一种高产N-乙酰神经氨酸的重组枯草芽孢杆菌及其构建方法、应用

文档序号：26263635发布日期：2021-08-13 19:15阅读：60来源：国知局

本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种高产n-乙酰神经氨酸的重组枯草芽孢杆菌及其构建方法、应用。

背景技术：

唾液酸(sialicacid,sa)是一类含有9个碳原子并具有吡喃糖结构的酸性氨基糖，又称神经氨酸，广泛存在于植物、动物和微生物中，且种类繁多，目前已发现的有50多种，包括n-乙酰神经氨酸(neu5ac)、n-甘酰神经氨酸(neu5gc)和去氨基神经氨酸(kdn)等；而n-乙酰神经氨酸(neu5ac)是其中最重要的一种唾液酸，它的含量占唾液酸家族的99％以上，是其他唾液酸合成的前体物质，通常位于细胞膜表面糖链的末端，参与多种生理功能。

目前，唾液酸以及其各类衍生产品已经在食品、药品和疾病诊断等多个领域得到了广泛的应用，主要具有提高婴儿的智力和记忆力、抗老年痴呆、抗识别、抗病毒、抗炎和抗肿瘤以及提高肠道对矿物质和维生素的吸收等功能。

目前，n-乙酰神经氨酸的生产途径有从禽蛋、牛奶和燕窝等含量丰富的天然材料中提取，该方法获得的产物易引起过敏反应；或者是通过化学法合成，但该方法存在底物成本高、产物产率低、污染严重；或者是全细胞催化法生产，该法存在转化率低、底物成本高、分离步骤复杂、产物存在内毒素等问题。再或者通过构建高产n-乙酰神经氨酸的基因工程菌，通过发酵法直接生产。但目前主要采用的是大肠杆菌为宿主，大肠杆菌本身属于条件致病菌，其产品在用于食品领域，尤其是婴幼儿食品中，可能存在安全性问题。

技术实现要素：

本发明为了克服上述现有技术中存在的问题，提供了一种高产n-乙酰神经氨酸的重组枯草芽孢杆菌。

本发明还提供了一种高产n-乙酰神经氨酸的重组枯草芽孢杆菌的构建方法。

本发明还提供了一种高产n-乙酰神经氨酸的重组枯草芽孢杆菌在发酵生产n-乙酰神经氨酸中的应用。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种高产n-乙酰神经氨酸的重组枯草芽孢杆菌，以枯草芽孢杆菌为表达宿主，将n-乙酰神经氨酸合成酶基因neub和n-乙酰葡萄糖胺2-差向异构酶基因neuc整合到枯草芽孢杆菌基因组上稳定表达，然后通过在质粒上过表达磷酸葡萄糖胺变位酶基因glmm和果糖6-磷酸转氨酶基因glms。

本发明的重组枯草芽孢杆菌是通过外源表达n-乙酰神经氨酸合成酶neub和n-乙酰葡萄糖胺2-差向异构酶neuc两个酶，结合枯草杆菌本身就有的从甘油或葡萄糖到udp-n-乙酰氨基葡萄糖的合成途径，搭建出完整的n-乙酰神经氨酸合成途径，然后将neubc的表达元件通过crispr系统整合到染色体上，再过表达的n-乙酰神经氨酸合成的两个限速酶(磷酸葡萄糖胺变位酶基因glmm和果糖6-磷酸转氨酶基因glms)，最终实现高产n-乙酰神经氨酸的目的。

所述枯草芽孢杆菌优选为枯草芽孢杆菌168(bacillussubtilis168；简称b.subtilis168)。所述重组枯草芽孢杆菌是以b.subtilis-pgrac-neubc为宿主菌株构建得到的。

作为优选，以质粒pht01为表达载体，以诱导型启动子pgrac过表达磷酸葡萄糖胺变位酶基因glmm和果糖6-磷酸转氨酶基因glms。

作为优选，所述诱导型启动子pgrac的核苷酸序列为seqidno.1。

作为优选，所述磷酸葡萄糖胺变位酶基因glmm的核苷酸序列为seqidno.2；所述果糖6-磷酸转氨酶基因glms的核苷酸序列为seqidno.3。

作为优选，所述b.subtilis-pgrac-neubc是通过全基因合成c.jejuni来源的n-乙酰神经氨酸合成酶基因neub和n-乙酰葡萄糖胺2-差向异构酶基因neuc，克隆到整合质粒pjoe8999上，重组于b.subtilis168基因组上，neubc的核苷酸序列为seqidno.4。

作为优选，所述磷酸葡萄糖胺变位酶基因glmm来源于枯草芽孢杆菌或能表达相同功能酶的微生物。

作为优选，所述果糖6-磷酸转氨酶基因glms来源于大肠杆菌或能表达相同功能酶的微生物。

一种高产n-乙酰神经氨酸的重组枯草芽孢杆菌的构建方法，包括以下步骤：

(1)将n-乙酰神经氨酸合成酶基因neub、n-乙酰葡萄糖胺2-差向异构酶基因neuc重组于枯草芽孢杆菌基因组；具体位置是淀粉酶amye基因上；

(2)在质粒上过表达磷酸葡萄糖胺变位酶基因glmm和果糖6-磷酸转氨酶基因glms，即得高产n-乙酰神经氨酸的重组枯草芽孢杆菌。

作为优选，步骤(1)的具体步骤为：

克隆n-乙酰神经氨酸合成酶基因neub和n-乙酰葡萄糖胺2-差向异构酶基因neubc，克隆pgrac启动子基因序列和淀粉酶amye两侧同源臂基因序列，4段基因通过overlappcr组装。

作为优选，步骤(2)的具体步骤为：

(a)以枯草芽孢杆菌基因组dna为模板pcr扩增获得glmm基因片段；

(b)以大肠杆菌菌株基因组dna为模板pcr扩增获得glms基因片段；

(c)以glmm片段和glms片段为模板pcr扩增获得glmm-glms基因片段；

(d)通过酶切连接克隆至表达载体pht01上。

一种高产n-乙酰神经氨酸的重组枯草芽孢杆菌的应用，以甘油为底物，采用所述重组枯草芽孢杆菌发酵生产n-乙酰神经氨酸。

作为优选，发酵生产n-乙酰神经氨酸具体包括以下步骤：

1)活化培养菌种，发酵培养基(g/l)：甘油20，胰蛋白胨3，酵母粉1，mgso4·7h20，补料培养基(g/l)：甘油800，酵母浸膏100，胰蛋白胨30；在发酵培养基中接种重组枯草芽孢杆菌；

2)将培养好的种子逐级放大，并在相应的发酵罐中进行好气培养，温度控制在37℃，ph通过氨水调控至6.8，溶氧保持在30％，同时补充合适的碳氮源；

3)加入异丙基-β-d-硫代吡喃半乳糖苷(iptg)，诱导相关蛋白的表达。

因此，本发明具有如下有益效果：本发明通过基因工程技术对b.subtilis进行改造，使其可以以甘油为底物直接合成n-乙酰神经氨酸，生产工艺简单、环境友好、无内毒素，可用于食品领域，具有工业化生产价值。

附图说明

图1是b.subtilis中甘油到n-乙酰神经氨酸的合成途径。

图2是bsbc、bsbcpm、bsbcps和bsbcpms的发酵数据图。

具体实施方式

下面通过具体实施例，并结合附图，对本发明的技术方案作进一步具体的说明。

在本发明中，若非特指，所有设备和原料均可从市场购得或是本行业常用的，下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域常规方法。

实施例1：基因组上表达neubc基因的重组菌株bs-neubc构建

一、neubc基因整合质粒pjoe8999-grna-l-pgrac-neubc-r的构建

1)根据neubc的基因序列(genbankno.af100048)全基因合成neubc基因，两端添加bamhⅰ和xbaⅰ位点；

2)将合成的基因片段用bamhⅰ和xbaⅰ双酶切，回收备用；

3)抽提表达质粒pht01，用bamhⅰ和xbaⅰ双酶切，回收备用；

4)连接上述酶切纯化好的载体和片段，用t4dna连接酶连接，并转入大肠杆菌dh5α感受态细胞中，得到表达载体pht01-neubc；

5)将amye淀粉酶基因序列输入网站http://chopchop.cbu.uib.no/中，计算最佳的grna序列，为tgaagatcaggctatcactg(seqidno.5)；

6)以b.subtilis总dna为模板，根据最佳的grna序列设计引物，正向引物f-bsaⅰ-grna：gagacctgaagatcaggctatcac(seqidno.6)和反向引物r-bsaⅰ-grna：gagacccagtgatagcctgatc(seqidno.7)，引物两端添加了bsaⅰ酶切位点，以便后续的基因操作；

7)以b.subtilis总dna为模板，以上述引物(seqidno.6-7所示)pcr扩增得到grna片段；

8)将质粒pjoe8999和grna片段用bsaⅰ酶切，回收并用t4dna连接酶连接，转入e.colidh5α感受态细胞中，得到整合载体pjoe8999-grna；

9)根据amye基因序列和grna基因序列设计上下游片段l、r的引物，l正向引物f-l-sfiⅰ：ggccaacgaggccggaagggaatcaaggagataaaagcat(seqidno.8)和反向引物r-l-laci：gtgagttaaggcctactagttgtcgactcttcatcatcattgg(seqidno.9)，正向引物前添加sfiⅰ酶切位点，反向引物添加pgrac-neubc同源序列；r正向引物f-neubc-r：gtttttaaggatataaaatgatggaaacaaccagatatttatg(seqidno.10)和反向引物r-sfiⅰ-r：ggccttattggccggcgctgccattattaaaaatcacttttgc(seqidno.11)，正向引物添加pgrac-neubc同源序列，反向引物添加sfiⅰ酶切位点；

10)以b.subtilis总dna为模板，以上述引物(seqidno.8-11所示)pcr扩增得到l臂(seqidno.12)和r臂(seqidno.13)；

11)根据pht01-neubc质粒基因序列和amye淀粉酶基因序列，设计pgrac-neubc的引物，正向引物f-l-laci：ccaatgatgatgaagagtcgacaactagtaggccttaactcacattaattgcgttgcgc(seqidno.14)和反向引物r-r-neubc：tgattcataaatatctggttgtttccatcattttatatccttaaaaactttttg(seqidno.15)，正向引物添加l臂同源片段，反向引物添加r臂同源序列，以便overlappcr的操作；

12)以pht01-neubc质粒为模板，以上述引物(seqidno.14-15所示)pcr扩增得到pgrac-neubc片段；

13)以l臂、r臂和pgrac-neubc片段为模板，以上述引物(seqidno.8、15、11所示)通过overlappcr扩增得到l-pgrac-neubc-r片段(seqidno.16)；

14)将质粒pjoe8999-grna和l-pgrac-neubc-r片段用sfiⅰ酶切，回收并用t4dna连接酶连接，转入e.colidh5α感受态细胞中，得到整合载体pjoe8999-grna-l-pgrac-neubc-r。

二、基因组上表达neubc基因的重组菌株筛选

1)将整合载体pjoe8999-grna-l-pgrac-neubc-r电转入b.subtilis感受态中，通过抗性筛选和和引物验证得到单交换菌株；

2)挑点至无抗lb试管中，加入木糖诱导cas9蛋白表达，后转入50℃摇床使质粒脱落；

3)涂布无抗平板上，将平板上的菌落分别挑至无抗和kan抗性平板上，对于无抗菌进行双交换验证，得到基因组上表达neubc的重组菌株bs-neubc。

实施例2：glms基因表达载体的构建

1)根据e.coli总dna基因序列中的glms基因及其上下游的序列设计引物，正向引物为f-bamhⅰ-glms：ggatccatgtgtggaattgttggcgcg(seqidno.17)和反向引物r-xbaⅰ-glms：tctagattactcaaccgtaaccgattttgccaggt(seqidno.18)，正向引物前添加bamhⅰ酶切位点，反向引物前添加xbaⅰ酶切位点；

2)以e.coli总dna为模板，以上述引物(seqidno.17-18所示)通过pcr扩增获得glms片段(seqidno.19)；

3)将质粒pht01和glms片段用bamhⅰ和xbaⅰ双酶切，回收并用t4dna连接酶连接，转入e.colidh5α感受态细胞中，得到表达载体pht01-glms。

实施例3：glmm基因表达载体的构建

1)根据b.subtilis总dna基因序列中的glms基因及其上下游的序列设计引物，正向引物为f-bamhⅰ-glmm：ggatccatgggcaagtattttggaacagacggtgtaa(seqidno.20)和反向引物r-xbaⅰ-glmm：tctagattactctaatcccatttctgaccgga(seqidno.21)，正向引物前添加bamhⅰ酶切位点，反向引物前添加xbaⅰ酶切位点；

2)以b.subtilis总dna为模板，以上述引物(seqidno.20-21所示)通过pcr扩增获得glmm(seqidno.22)片段；

3)将质粒pht01和glmm片段用bamhⅰ和xbaⅰ双酶切，回收并用t4dna连接酶连接，转入e.colidh5α感受态细胞中，得到表达载体pht01-glmm。

实施例4：glmm-glms基因表达载体的构建

1)根据glmm和glms基因序列设计引物，反向引物r-glms-glmm：atcgcgccaacaattccacacatttactctaatcccatttct(seqidno.23)，在反向引物上添加glms同源序列；

2)以glmm和glms片段为模板，以上述引物(seqidno.20、23、21所示)通过overlappcr扩增获得glmm-glms片段(seqidno.24)；

3)将质粒pht01和glmm-glms片段用bamhⅰ和xbaⅰ双酶切，回收并用t4dna连接酶连接，转入e.colidh5α感受态细胞中，得到表达载体pht01-glmm-glms。

实施例5：过表达基因产n-乙酰神经氨酸的重组b.subtilis菌株构建

1)将用液体lb培养基培养含有载体pht01-glmm、pht01-glms和pht01-glmm-glms的e.colidh5α菌株，抽提质粒pht01-glmm、pht01-glms和pht01-glmm-glms；

2)培养重组b.subtilis菌株bs-neubc，制备感受态细胞，并分别电击转化质粒pht01-glmm、pht01-glms和pht01-glmm-glms进入，获得基因工程菌株bs-neubc-pht01-glmm、bs-neubc-pht01-glms和bs-neubc-pht01-glmm-glms，分别命名为bsbcpm、bsbcps和bsbcpms，重组枯草芽孢杆菌菌株bs-neubc命名为bsbc。

实施例6：甘油为碳源发酵生产n-乙酰神经氨酸

1、种子和发酵培养基

发酵培养基(g/l)：甘油20，胰蛋白胨3，酵母粉1，mgso4·7h20；

补料培养基(g/l)：甘油800，酵母浸膏100，胰蛋白胨30。

2、发酵过程：

1)挑取bsbc、bsbcpm、bsbcps和bsbcpms单菌落于装液量5mllb试管中，37℃培养12小时；

2)2ml一级种子液接种于200ml种子培养基中，37℃，220rpm培养12h；

3)二级种子液接种于装液量3.8l的发酵罐中，37℃，搅拌速度300-700转/分钟，溶氧保持在30％以上，用氨水控制ph在6.8；

4)甘油耗完后，开始以1g/(l·h)的速度补加甘油，后根据溶氧变化调整补料速度；

5)发酵液菌体od600＝20左右时加入iptg(iptg终浓度为0.2mm)，37℃培养96h；

6)经检测，96h发酵结束时，bsbc产物n-乙酰神经氨酸的浓度可达8.99g/l，bsbcpm产物n-乙酰神经氨酸的浓度可达10.35g/l，bsbcps产物n-乙酰神经氨酸的浓度可达12.84g/l，bsbcpms产物n-乙酰神经氨酸的浓度可达14.64g/l。

发酵结果如表1所示，分别过表达过表达磷酸葡萄糖胺变位酶基因glmm和果糖6-磷酸转氨酶基因glms能有效提高n-乙酰神经氨酸的产量，而同时过表达双基因大大提高了n-乙酰神经氨酸的产量，较原菌株相比，提高了62.8％。

表1.各个菌株发酵产n-乙酰神经氨酸的结果

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。

序列表

<110>浙江工业大学

<120>一种高产n-乙酰神经氨酸的重组枯草芽孢杆菌及其构建方法、应用

<160>24

<170>siposequencelisting1.0

<210>2

<211>1506

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

tcactgcccgctttccagtcgggaaacctgtcgtgccagctgcattaatgaatcggccaa60

cgcgcggggagaggcggtttgcgtattgggcgccagggtggtttttcttttcaccagtga120

gacgggcaacagctgattgcccttcaccgcctggccctgagagagttgcagcaagcggtc180

cacgctggtttgccccagcaggcgaaaatcctgtttgatggtggttaacggcgggatata240

acatgagctgtcttcggtatcgtcgtatcccactaccgagatatccgcaccaacgcgcag300

cccggactcggtaatggcgcgcattgcgcccagcgccatctgatcgttggcaaccagcat360

cgcagtgggaacgatgccctcattcagcatttgcatggtttgttgaaaaccggacatggc420

actccagtcgccttcccgttccgctatcggctgaatttgattgcgagtgagatatttatg480

ccagccagccagacgcagacgcgccgagacagaacttaatgggcccgctaacagcgcgat540

ttgctggtgacccaatgcgaccagatgctccacgcccagtcgcgtaccgtcttcatggga600

gaaaataatactgttgatgggtgtctggtcagagacatcaagaaataacgccggaacatt660

agtgcaggcagcttccacagcaatggcatcctggtcatccagcggatagttaatgatcag720

cccactgacgcgttgcgcgagaagattgtgcaccgccgttttacaggcttcgacgccgct780

tcgttctaccatcgacaccaccacgctggcacccagttgatcggcgcgagatttaatcgc840

cgcgacaatttgcgacggcgcgtgcagggccagactggaggtggcaacgccaatcagcaa900

cgactgtttgcccgccagttgttgtgccacgcggttgggaatgtaattcagctccgccat960

cgccgcttccactttttcccgcgttttcgcagaaacgtggctggcctggttcaccacgcg1020

ggaaacggtctgataagagacaccggcatactctgcgacatcgtataacgttactggttt1080

catcaaaatcgtctccctccgtttgaatatttgattgatcgtaaccagatgaagcactct1140

ttccactatccctacagtgttatggcttgaacaatcacgaaacaataattggtacgtacg1200

atctttcagccgactcaaacatcaaatcttacaaatgtagtctttgaaagtattacatat1260

gtaagatttaaatgcaaccgttttttcggaaggaaatgatgacctcgtttccaccggaat1320

tagcttggtaccagctattgtaacataatcggtacgggggtgaaaaagctaacggaaaag1380

ggagcggaaaagaatgatgtaagcgtgaaaaattttttatcttatcacttgaaattggaa1440

gggagattctttattataagaattgtggaattgtgagcggataacaattcccaattaaag1500

gaggaa1506

<210>2

<211>1347

<212>dna

<213>磷酸葡萄糖胺变位酶(artificialsequence)

<400>2

atgggcaagtattttggaacagacggtgtaagaggtgtcgccaatagtgagcttacacct60

gagctggcctttaaagtcggacgtttcggcggttatgtgctgacaaaagacaaacaacgt120

ccaaaagtgctgataggccgcgatacacgcatctccggccatatgctggagggagccctt180

gtcgccggacttttatccattggcgcagaagtcatgcgcctgggtgtcatttctacacca240

ggtgtatcttatttgacaaaagcgatggatgcagaggcgggcgtcatgatttccgcttct300

cataacccagtgcaggataacggcatcaaattctttgggggagatggatttaagctttct360

gatgaacaggaggctgaaattgagcgcctgatggacgaacctgaggataagctgccaaga420

cctgtcggagcagaccttggacttgtaaacgattattttgaaggcggacaaaaatatctg480

caattcttaaaacagacagctgatgaagatttcacaggcattcatgtggcattggactgt540

gccaatggcgcaacgtcatccttggcgacacacctgtttgctgatttagatgcagatgtt600

tctacaatggggacttccccgaacggattaaacattaatgacggcgtcggttcgactcat660

cccgaagcgctcagcgcgtttgtcaaagagaaaaacgcggatctcggtcttgcgttcgac720

ggtgacggcgaccgcctgattgctgtcgatgaaaaaggaaatattgtagacggcgaccaa780

atcatgtacatatgctcaaaacatctgaaatcagagggccgtttaaaggatgatacagtg840

gtttcaaccgtgatgagcaacctcggcttctataaggcgctcgaaaaagaaggcatcaaa900

agcgtgcagacagctgtcggcgaccgctacgtagtagaagcaatgaaaaaagacggctac960

aacgtcggcggagagcagtcaggacatcttattttccttgattacaacacgacaggggac1020

ggattattgtctgctattatgctgatgaacactttaaaagcaacaggcaagccgctgtca1080

gagcttgcagctgaaatgcagaagttcccgcagctgttagtcaatgtgagagtgactgat1140

aaatataaagttgaagaaaatgaaaaagtaaaagcagttatttctgaagttgaaaaagaa1200

atgaacggcgacggccggattttggtgcgcccttcaggaactgaaccgctcgtccgtgtc1260

atggctgaagcgaagacgaaagagctgtgcgatgagtatgtcaatcgcattgttgaagtc1320

gtccggtcagaaatgggattagagtaa1347

<210>3

<211>1830

<212>dna

<213>果糖6-磷酸转氨酶(artificialsequence)

<400>3

atgtgtggaattgttggcgcgatcgcgcaacgtgatgtagcagaaatccttcttgaaggt60

ttacgtcgtctggaataccgcggatatgactctgccggtctggccgttgttgatacagaa120

ggtcatatgacccgcctgcgtcgcctcggtaaagtccagatgctggcacaggcagcggaa180

gaacatcctctgcatggcggcactggtattgctcacactcgctgggcgacccacggtgaa240

ccttcagaagtgaatgcgcatccgcatgtttctgaacacattgtggtggtgcataacggc300

atcatcgaaaaccatgaaccgctgcgtgaagagctaaaagcgcgtggctataccttcgtt360

tctgaaaccgacaccgaagtgattgcccatctggtgaactgggagctgaaacaaggcggg420

actctgcgtgaggccgttctgcgtgctatcccgcagctgcgtggtgcgtacggtacagtg480

atcatggactcccgtcacccggataccctgctggcggcacgttctggtagtccgctggtg540

attggcctggggatgggcgaaaactttatcgcttctgaccagctggcgctgttgccggtg600

acccgtcgctttatcttccttgaagagggcgatattgcggaaatcactcgccgttcggta660

aacatcttcgataaaactggcgcggaagtaaaacgtcaggatatcgaatccaatctgcaa720

tatgacgcgggcgataaaggcatttactgtcactacatgcagaaagagatctacgaacag780

ccgaacgcgatcaaaaacacccttaccggacgcatcagccacggtcaggttgatttaagc840

gagctgggaccgaacgccgacgaactgctgtcgaaggttgagcatattcagatcctcgcc900

tgtggtacttcttataactccggtatggtttcccgctactggtttgaatcgctagcaggt960

attccgtgcgacgtcgaaatcgcctctgaattccgctatcgcaaatctgccgtgcgtcgt1020

aacagcctgatgatcaccttgtcacagtctggcgaaaccgcggataccctggctggcctg1080

cgtctgtcgaaagagctgggttaccttggttcactggcaatctgtaacgttccgggttct1140

tctctggtgcgcgaatccgatctggcgctaatgaccaacgcgggtacagaaatcggcgtg1200

gcatccactaaagcattcaccactcagttaactgtgctgttgatgctggtggcgaagctg1260

tctcgcctgaaaggtctggatgcctccattgaacatgacatcgtgcatggtctgcaggcg1320

ctgccgagccgtattgagcagatgctgtctcaggacaaacgcattgaagcgctggcagaa1380

gatttctctgacaaacatcacgcgctgttcctgagccgtggcgatcagtacccaatcgcg1440

ctggaaggcgcattgaagttgaaagagatctcttacattcacgctgaagcctacgctgct1500

ggcgaactgaaacacggtccgctggcgctaattgatgccgatatgccggttattgttgtt1560

gcaccgaacaacgaattgctggaaaaactgaaatccaacattgaagaagttcgcgcgcgt1620

ggcggtcagttgtatgtcttcgccgatcaggatgcgggttttgtaagtagcgataacatg1680

cacatcatcgagatgccgcatgtggaagaggtgattgcaccgatcttctacaccgttccg1740

ctgcagctgctggcttaccatgtcgcgctgatcaaaggcaccgacgttgaccagccgcgt1800

aacctggcaaaatcggttacggttgagtaa1830

<210>4

<211>1554

<212>dna

<213>枯草芽孢杆菌(artificialsequence)

<400>4

attttcttgtatggtaggcttaagcgaccacacaacagataatcttgcgtgtttaggtgc60

agttgtacttggagcttgtgtgcttgaaagacattttactgatagtatgcatagaagtgg120

ccctgatatagtttgttctatggatacaaaggctttaaaagagctaattatacaaagtga180

gcaaatggctataataagaggaaataatgaaagtaaaaaagcggctaaacaagaacaagt240

tacaattgattttgcctttgcaagtgtagttagcattaaagatattaaaaaaggcgaagt300

tttatctatggataatatttgggttaaaagacctggacttggtggaattagtgcggctga360

atttgaaaatattttaggcaaaaaagcattaagagatatagaaaatgatgctcagttaag420

ctatgaggattttgcgtgaaaaaaatcctttttataacaggctctagggctgattattct480

aagattaaatctttaatgtacagggtgcaaaactcaagcgaatttgaactttacatcttt540

gcaacaggaatgcacttaagtaaaaattttggctatacagttaaagaactttataaaaat600

ggctttaaaaatatttatgaatttataaattatgataaatattatcaaactgataaggct660

ttagctactacaattgatggattttcaaggtatgcaaatgagctaaaacctgatttaatc720

gtagtacatggagatagaattgagcctttagcagcagctattgttggagcattaaataat780

atcttagtagcgcatattgaaggcggagagatttcaggaactattgacgatagcttacgc840

cacgctatatcaaaactagctcatattcatttagtaaatgatgagtttgcaaaaaggcgt900

ttaatgcagcttggagaagatgaaaaatctatttttatcataggttcgcctgatttagaa960

cttttaaacgataataaaatttcacttagcgaagcaaaaaaatattatgatataaattat1020

gaaaactacgctttgcttatgtttcatcctgttacaactgaaattactagcattaaaaat1080

caagcagacaatttagtaaaagcactgatacaaagtaataaaaattatattgttatttat1140

ccaaataatgatttaggttttgaattaatcttgcaaagctatgaagagtttaaaaataac1200

cctagatttaagctttttccatcgcttagatttgagtattttataactttgttaaaaaat1260

gctgattttataataggtaattcaagttgtattttaaaagaggccttatacttaaaaaca1320

gcagggattttagttggctcaagacaaaatggaagacttggcaatgaaaatacactaaaa1380

gttaatgcaaatagtgatgaaatactaaaagctattaacactattcataaaaaacaagat1440

ttatttagcgctaagttagagattttagatagctcaaaattattttttgaatatttacaa1500

agcggagatttttttaaactcagcacacaaaaagtttttaaggatataaaatga1554

<210>6

<211>20

<212>dna

<213>amye淀粉酶(artificialsequence)

<400>6

tgaagatcaggctatcactg20

<210>6

<211>24

<212>dna

<213>正向引物(artificialsequence)

<400>6

gagacctgaagatcaggctatcac24

<210>7

<211>24

<212>dna

<213>反向引物(artificialsequence)

<400>7

gagacctgaagatcaggctatcac24

<210>8

<211>40

<212>dna

<213>l正向引物(artificialsequence)

<400>8

ggccaacgaggccggaagggaatcaaggagataaaagcat40

<210>9

<211>43

<212>dna

<213>反向引物(artificialsequence)

<400>9

gtgagttaaggcctactagttgtcgactcttcatcatcattgg43

<210>10

<211>43

<212>dna

<213>r正向引物(artificialsequence)

<400>10

gtttttaaggatataaaatgatggaaacaaccagatatttatg43

<210>11

<211>43

<212>dna

<213>反向引物(artificialsequence)

<400>11

ggccttattggccggcgctgccattattaaaaatcacttttgc43

<210>12

<211>700

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>12

ggaagggaatcaaggagataaaagcatgtcgaactggtactggctgtatcagccgacatc60

gtatcaaattggcaaccgttacttaggtactgaacaagaatttaaagaaatgtgtgcagc120

cgctgaagaatatggcataaaggtcattgttgacgcggtcatcaatcataccaccagtga180

ttatgccgcgatttccaatgaggttaagagtattccaaactggacacatggaaacacaca240

aattaaaaactggtctgatcgatgggatgtcacgcagaattcattgctcgggctgtatga300

ctggaatacacaaaatacacaagtacagtcctatctgaaacggttcttagacagggcatt360

gaatgacggggcagacggttttcgatttgatgccgccaaacatatagagcttccagatga420

tggcagttacggcagtcaattttggccgaatatcacaaatacatctgcagagttccaata480

cggagaaatcctgcaggatagtgcctccagagatgctgcatatgcgaattatatggatgt540

gacagcgtctaactatgggcattccataaggtccgctttaaagaatcgtaatctgggcgt600

gtcgaatatctcccactatgcatctgatgtgtctgcggacaagctagtgacatgggtaga660

gtcgcatgatacgtatgccaatgatgatgaagagtcgaca700

<210>13

<211>700

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>13

tggaaacaaccagatatttatgaatcagcgcggctcacatggcgttgtgctggcaaatgc60

aggttcatcctctgtctctatcaatacggcaacaaaattgcctgatggcaggtatgacaa120

taaagctggagcgggttcatttcaagtgaacgatggtaaactgacaggcacgatcaatgc180

caggtctgtagctgtgctttatcctgatgatattgcaaaagcgcctcatgttttccttga240

gaattacaaaacaggtgtaacacattctttcaatgatcaactgacgattaccttgcgtgc300

agatgcgaatacaacaaaagccgtttatcaaatcaataatggaccagagacggcgtttaa360

ggatggagatcaattcacaatcggaaaaggagatccatttggcaaaacatacaccatcat420

gttaaaaggaacgaacagtgatggtgtaacgaggaccgagaaatacagttttgttaaaag480

agatccagcgtcggccaaaaccatcggctatcaaaatccgaatcattggagccaggtaaa540

tgcttatatctataaacatgatgggagccgagtaattgaattgaccggatcttggcctgg600

aaaaccaatgactaaaaatgcagacggaatttacacgctgacgctgcctgcggacacgga660

tacaaccaacgcaaaagtgatttttaataatggcagcgcc700

<210>14

<211>59

<212>dna

<213>正向引物(artificialsequence)

<400>14

ccaatgatgatgaagagtcgacaactagtaggccttaactcacattaattgcgttgcgc59

<210>15

<211>54

<212>dna

<213>反向引物(artificialsequence)

<400>15

tgattcataaatatctggttgtttccatcattttatatccttaaaaactttttg54

<210>16

<211>5117

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>16