一种干细胞定向分化及细胞转分化方法与流程

本发明属于干细胞研究技术领域，具体涉及一种干细胞定向分化及细胞转分化方法。

背景技术：

目前大多数生物学家和医学家认为干细胞是来自于胚胎、胎儿或成人体内具有在一定条件下无限制自我更新与增殖分化能力的一类细胞，能够产生表现型与基因型和自己完全相同的子细胞，也能产生组成机体组织、器官的已特化的细胞，同时还能分化为祖细胞。

细胞分化(celldifferentiation)是指同一来源的细胞逐渐产生出形态结构、功能特征各不相同的细胞类群的过程，其结果是在空间上细胞产生差异，在时间上同一细胞与其从前的状态有所不同。细胞分化的本质是基因组在时间和空间上的选择性表达，通过不同基因表达的开启或关闭，最终产生标志性蛋白质。一般情况下，细胞分化过程是不可逆的。然而，在某些条件下，分化了的细胞也不稳定，其基因表达模式也可以发生可逆性变化，又回到其未分化状态，这一过程称为去分化(dedifferentiation)。

目前针对于干细胞的定向分化和转分化并没有深层次的研究，因此无法了解干细胞定向分化和转分化的方法。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是克服现有的缺陷，提供一种干细胞定向分化及细胞转分化方法，以解决上述背景技术中提出的没有对干细胞定向分化进行深层次研究的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种干细胞定向分化及细胞转分化方法，包括以下步骤：

步骤一：从年轻健康孕妇胎盘内提取胚胎组织，将胚胎组织放置在装有细胞培养液的培养皿内静置15min，静置后，将胚胎组织取出，将胚胎组织剪碎，获取胚胎母体细胞，将母体细胞放置在培养皿内继续培养；

步骤二：母体细胞分裂后，使用显微镜观察母体细胞分裂状态，并从分裂细胞内提取第二代子细胞，用膜酶消化，用培养基含高糖dmem、非必需氨基酸、10％胎牛血清、不含白血病抑制因子制成单细胞悬液，按约600个/3化l接种于培养皿盖子内表面上，将盖子翻转形成悬滴，置培养箱中37°℃培养3天，得到es细胞拟胚体的悬滴；

步骤三：将前述得到的es细胞拟胚体的悬滴转入盛有loml培养基，含高糖dmem、非必需氨基酸、10％胎牛血清、不含白血病抑制因子的培养皿内，继续悬浮培养1天，第二天加入终浓度为lt7mol/l的化合物，共培养4天，得到预分化细胞；

步骤四：提取预分化细胞，将预分化细胞设置为三组不同实验，将三组预分化细胞放置放置在三组装有培养液的培养皿内，并在培养名内分别加入浓度相同的诱导分化因子，向不同组内加入浓度范围为1-2mol/l的红细胞生成素、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子，以及生理盐水为空白对照，等待细胞分化，观察实验结果。

优选的，所述步骤二中，在母体细胞分离过程中，定期通过显微镜对母体细胞分裂过程进行观察，当细胞整体数量范围在显微镜内变化为之前的2倍时，为第二代子细胞。

优选的，所述步骤四中，干细胞分化后，通过显微镜观察分化细胞状态，在红细胞生成素和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子两种刺激因子作用下，干细胞分化为两种不同类型血细胞，并将不同刺激因子作用结果和干细胞分化结果进行记录。

与现有技术相比，本发明提供了一种干细胞定向分化及细胞转分化方法，具备以下有益效果：

本发明通过采用不同分化刺激因子对胚胎干细胞进行不同分化诱导，并通过胚胎干细胞分化结果能够对不同刺激因子定向分化结果进行探究，从而能够了解胚胎干细胞在刺激因子作用下定向分化结果，实现对胚胎干细胞体外分化情况进行深层次探究，能够了解胚胎干细胞的定向分化结果和转分化结果，以便于科研人员了解胚胎干细胞的具体分化影响因素条件。

附图说明

附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制，在附图中：

图1为本发明提出的干细胞定向分化及细胞转分化方法的系统流程图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

请参阅图1，本发明提供以下技术方案：一种干细胞定向分化及细胞转分化方法，包括以下步骤：

步骤一：从年轻健康孕妇胎盘内提取胚胎组织，将胚胎组织放置在装有细胞培养液的培养皿内静置15min，静置后，将胚胎组织取出，将胚胎组织剪碎，获取胚胎母体细胞，将母体细胞放置在培养皿内继续培养；

步骤二：母体细胞分裂后，使用显微镜观察母体细胞分裂状态，并从分裂细胞内提取第二代子细胞，用膜酶消化，用培养基含高糖dmem、非必需氨基酸、10％胎牛血清、不含白血病抑制因子制成单细胞悬液，按约600个/3化l接种于培养皿盖子内表面上，将盖子翻转形成悬滴，置培养箱中37°℃培养3天，得到es细胞拟胚体的悬滴；

步骤三：将前述得到的es细胞拟胚体的悬滴转入盛有loml培养基，含高糖dmem、非必需氨基酸、10％胎牛血清、不含白血病抑制因子的培养皿内，继续悬浮培养1天，第二天加入终浓度为lt7mol/l的化合物，共培养4天，得到预分化细胞；

步骤四：提取预分化细胞，将预分化细胞设置为三组不同实验，将三组预分化细胞放置放置在三组装有培养液的培养皿内，并在培养名内分别加入浓度相同的诱导分化因子，向不同组内加入浓度范围为1-2mol/l的红细胞生成素、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子，以及生理盐水为空白对照，等待细胞分化，观察实验结果。

本发明中，优选的，步骤二中，在母体细胞分离过程中，定期通过显微镜对母体细胞分裂过程进行观察，当细胞整体数量范围在显微镜内变化为之前的2倍时，为第二代子细胞。

本发明中，优选的，步骤四中，干细胞分化后，通过显微镜观察分化细胞状态，在红细胞生成素和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子两种刺激因子作用下，干细胞分化为两种不同类型血细胞，并将不同刺激因子作用结果和干细胞分化结果进行记录。

实施例一：

一种干细胞定向分化及细胞转分化方法，包括以下步骤：

步骤一：从年轻健康孕妇胎盘内提取胚胎组织，将胚胎组织放置在装有细胞培养液的培养皿内静置15min，静置后，将胚胎组织取出，将胚胎组织剪碎，获取胚胎母体细胞，将母体细胞放置在培养皿内继续培养；

步骤二：母体细胞分裂后，使用显微镜观察母体细胞分裂状态，并从分裂细胞内提取第二代子细胞，用膜酶消化，用培养基含高糖dmem、非必需氨基酸、10％胎牛血清、不含白血病抑制因子制成单细胞悬液，按约600个/3化l接种于培养皿盖子内表面上，将盖子翻转形成悬滴，置培养箱中37°℃培养3天，得到es细胞拟胚体的悬滴；

步骤三：将前述得到的es细胞拟胚体的悬滴转入盛有loml培养基，含高糖dmem、非必需氨基酸、10％胎牛血清、不含白血病抑制因子的培养皿内，继续悬浮培养1天，第二天加入终浓度为lt7mol/l的化合物，共培养4天，得到预分化细胞；

步骤四：提取预分化细胞，将预分化细胞设置为三组不同实验，将三组预分化细胞放置放置在三组装有培养液的培养皿内，并在培养名内分别加入浓度相同的诱导分化因子，向不同组内加入浓度范围为1-2mol/l的红细胞生成素、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子，以及生理盐水为空白对照，等待细胞分化，观察实验结果。

本发明中，优选的，步骤二中，在母体细胞分离过程中，定期通过显微镜对母体细胞分裂过程进行观察，当细胞整体数量范围在显微镜内变化为之前的2倍时，为第二代子细胞。

本发明中，优选的，步骤四中，干细胞分化后，通过显微镜观察分化细胞状态，在红细胞生成素和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子两种刺激因子作用下，干细胞分化为两种不同类型血细胞，并将不同刺激因子作用结果和干细胞分化结果进行记录。

实施例二：

一种干细胞定向分化及细胞转分化方法，包括以下步骤：

步骤一：从年轻健康孕妇胎盘内提取胚胎组织，将胚胎组织放置在装有细胞培养液的培养皿内静置15min，静置后，将胚胎组织取出，将胚胎组织剪碎，获取胚胎母体细胞，将母体细胞放置在培养皿内继续培养；

步骤二：母体细胞分裂后，使用显微镜观察母体细胞分裂状态，并从分裂细胞内提取第二代子细胞，用膜酶消化，用培养基含高糖dmem、非必需氨基酸、10％胎牛血清、不含白血病抑制因子制成单细胞悬液，按约600个/3化l接种于培养皿盖子内表面上，将盖子翻转形成悬滴，置培养箱中37°℃培养3天，得到es细胞拟胚体的悬滴；

步骤三：将前述得到的es细胞拟胚体的悬滴转入盛有loml培养基，含高糖dmem、非必需氨基酸、10％胎牛血清、不含白血病抑制因子的培养皿内，继续悬浮培养1天，第二天加入终浓度为lt7mol/l的化合物，共培养4天，得到预分化细胞；

步骤四：提取预分化细胞，将预分化细胞设置为三组不同实验，将三组预分化细胞放置放置在三组装有培养液的培养皿内，并在培养名内分别加入浓度相同的诱导分化因子，向不同组内加入浓度范围为1-2mol/l的红细胞生成素、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子，以及生理盐水为空白对照，等待细胞分化，观察实验结果。

本发明中，优选的，步骤二中，在母体细胞分离过程中，定期通过显微镜对母体细胞分裂过程进行观察，当细胞整体数量范围在显微镜内变化为之前的2倍时，为第二代子细胞。

本发明中，优选的，步骤四中，干细胞分化后，通过显微镜观察分化细胞状态，在红细胞生成素和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子两种刺激因子作用下，干细胞分化为两种不同类型血细胞，并将不同刺激因子作用结果和干细胞分化结果进行记录。

实施例三：

一种干细胞定向分化及细胞转分化方法，包括以下步骤：

步骤一：从年轻健康孕妇胎盘内提取胚胎组织，将胚胎组织放置在装有细胞培养液的培养皿内静置15min，静置后，将胚胎组织取出，将胚胎组织剪碎，获取胚胎母体细胞，将母体细胞放置在培养皿内继续培养；

步骤二：母体细胞分裂后，使用显微镜观察母体细胞分裂状态，并从分裂细胞内提取第二代子细胞，用膜酶消化，用培养基含高糖dmem、非必需氨基酸、10％胎牛血清、不含白血病抑制因子制成单细胞悬液，按约600个/3化l接种于培养皿盖子内表面上，将盖子翻转形成悬滴，置培养箱中37°℃培养3天，得到es细胞拟胚体的悬滴；

步骤三：将前述得到的es细胞拟胚体的悬滴转入盛有loml培养基，含高糖dmem、非必需氨基酸、10％胎牛血清、不含白血病抑制因子的培养皿内，继续悬浮培养1天，第二天加入终浓度为lt7mol/l的化合物，共培养4天，得到预分化细胞；

步骤四：提取预分化细胞，将预分化细胞设置为三组不同实验，将三组预分化细胞放置放置在三组装有培养液的培养皿内，并在培养名内分别加入浓度相同的诱导分化因子，向不同组内加入浓度范围为1-2mol/l的红细胞生成素、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子，以及生理盐水为空白对照，等待细胞分化，观察实验结果。

本发明中，优选的，步骤二中，在母体细胞分离过程中，定期通过显微镜对母体细胞分裂过程进行观察，当细胞整体数量范围在显微镜内变化为之前的2倍时，为第二代子细胞。

本发明中，优选的，步骤四中，干细胞分化后，通过显微镜观察分化细胞状态，在红细胞生成素和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子两种刺激因子作用下，干细胞分化为两种不同类型血细胞，并将不同刺激因子作用结果和干细胞分化结果进行记录。

综合上述多个实施例实验结果，可得知相同干细胞加入不同分化刺激因子后能够使干细胞定向分化为不同细胞。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。