一种微生物组合发酵剂及其制备方法和应用与流程

1.本发明涉及微生物发酵技术领域，尤其涉及一种微生物组合发酵剂及其制备方法和应用。


背景技术：

2.酸奶是以牛奶为原料，经过巴氏杀菌后再向牛奶中添加有益菌并发酵得到，是一种营养丰富、易于消化的民间饮料，可增强人体免疫功能，降低血清胆固醇的水平，甚至在不用任何药物的情况下，每餐饮用约240克酸奶，一周后可见胆固醇降低。此外，常饮用酸奶能促进肠道运动，软化酵解结肠内容物，增加粪便排泄量，预防便秘发生，有益于预防结肠癌。因为以上优势，酸奶产业得到快速发展并收到人们的青睐。
3.酸奶发酵制备过程中，酸奶发酵剂成为影响酸奶品质好坏的关键因素，其是酸奶产品产香和产酸的基础和主要原因。因此，酸奶质量和风味的好坏主要取决于酸奶发酵剂的品质、类型及活力。酸奶发酵剂也成为制约酸奶产业发展的中药因素之一。
4.直投式酸奶发酵剂，是不含食用香精成分的发酵剂。食用香精是由多种有机化合物组合而成将其加入到发酵剂中，会降低菌种的发酵活力及储藏稳定性。但是，若不加香精，则会影响酸奶产品的风味和口感。因此，现有的酸奶都是先通过发酵前进行调香精或发酵后加入香精来使酸奶具有所需的风味。这样导致了酸奶的发酵工艺的复杂，增加生产成本。


技术实现要素：

5.针对现有酸奶发酵剂存在的上述问题，本发明提供一种微生物组合发酵剂及其制备方法和应用，该微生物组合发酵剂可发酵得到具有特殊醋酸风味的浓郁酪香味发酵产品，并且发酵速度快、高产γ氨基丁酸，可作为一种新的可产生特殊风味的酸奶发酵剂。
6.为达到上述发明目的，本发明实施例采用了如下的技术方案：
7.一种微生物组合发酵剂，包括以下菌株：
8.瑞士乳杆菌l551、副干酪乳杆菌l578和嗜热链球菌s56；
9.所述瑞士乳杆菌l551的菌种保藏编号为cgmcc no.15604；瑞士乳杆菌l551的拉丁文名称为lactobacillus helveticus，为专利cn111685328a、专利名称为“那曲4580益生菌及其制剂在调节情绪的食品中的应用”中公开的菌种，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
10.所述副干酪乳杆菌l578的菌种保藏编号为cgmcc no.15603；副干酪乳杆菌l578的拉丁文名称为lactobacillus paracasei，为专利cn111685328a、专利名称为“那曲4580益生菌及其制剂在调节情绪的食品中的应用”中公开的菌种，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
11.所述嗜热链球菌s56的菌种保藏编号为cgmcc no.22066，其拉丁文名称为：streptococcus thermophilus，于2021年03月25日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通
微生物中心进行保藏，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
12.相对于现有技术，本发明提供的微生物组合发酵剂中，上述瑞士乳杆菌、副干酪乳杆菌和嗜热链球菌的复配，具有发酵周期段、发酵产物风味好的优势。其发酵产物可高产γ氨基丁酸，并在发酵奶中产生高含量的挥发性短链脂肪酸(以乙酸为代表，及一定量的己酸、辛酸)和香气物质(丁二酮和乙偶姻)，使得到的发酵奶具有醋酸风味的浓郁酪香风味，且在未添加任何香精的情况下能使发酵奶长时间保持浓郁的香气。
13.优选的，所述微生物组合发酵剂中，所述瑞士乳杆菌l551、所述副干酪乳杆菌l578和所述嗜热链球菌s56的活菌数的比例为350
‑
450:200
‑
400:20
‑
50。
14.上述菌体比例的复配，可实现菌体间的协同增长，进一步缩短其发酵周期。
15.优选的，本发明还提供了所述微生物组合发酵剂的制备方法，该制备方法包括以下步骤：
16.a、将所述瑞士乳杆菌l551、副干酪乳杆菌l578和嗜热链球菌s56活化后，分别加入液体培养基中37
‑
45℃发酵10
‑
12h，得到瑞士乳杆菌发酵液、副干酪乳杆菌发酵液和嗜热链球菌发酵液；
17.b、将所述瑞士乳杆菌发酵液、所述副干酪乳杆菌发酵液和所述嗜热链球菌发酵液分别进行离心，分离菌体，得到瑞士乳杆菌菌泥、副干酪乳杆菌菌泥和嗜热链球菌菌泥；
18.c、向所述瑞士乳杆菌菌泥、副干酪乳杆菌菌泥和嗜热链球菌菌泥中分别加入冻干保护剂，然后进行冷冻干燥，得到瑞士乳杆菌菌粉、副干酪乳杆菌菌粉和嗜热链球菌菌粉；
19.d、按照所述微生物组合发酵剂中的所述瑞士乳杆菌、所述副干酪乳杆菌和所述嗜热链球菌的活菌数的比例，将所述瑞士乳杆菌菌粉、副干酪乳杆菌菌粉和嗜热链球菌菌粉进行复配，得到所述微生物组合发酵剂。
20.相对于现有技术，本发明提供的微生物组合发酵剂的制备方法操作简单、常规菌体发酵设备即可完成，且发酵时间短，得到的微生物组合发酵剂中菌体活性好、活菌含量高。
21.优选的，步骤a中，所述液体培养基包括以下质量百分含量的组分：葡萄糖：2.5
‑
3.5％，酵母浸粉：1
‑
2％，大豆蛋白胨：0.8
‑
1.2％，磷酸氢二钠：0.13
‑
0.17％，磷酸二氢钠：0.2
‑
0.3％，硫酸镁：0.01
‑
0.03％，抗坏血酸：0.2
‑
0.4％，吐温80：0.06
‑
0.08％和余量的无菌水。
22.优选的，所述冻干保护剂包括以下质量百分含量的组分：脱脂乳8％
‑
15％、海藻糖5％
‑
12％、味精0.5％
‑
5％、蔗糖1％
‑
5％、甘油0.5％
‑
3％、抗坏血酸钠0.1％
‑
3％和余量的无菌水；所述冻干保护剂的加入量为菌泥质量的85
‑
200％。更优选的，所述冻干保护剂包括以下质量百分含量的组分：脱脂乳10％、海藻糖8％、味精3％、蔗糖2％、甘油1％、抗坏血酸钠1％和余量的无菌水。
23.本发明还提供了所述微生物组合发酵剂在作为直投式酸奶发酵剂中的应用。
24.本发明提供的所述微生物组合发酵剂作为直投式酸奶发酵剂可直接得到风味特殊并具有浓郁香气的酸奶产品，且避免了香精的加入，简化了酸奶的制作步骤和成本。
25.本发明还提供了一种酸奶的制备方法，该制备方法包括以下步骤：
26.s1、将鲜奶加热至50
‑
55℃，加入白砂糖、乳清粉和谷氨酸钠，搅拌溶解后，加热至55
‑
60℃，得到奶液；
27.s2、将奶液进行均质和巴氏消毒后，降温至37
‑
45℃，加入所述的微生物组合发酵剂，并在37
‑
45℃下发酵，待发酵液ph≤4且酸度≥110
°
t时，进行搅拌破乳和冷却细化，得到所述酸奶。
28.本发明提供的酸奶的制备方法操作简单、发酵速度快，制备得到的酸奶具有特殊的醋酸酪香风味，口感较佳。
29.优选的，步骤s1中，所述鲜奶、白砂糖、乳清粉和谷氨酸钠的质量比为850
‑
920:50
‑
110:2
‑
10:0.5
‑
2。
30.优选的，步骤s2中，所述微生物组合发酵剂与所述鲜奶的质量比为0.01
‑
0.08:850
‑
920。
31.优选的，步骤s2中，所述均质的温度为50
‑
75℃、压力为5
‑
20mpa。
32.优选的，步骤s2中，所述巴氏消毒的温度为94
‑
96℃、时间为300
‑
350s。
33.本发明还提供了一种酸奶，该酸奶由上述酸奶的制备方法制得。
附图说明
34.图1是本发明试验例1中gc
‑
ms检测法检测得到的实施例1中制得的酸奶的图谱；
35.图2是本发明试验例1中得到的乙酸含量的标准曲线图；
36.图3是本发明试验例1中乙酸标准品的色谱图；
37.图4是本发明试验例1中检测实施例1中得到的酸奶中乙酸含量的色谱图；
38.图5是本发明试验例1中检测市售酸奶1中乙酸含量的色谱图；
39.图6是本发明试验例1中检测市售酸奶2中乙酸含量的色谱图；
40.图7是本发明试验例1中检测实施例1中得到的酸奶中γ
‑
氨基丁酸含量的色谱图。
具体实施方式
41.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
42.为了更好的说明本发明实施例提供的，下面通过实施例做进一步的举例说明。
43.实施例1
44.一种微生物组合发酵剂，包括以下菌株：
45.瑞士乳杆菌l551、副干酪乳杆菌l578和嗜热链球菌s56；其中，瑞士乳杆菌l551、副干酪乳杆菌l578和嗜热链球菌s56的活菌数的比例为400:300:35
46.所述瑞士乳杆菌l551的菌种保藏编号为cgmcc no.15604，拉丁文名称为lactobacillus helveticus，为专利cn111685328a、专利名称为“那曲4580益生菌及其制剂在调节情绪的食品中的应用”中公开的菌种，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；
47.所述副干酪乳杆菌l578的菌种保藏编号为cgmcc no.15603，其拉丁文名称为lactobacillus paracasei，为专利cn111685328a、专利名称为“那曲4580益生菌及其制剂在调节情绪的食品中的应用”中公开的菌种，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；
48.所述嗜热链球菌s56的菌种保藏编号为cgmcc no.22066，其拉丁文名称为：streptococcus thermophilus，于2021年03月25日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
49.上述微生物组合发酵剂的制备方法包括以下步骤：
50.a、将瑞士乳杆菌l551、副干酪乳杆菌l578和嗜热链球菌s56活化后，分别加入液体培养基中42℃发酵10h，分别得到瑞士乳杆菌发酵液、副干酪乳杆菌发酵液和嗜热链球菌发酵液；
51.b、将瑞士乳杆菌发酵液、副干酪乳杆菌发酵液和嗜热链球菌发酵液分别进行离心，分离菌体，得到瑞士乳杆菌菌泥、副干酪乳杆菌菌泥和嗜热链球菌菌泥；
52.c、向瑞士乳杆菌菌泥、副干酪乳杆菌菌泥和嗜热链球菌菌泥中分别加入冻干保护剂，然后进行冷冻干燥，得到瑞士乳杆菌菌粉、副干酪乳杆菌菌粉和嗜热链球菌菌粉；
53.d、按照上述微生物组合发酵剂中的瑞士乳杆菌、副干酪乳杆菌和嗜热链球菌的活菌数的比例，将瑞士乳杆菌菌粉、副干酪乳杆菌菌粉和嗜热链球菌菌粉进行复配，得到所述微生物组合发酵剂。
54.其中，液体培养基包括以下质量百分含量的组分：葡萄糖：3％，酵母浸粉：1.5％，大豆蛋白胨：1％，磷酸氢二钠：0.15％，磷酸二氢钠：0.25％，硫酸镁：0.02％，抗坏血酸：0.3％，吐温80：0.07％。
55.冻干保护剂包括以下质量百分含量的组分：脱脂乳10％、海藻糖8％、味精3％、蔗糖2％、甘油1％、抗坏血酸钠1％和余量的无菌水；冻干保护剂的加入量为菌泥质量的100％。
56.利用上述制备得到的微生物组合发酵剂制备酸奶，制备方法包括以下步骤：
57.s1、每升酸奶产品准备白砂糖80克、鲜奶900克，浓缩乳清粉粉5克，谷氨酸钠1克，微生物组合发酵剂0.04克(其中，瑞士乳杆菌活菌数4
×
10
10
cfu/g，副干酪乳杆菌活菌数3
×
10
10
cfu/g，嗜热链球菌3.5
×
109cfu/g)和余量的水；将鲜奶加热至52℃，加入白砂糖、乳清粉和谷氨酸钠，搅拌溶解后，加热至58℃，得到奶液；
58.s2、将奶液在温度为60℃、压力为10mpa下进行均质，然后在温度为95℃下巴氏消毒，消毒时间为330s，巴氏消毒完成后降温至42℃，加入微生物组合发酵剂，并在42℃下发酵11h后，发酵液的ph为3.8，酸度为115
°
t，再在发酵罐内进行搅拌破乳和翻缸冷却细化，得到的酸奶在20
±
1℃下灌装、封盖，在4℃下冷藏后熟。
59.实施例2
60.一种微生物组合发酵剂，包括以下菌株：
61.瑞士乳杆菌l551、副干酪乳杆菌l578和嗜热链球菌s56；其中，瑞士乳杆菌l551、副干酪乳杆菌l578和嗜热链球菌s56的活菌数的比例为350:400:50。
62.上述微生物组合发酵剂的制备方法包括以下步骤：
63.a、将瑞士乳杆菌l551、副干酪乳杆菌l578和嗜热链球菌s56活化后，分别加入液体培养基中37℃发酵12h，分别得到瑞士乳杆菌发酵液、副干酪乳杆菌发酵液和嗜热链球菌发酵液；
64.b、将瑞士乳杆菌发酵液、副干酪乳杆菌发酵液和嗜热链球菌发酵液分别进行离心，分离菌体，得到瑞士乳杆菌菌泥、副干酪乳杆菌菌泥和嗜热链球菌菌泥；
65.c、向瑞士乳杆菌菌泥、副干酪乳杆菌菌泥和嗜热链球菌菌泥中分别加入冻干保护剂，然后进行冷冻干燥，得到瑞士乳杆菌菌粉、副干酪乳杆菌菌粉和嗜热链球菌菌粉；
66.d、按照上述微生物组合发酵剂中的瑞士乳杆菌、副干酪乳杆菌和嗜热链球菌的活菌数的比例，将瑞士乳杆菌菌粉、副干酪乳杆菌菌粉和嗜热链球菌菌粉进行复配，得到所述微生物组合发酵剂。
67.其中，液体培养基包括以下质量百分含量的组分：葡萄糖：2.5％，酵母浸粉：1％，大豆蛋白胨：0.8％，磷酸氢二钠：0.13％，磷酸二氢钠：0.2％，硫酸镁：0.01％，抗坏血酸：0.2％，吐温80：0.06％和余量的无菌水。
68.冻干保护剂包括以下质量百分含量的组分：脱脂乳8％％、海藻糖5％、味精0.5％、蔗糖1％、甘油0.5％、抗坏血酸钠0.1％和余量的无菌水；冻干保护剂的加入量为菌泥质量的85％。
69.利用上述制备得到的微生物组合发酵剂制备酸奶，制备方法包括以下步骤：
70.s1、每升酸奶产品准备白砂糖110克、鲜奶850克，浓缩乳清粉粉2克，谷氨酸钠0.5克，微生物组合发酵剂0.01克(其中，瑞士乳杆菌活菌数3.5
×
10
10
cfu/g，副干酪乳杆菌活菌数4
×
10
10
cfu/g，嗜热链球菌5
×
109cfu/g)和余量的水；将鲜奶加热至50℃，加入白砂糖、乳清粉和谷氨酸钠，搅拌溶解后，加热至55℃，得到奶液；
71.s2、将奶液在温度为50℃、压力为20mpa下进行均质，然后在温度为94℃下巴氏消毒，消毒时间为300s，巴氏消毒完成后降温至37℃，加入微生物组合发酵剂，并在37℃下发酵15h后，发酵液的ph为3.9，酸度为114
°
t，再在发酵罐内进行搅拌破乳和翻缸冷却细化，得到的酸奶在20
±
1℃下灌装、封盖，在4℃下冷藏后熟。
72.实施例3
73.一种微生物组合发酵剂，包括以下菌株：
74.瑞士乳杆菌l551、副干酪乳杆菌l578和嗜热链球菌s56；其中，瑞士乳杆菌l551、副干酪乳杆菌l578和嗜热链球菌s56的活菌数的比例为450:200:20。
75.上述微生物组合发酵剂的制备方法包括以下步骤：
76.a、将瑞士乳杆菌l551、副干酪乳杆菌l578和嗜热链球菌s56活化后，分别加入液体培养基中45℃发酵10h，分别得到瑞士乳杆菌发酵液、副干酪乳杆菌发酵液和嗜热链球菌发酵液；
77.b、将瑞士乳杆菌发酵液、副干酪乳杆菌发酵液和嗜热链球菌发酵液分别进行离心，分离菌体，得到瑞士乳杆菌菌泥、副干酪乳杆菌菌泥和嗜热链球菌菌泥；
78.c、向瑞士乳杆菌菌泥、副干酪乳杆菌菌泥和嗜热链球菌菌泥中分别加入冻干保护剂，然后进行冷冻干燥，得到瑞士乳杆菌菌粉、副干酪乳杆菌菌粉和嗜热链球菌菌粉；
79.d、按照上述微生物组合发酵剂中的瑞士乳杆菌、副干酪乳杆菌和嗜热链球菌的活菌数的比例，将瑞士乳杆菌菌粉、副干酪乳杆菌菌粉和嗜热链球菌菌粉进行复配，得到所述微生物组合发酵剂。
80.其中，液体培养基包括以下质量百分含量的组分：葡萄糖：3.5％，酵母浸粉：2％，大豆蛋白胨：1.2％，磷酸氢二钠：0.17％，磷酸二氢钠：0.3％，硫酸镁：0.03％，抗坏血酸：0.4％，吐温80：0.08％和余量的无菌水。
81.冻干保护剂包括以下质量百分含量的组分：脱脂乳15％、海藻糖12％、味精5％、蔗
97.2.3样品前处理：将样品稀释4倍，9000转/min离心10min，过滤膜，进样。
98.2.4试验结果：
99.2.4.1标准曲线的制作
100.标准品中乙酸含量如表1所示。
101.表1
[0102][0103]
得到的标准曲线如图2所示。标准品图谱在4.7min左右出峰，如图3所示。
[0104]
2.4.2检测得到的实施例1中得到的酸奶的图谱如图4所示，将图谱中的峰面积带入乙酸含量的标准曲线公式(y＝900667x+25.246)中，计算得到乙酸的含量为0.38g/l。
[0105]
而目前的市售酸奶中在4.7min左右没有目标峰出现(如图5和图6所示)，即在此试验条件下，市售发酵剂发酵奶中检测不到乙酸。
[0106]
2.5试验结论
[0107]
用液相色谱法对实施例1发酵得到的酸奶进行乙酸的检测，乙酸含量为0.38g/l。而用同样的方法对上述两款市售发酵剂发酵酸奶进行乙酸的检测，检测结果为：两款发酵奶中均未检测到乙酸。
[0108]
3、γ氨基丁酸含量检测
[0109]
3.1菌株复配优势
[0110]
通过设置不同菌株组成的发酵剂进行酸奶的制备，制备方法同实施例1，不同的发酵剂得到的酸奶中的γ
‑
氨基丁酸含量如表2所示。
[0111]
表2
[0112]
[0113]
注：上述每组发酵剂的活菌总数与实施例1中的基本相当，且涉及菌种组合的发酵剂，菌种之间的活菌数比例与实施例1相同。
[0114]
由表2可知，实施例1中的微生物组合发酵剂中三种菌株的复配得，制得的酸奶中产γ
‑
氨基丁酸的量最多，另外，通过复配，使其在口感，风味上达到稳定状态。
[0115]
3.2对酸奶中的γ
‑
氨基丁酸含量进行液相检测分析
[0116]
对实施例1中的酸奶进行液相检测分析得到的色谱图如图7所示，计算得到的酸奶中γ
‑
氨基丁酸的含量在800ug/g。
[0117]
3.3酸度增长与γ
‑
氨基丁酸含量关系
[0118]
实施例1中的酸奶发酵过程中，添加了1.0g/l的谷氨酸钠。测定不同酸度下γ
‑
氨基丁酸的变化情况。随着发酵酸度的增长，γ
‑
氨基丁酸含量不断增加，当酸奶在酸度达到150
°
t时，γ
‑
氨基丁酸的含量达到最高。在发酵至11h左右γ
‑
氨基丁酸的增长趋于平缓，同时此时酸奶的酸甜比比较适宜消费者食用，故在11h，酸奶发酵至115
°
t左右，是高产γ
‑
氨基丁酸的合适酸度。
[0119]
3.4不同谷氨酸钠添加量对γ
‑
氨基丁酸含量影响
[0120]
利用实施例1中的微生物组合发酵剂进行鲜奶发酵试验，分别添加0.125g/l、0.25g/l、0.5g/l、1.0g/l、1.5g/l、2.0g/l、3.0g/l、5.0g/l的谷氨酸钠，发酵方法同实施例1，发酵至110
°
t终止，进行γ
‑
氨基丁酸检测，结果显示，不同l
‑
谷氨酸钠含量对γ
‑
氨基丁酸含量有一定的影响，当l
‑
谷氨酸钠含量较低时，γ
‑
氨基丁酸含量随l
‑
谷氨酸钠含量的增加而增加；当l
‑
谷氨酸钠含量达到一定值(1.5g/l)时，γ
‑
氨基丁酸含量变化较小，这可能是由于发酵液中其它因素限制了乳酸菌对l
‑
谷氨酸钠的转化。因此，选择1.5g/l为最适l
‑
谷氨酸钠添加浓度。
[0121]
3.5对实施例2和实施例3制备得到的酸奶的香气成分进行检测，其主要香气成分与实施例1相同。
[0122]
同时，对实施例2和实施例3制备得到的酸奶中的乙酸含量和γ
‑
氨基丁酸含量进行检测。经检测，实施例2制得的酸奶中的乙酸含量为0.32g/l，γ
‑
氨基丁酸的含量为500ug/g。实施例3制得的酸奶中的乙酸含量为0.35g/l，γ
‑
氨基丁酸的含量为700ug/g。
[0123]
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。