，900rpm,10min，将上端的清液去除，加入2-3ml成纤维细胞培养液，重悬细胞沉淀，补充培养液，并放置在培养皿中进行培养，第二天更换培养液，获得原代胚胎成纤维细胞，并标记为p0代，再传代至p4-p5代后方可作为饲养层细胞；

步骤三：在p2代的细胞密度为80％左右时，用丝裂霉素处理，取出一部分，留下2ml左右，并加入丝裂霉素，使其浓度约为10μg/ml，随后放入培养箱中培养两小时，控制培养箱中氧气的密度为5％，两小时后将细胞取出，进行冻存备用处理；

步骤四：将冻存处理的细胞取出后，使用亲和富集法对细胞进行预处理，预处理完成后，对细胞进行亚硫酸氢盐处理后，pcr扩增，随后dna纯化与回收，随后进行t/a克隆处理；

步骤五：最后对t/最后对t/a克隆处理后的细胞放入观察箱1中进行测序，并与原序列做对比并分析，对数据进行记录。

步骤二中，当原代胚胎成纤维细胞传至p4-p5代后，使用丝裂霉素处理或经射线照射处理后，方可作为饲养层细胞。

步骤四中，亲和富集法预处理为将基因组dna超声波打断并变性后，使用5-甲基胞喀啶特异性抗体富集甲基化片段，再分离纯化得到甲基化dna片段。

步骤四中，对细胞进行亚硫酸氢盐处理后，原dna样本中的胞密啶(c)可转化为尿密啶(u)，而5-甲基胞喀啶脱氨基转化为尿喀啶的几率极低，因此便于对尿嘧啶(u)进行检测。

步骤四中，t/a克隆处理为利用tap酶能够在pcr产物的3’末端加上一个非模版依赖的a，而t载体是一种带有3’t突出端的载体，在连接酶的作用下，可以快速的、一步到位的把pcr产物直接插入到质粒载体的多克隆位点(mcs)中。

t载体是一种高效克隆pcr产物(ta克隆)的专用质粒载体，为线性化载体，无需酶切可直接与具有a末端的pcr产物连接。

一种多能性干细胞的表观遗传稳定性研究方法，包括观察箱1，观察箱1一侧上端设置有观察镜7，观察箱1一侧表面中间部分分别设置有显示器5和控制按键6，观察窗1一侧表面下端通过铰链铰接有箱门3，箱门3表面设置有把手4，观察箱1另一侧表面设置有散热网8，观察箱1下端四角均设置有移动轮2，移动轮2设置有四个，四个移动轮2上均安装有制动装置。

观察箱1内部底端设置有电机箱9，电机箱9内部设置有转动电机10，转动电机10上端传动连接有托盘11，观察箱1内部固定连接有隔板14，隔板14下端设置有显微摄像装置13，观察箱1内部一侧表面设置有紫外线消毒灯12。

实施例二

一种多能性干细胞的表观遗传稳定性研究方法，包括以下步骤：

步骤一：取一只孕期13.5天的母鼠，断颈法处死后，取出子宫，放置在装有培养液的培养皿中，将子宫内的鼠体取出，并取出内部的胚胎，将取出的胚胎放置在另一个装有培养液的培养皿中；

步骤二：将子宫内的鼠体去头、四肢、尾和肝脏，随后用清洗液清洗两次后剪碎，并放置在另一个培养皿中，将清洗液吸出，入3mlpbs，2m10.05％的胰酶/edta，三分钟后，加入5ml成纤维细胞培养液终止胰酶消化，900rpm,10min，将上端的清液去除，加入2-3ml成纤维细胞培养液，重悬细胞沉淀，补充培养液，并放置在培养皿中进行培养，第二天更换培养液，获得原代胚胎成纤维细胞，并标记为p0代，再传代至p4-p5代后方可作为饲养层细胞；

步骤三：在p2代的细胞密度为80％左右时，用丝裂霉素处理，取出一部分，留下2ml左右，并加入丝裂霉素，使其浓度约为10μg/ml，随后放入培养箱中培养两小时，控制培养箱中氧气的密度为8％，两小时后将细胞取出，进行冻存备用处理；

步骤四：将冻存处理的细胞取出后，使用亲和富集法对细胞进行预处理，预处理完成后，对细胞进行亚硫酸氢盐处理后，pcr扩增，随后dna纯化与回收，随后进行t/a克隆处理；

步骤五：最后对t/最后对t/a克隆处理后的细胞放入观察箱1中进行测序，并与原序列做对比并分析，对数据进行记录。

步骤二中，当原代胚胎成纤维细胞传至p4-p5代后，使用丝裂霉素处理或经射线照射处理后，方可作为饲养层细胞。

步骤四中，亲和富集法预处理为将基因组dna超声波打断并变性后，使用5-甲基胞喀啶特异性抗体富集甲基化片段，再分离纯化得到甲基化dna片段。

步骤四中，对细胞进行亚硫酸氢盐处理后，原dna样本中的胞密啶(c)可转化为尿密啶(u)，而5-甲基胞喀啶脱氨基转化为尿喀啶的几率极低，因此便于对尿嘧啶(u)进行检测。

步骤四中，t/a克隆处理为利用tap酶能够在pcr产物的3’末端加上一个非模版依赖的a，而t载体是一种带有3’t突出端的载体，在连接酶的作用下，可以快速的、一步到位的把pcr产物直接插入到质粒载体的多克隆位点(mcs)中。

t载体是一种高效克隆pcr产物(ta克隆)的专用质粒载体，为线性化载体，无需酶切可直接与具有a末端的pcr产物连接。

一种多能性干细胞的表观遗传稳定性研究方法，包括观察箱1，观察箱1一侧上端设置有观察镜7，观察箱1一侧表面中间部分分别设置有显示器5和控制按键6，观察窗1一侧表面下端通过铰链铰接有箱门3，箱门3表面设置有把手4，观察箱1另一侧表面设置有散热网8，观察箱1下端四角均设置有移动轮2，移动轮2设置有四个，四个移动轮2上均安装有制动装置。

观察箱1内部底端设置有电机箱9，电机箱9内部设置有转动电机10，转动电机10上端传动连接有托盘11，观察箱1内部固定连接有隔板14，隔板14下端设置有显微摄像装置13，观察箱1内部一侧表面设置有紫外线消毒灯12。

实施例三

一种多能性干细胞的表观遗传稳定性研究方法，包括以下步骤：

步骤一：取一只孕期13.5天的母鼠，断颈法处死后，取出子宫，放置在装有培养液的培养皿中，将子宫内的鼠体取出，并取出内部的胚胎，将取出的胚胎放置在另一个装有培养液的培养皿中；

步骤二：将子宫内的鼠体去头、四肢、尾和肝脏，随后用清洗液清洗两次后剪碎，并放置在另一个培养皿中，将清洗液吸出，入3mlpbs，2m10.05％的胰酶/edta，三分钟后，加入5ml成纤维细胞培养液终止胰酶消化，900rpm,10min，将上端的清液去除，加入2-3ml成纤维细胞培养液，重悬细胞沉淀，补充培养液，并放置在培养皿中进行培养，第二天更换培养液，获得原代胚胎成纤维细胞，并标记为p0代，再传代至p4-p5代后方可作为饲养层细胞；

步骤三：在p2代的细胞密度为80％左右时，用丝裂霉素处理，取出一部分，留下2ml左右，并加入丝裂霉素，使其浓度约为10μg/ml，随后放入培养箱中培养两小时，控制培养箱中氧气的密度为11％，两小时后将细胞取出，进行冻存备用处理；

步骤四：将冻存处理的细胞取出后，使用亲和富集法对细胞进行预处理，预处理完成后，对细胞进行亚硫酸氢盐处理后，pcr扩增，随后dna纯化与回收，随后进行t/a克隆处理；

步骤五：最后对t/最后对t/a克隆处理后的细胞放入观察箱1中进行测序，并与原序列做对比并分析，对数据进行记录。

步骤二中，当原代胚胎成纤维细胞传至p4-p5代后，使用丝裂霉素处理或经射线照射处理后，方可作为饲养层细胞。

步骤四中，亲和富集法预处理为将基因组dna超声波打断并变性后，使用5-甲基胞喀啶特异性抗体富集甲基化片段，再分离纯化得到甲基化dna片段。

步骤四中，对细胞进行亚硫酸氢盐处理后，原dna样本中的胞密啶(c)可转化为尿密啶(u)，而5-甲基胞喀啶脱氨基转化为尿喀啶的几率极低，因此便于对尿嘧啶(u)进行检测。

步骤四中，t/a克隆处理为利用tap酶能够在pcr产物的3’末端加上一个非模版依赖的a，而t载体是一种带有3’t突出端的载体，在连接酶的作用下，可以快速的、一步到位的把pcr产物直接插入到质粒载体的多克隆位点(mcs)中。

t载体是一种高效克隆pcr产物(ta克隆)的专用质粒载体，为线性化载体，无需酶切可直接与具有a末端的pcr产物连接。

一种多能性干细胞的表观遗传稳定性研究方法，包括观察箱1，观察箱1一侧上端设置有观察镜7，观察箱1一侧表面中间部分分别设置有显示器5和控制按键6，观察窗1一侧表面下端通过铰链铰接有箱门3，箱门3表面设置有把手4，观察箱1另一侧表面设置有散热网8，观察箱1下端四角均设置有移动轮2，移动轮2设置有四个，四个移动轮2上均安装有制动装置。

观察箱1内部底端设置有电机箱9，电机箱9内部设置有转动电机10，转动电机10上端传动连接有托盘11，观察箱1内部固定连接有隔板14，隔板14下端设置有显微摄像装置13，观察箱1内部一侧表面设置有紫外线消毒灯12。

实施例四

一种多能性干细胞的表观遗传稳定性研究方法，包括以下步骤：

步骤一：取一只孕期13.5天的母鼠，断颈法处死后，取出子宫，放置在装有培养液的培养皿中，将子宫内的鼠体取出，并取出内部的胚胎，将取出的胚胎放置在另一个装有培养液的培养皿中；

步骤二：将子宫内的鼠体去头、四肢、尾和肝脏，随后用清洗液清洗两次后剪碎，并放置在另一个培养皿中，将清洗液吸出，入3mlpbs，2m10.05％的胰酶/edta，三分钟后，加入5ml成纤维细胞培养液终止胰酶消化，900rpm,10min，将上端的清液去除，加入2-3ml成纤维细胞培养液，重悬细胞沉淀，补充培养液，并放置在培养皿中进行培养，第二天更换培养液，获得原代胚胎成纤维细胞，并标记为p0代，再传代至p4-p5代后方可作为饲养层细胞；

步骤三：在p2代的细胞密度为80％左右时，用丝裂霉素处理，取出一部分，留下2ml左右，并加入丝裂霉素，使其浓度约为10μg/ml，随后放入培养箱中培养两小时，控制培养箱中氧气的密度为15％，两小时后将细胞取出，进行冻存备用处理；

步骤四：将冻存处理的细胞取出后，使用亲和富集法对细胞进行预处理，预处理完成后，对细胞进行亚硫酸氢盐处理后，pcr扩增，随后dna纯化与回收，随后进行t/a克隆处理；

步骤五：最后对t/最后对t/a克隆处理后的细胞放入观察箱1中进行测序，并与原序列做对比并分析，对数据进行记录。

步骤二中，当原代胚胎成纤维细胞传至p4-p5代后，使用丝裂霉素处理或经射线照射处理后，方可作为饲养层细胞。

步骤四中，亲和富集法预处理为将基因组dna超声波打断并变性后，使用5-甲基胞喀啶特异性抗体富集甲基化片段，再分离纯化得到甲基化dna片段。

步骤四中，对细胞进行亚硫酸氢盐处理后，原dna样本中的胞密啶(c)可转化为尿密啶(u)，而5-甲基胞喀啶脱氨基转化为尿喀啶的几率极低，因此便于对尿嘧啶(u)进行检测。

步骤四中，t/a克隆处理为利用tap酶能够在pcr产物的3’末端加上一个非模版依赖的a，而t载体是一种带有3’t突出端的载体，在连接酶的作用下，可以快速的、一步到位的把pcr产物直接插入到质粒载体的多克隆位点(mcs)中。

t载体是一种高效克隆pcr产物(ta克隆)的专用质粒载体，为线性化载体，无需酶切可直接与具有a末端的pcr产物连接。

一种多能性干细胞的表观遗传稳定性研究方法，包括观察箱1，观察箱1一侧上端设置有观察镜7，观察箱1一侧表面中间部分分别设置有显示器5和控制按键6，观察窗1一侧表面下端通过铰链铰接有箱门3，箱门3表面设置有把手4，观察箱1另一侧表面设置有散热网8，观察箱1下端四角均设置有移动轮2，移动轮2设置有四个，四个移动轮2上均安装有制动装置。

观察箱1内部底端设置有电机箱9，电机箱9内部设置有转动电机10，转动电机10上端传动连接有托盘11，观察箱1内部固定连接有隔板14，隔板14下端设置有显微摄像装置13，观察箱1内部一侧表面设置有紫外线消毒灯12。

实施例五

一种多能性干细胞的表观遗传稳定性研究方法，包括以下步骤：

步骤一：取一只孕期13.5天的母鼠，断颈法处死后，取出子宫，放置在装有培养液的培养皿中，将子宫内的鼠体取出，并取出内部的胚胎，将取出的胚胎放置在另一个装有培养液的培养皿中；

步骤二：将子宫内的鼠体去头、四肢、尾和肝脏，随后用清洗液清洗两次后剪碎，并放置在另一个培养皿中，将清洗液吸出，入3mlpbs，2m10.05％的胰酶/edta，三分钟后，加入5ml成纤维细胞培养液终止胰酶消化，900rpm,10min，将上端的清液去除，加入2-3ml成纤维细胞培养液，重悬细胞沉淀，补充培养液，并放置在培养皿中进行培养，第二天更换培养液，获得原代胚胎成纤维细胞，并标记为p0代，再传代至p4-p5代后方可作为饲养层细胞；

步骤三：在p2代的细胞密度为80％左右时，用丝裂霉素处理，取出一部分，留下2ml左右，并加入丝裂霉素，使其浓度约为10μg/ml，随后放入培养箱中培养两小时，控制培养箱中氧气的密度为18％，两小时后将细胞取出，进行冻存备用处理；

步骤四：将冻存处理的细胞取出后，使用亲和富集法对细胞进行预处理，预处理完成后，对细胞进行亚硫酸氢盐处理后，pcr扩增，随后dna纯化与回收，随后进行t/a克隆处理；

步骤五：最后对t/最后对t/a克隆处理后的细胞放入观察箱1中进行测序，并与原序列做对比并分析，对数据进行记录。

步骤二中，当原代胚胎成纤维细胞传至p4-p5代后，使用丝裂霉素处理或经射线照射处理后，方可作为饲养层细胞。

步骤四中，亲和富集法预处理为将基因组dna超声波打断并变性后，使用5-甲基胞喀啶特异性抗体富集甲基化片段，再分离纯化得到甲基化dna片段。

步骤四中，对细胞进行亚硫酸氢盐处理后，原dna样本中的胞密啶(c)可转化为尿密啶(u)，而5-甲基胞喀啶脱氨基转化为尿喀啶的几率极低，因此便于对尿嘧啶(u)进行检测。

步骤四中，t/a克隆处理为利用tap酶能够在pcr产物的3’末端加上一个非模版依赖的a，而t载体是一种带有3’t突出端的载体，在连接酶的作用下，可以快速的、一步到位的把pcr产物直接插入到质粒载体的多克隆位点(mcs)中。

t载体是一种高效克隆pcr产物(ta克隆)的专用质粒载体，为线性化载体，无需酶切可直接与具有a末端的pcr产物连接。

一种多能性干细胞的表观遗传稳定性研究方法，包括观察箱1，观察箱1一侧上端设置有观察镜7，观察箱1一侧表面中间部分分别设置有显示器5和控制按键6，观察窗1一侧表面下端通过铰链铰接有箱门3，箱门3表面设置有把手4，观察箱1另一侧表面设置有散热网8，观察箱1下端四角均设置有移动轮2，移动轮2设置有四个，四个移动轮2上均安装有制动装置。

观察箱1内部底端设置有电机箱9，电机箱9内部设置有转动电机10，转动电机10上端传动连接有托盘11，观察箱1内部固定连接有隔板14，隔板14下端设置有显微摄像装置13，观察箱1内部一侧表面设置有紫外线消毒灯12。

实施例六

一种多能性干细胞的表观遗传稳定性研究方法，包括以下步骤：

步骤一：取一只孕期13.5天的母鼠，断颈法处死后，取出子宫，放置在装有培养液的培养皿中，将子宫内的鼠体取出，并取出内部的胚胎，将取出的胚胎放置在另一个装有培养液的培养皿中；

步骤二：将子宫内的鼠体去头、四肢、尾和肝脏，随后用清洗液清洗两次后剪碎，并放置在另一个培养皿中，将清洗液吸出，入3mlpbs，2m10.05％的胰酶/edta，三分钟后，加入5ml成纤维细胞培养液终止胰酶消化，900rpm,10min，将上端的清液去除，加入2-3ml成纤维细胞培养液，重悬细胞沉淀，补充培养液，并放置在培养皿中进行培养，第二天更换培养液，获得原代胚胎成纤维细胞，并标记为p0代，再传代至p4-p5代后方可作为饲养层细胞；

步骤三：在p2代的细胞密度为80％左右时，用丝裂霉素处理，取出一部分，留下2ml左右，并加入丝裂霉素，使其浓度约为10μg/ml，随后放入培养箱中培养两小时，控制培养箱中氧气的密度为21％，两小时后将细胞取出，进行冻存备用处理；

步骤四：将冻存处理的细胞取出后，使用亲和富集法对细胞进行预处理，预处理完成后，对细胞进行亚硫酸氢盐处理后，pcr扩增，随后dna纯化与回收，随后进行t/a克隆处理；

步骤五：最后对t/最后对t/a克隆处理后的细胞放入观察箱1中进行测序，并与原序列做对比并分析，对数据进行记录。

步骤二中，当原代胚胎成纤维细胞传至p4-p5代后，使用丝裂霉素处理或经射线照射处理后，方可作为饲养层细胞。

步骤四中，亲和富集法预处理为将基因组dna超声波打断并变性后，使用5-甲基胞喀啶特异性抗体富集甲基化片段，再分离纯化得到甲基化dna片段。

步骤四中，对细胞进行亚硫酸氢盐处理后，原dna样本中的胞密啶(c)可转化为尿密啶(u)，而5-甲基胞喀啶脱氨基转化为尿喀啶的几率极低，因此便于对尿嘧啶(u)进行检测。

步骤四中，t/a克隆处理为利用tap酶能够在pcr产物的3’末端加上一个非模版依赖的a，而t载体是一种带有3’t突出端的载体，在连接酶的作用下，可以快速的、一步到位的把pcr产物直接插入到质粒载体的多克隆位点(mcs)中。

t载体是一种高效克隆pcr产物(ta克隆)的专用质粒载体，为线性化载体，无需酶切可直接与具有a末端的pcr产物连接。

本发明的工作原理及使用流程：使用时，取一只孕期13.5天的母鼠，断颈法处死后，取出子宫，放置在装有培养液的培养皿中，将子宫内的鼠体取出，并取出内部的胚胎，将取出的胚胎放置在另一个装有培养液的培养皿中，将子宫内的鼠体去头、四肢、尾和肝脏，随后用清洗液清洗两次后剪碎，并放置在另一个培养皿中，将清洗液吸出，入3mlpbs，2m10.05％的胰酶/edta，三分钟后，加入5ml成纤维细胞培养液终止胰酶消化，900rpm,10min，将上端的清液去除，加入2-3ml成纤维细胞培养液，重悬细胞沉淀，补充培养液，并放置在培养皿中进行培养，第二天更换培养液，获得原代胚胎成纤维细胞，并标记为p0代，再传代至p4-p5代后方可作为饲养层细胞，在p2代的细胞密度为80％左右时，用丝裂霉素处理，取出一部分，留下2ml左右，并加入丝裂霉素，使其浓度约为10μg/ml，随后放入培养箱中培养两小时，控制培养箱中氧气的密度为5-20％的范围内，两小时后将细胞取出，进行冻存备用处理，将冻存处理的细胞取出后，使用亲和富集法对细胞进行预处理，预处理完成后，对细胞进行亚硫酸氢盐处理后，pcr扩增，随后dna纯化与回收，随后进行t/a克隆处理，最后对t/最后对t/a克隆处理后的细胞放入观察箱1中进行测序，并与原序列做对比并分析，对数据进行记录。

综上所述，通过控制培养箱中的氧气浓度，即控制胚胎成长环境的氧气浓度可以改变胚胎细胞印迹基因的表达水平，且氧气浓度为18％左右时，胚胎细胞印迹基因的表达水平受氧气浓度的影响最小，二者差异倍数约为1.60e+00。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。