一株伯克霍尔德氏菌、包括伯克霍尔德氏菌的菌剂、菌肥及制备方法和应用

本发明涉及微生物制剂
技术领域：
，尤其涉及一株伯克霍尔德氏菌、包括伯克霍尔德氏菌的菌剂、菌肥及制备方法和应用。
背景技术：
：辣椒疫病是一种毁灭性土传病害，辣椒在生长过程中的任何时期、任何部位均可患病。近年来，辣椒疫病的重病田死秧率达30％～100％。目前，辣椒疫病是阻碍辣椒稳产增产的关键因素之一。化学杀菌剂在辣椒疫病的防治中起到了至关重要的作用。但是，随着化学杀菌剂的大量和不科学使用，很多弊端日益突出，如病原菌的抗药性、对环境的污染和生态系统的破坏等，已成为当前应用化学杀菌剂的主要问题。而生防菌剂与环境兼容性好，高效、低毒、低残留，对病原菌的选择压力小，目前已成为农药研究开发领域的热门之一。微生物生物防治的核心是筛选到有效的生防菌。目前还没有关于利用伯克霍尔德氏菌防治辣椒疫霉病的记载或报道。技术实现要素：本发明的目的在于提供一株伯克霍尔德氏菌、包括伯克霍尔德氏菌的菌剂、菌肥及制备方法和应用，本发明的伯克霍尔德氏菌、包括伯克霍尔德氏菌的菌剂和菌肥能够有效有效防治辣椒疫霉病。为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：本发明提供了一株伯克霍尔德氏菌(burkholderiasp.)k2h，保藏编号为：cgmccno.22001。本发明还提供了一种包括上述方案所述伯克霍尔德氏菌的菌剂。优选的，所述菌剂中伯克霍尔德氏菌的有效活菌数为1×108～5×1010cfu/ml。本发明还提供了上述方案所述菌剂的制备方法，包括以下步骤：将所述伯克霍尔德氏菌接种于lb液体培养液，进行发酵培养，得到菌剂。优选的，所述发酵培养的条件包括：伯克霍尔德氏菌的种子液的od值为1.2，伯克霍尔德氏菌的接种量为lb液体培养液体积百分含量的5％～10％，lb液体培养液ph值为7.0，培养温度为28～30℃，摇床震荡速率为180～200rpm，培养时间60～80h。本发明还提供了一种菌肥，所述菌肥包括有机肥和上述方案所述菌剂或所述制备方法得到的菌剂。本发明还提供了上述方案所述肺炎克雷伯氏菌、所述菌剂、所述制备方法得到的菌剂或所述菌肥在防治辣椒疫病和/或促进辣椒生长中的应用。优选的，所述应用包括以下步骤：在辣椒苗期和/或成株期，施用含有所述肺炎克雷伯氏菌的菌剂或菌肥。优选的，当施用菌剂时，所述施用的方式包括灌根，每株辣椒的施用量为50～100ml菌剂，所述施用的次数为2～3次，每两次施用的间隔时间为8～12d。优选的，在辣椒苗期和成株期共施用所述菌剂2～3次。本发明的有益效果：本发明提供了一株伯克霍尔德氏菌(burkholderiasp.)k2h，保藏编号为：cgmccno.22001。本发明的伯克霍尔德氏菌k2h通过产生活性物质抑制辣椒疫霉病菌的生长，对辣椒疫病表现出较好的防治效果，抑制率最高可达90.01％。同时，其能有效在辣椒根茎叶上定殖，改善农作物微生态环境，促进辣椒生长。室内盆栽药效结果表明，k2h菌剂对辣椒病病防效为88.63％，且不易产生抗药性。应用时在辣椒幼苗期或成株期灌根使用。该菌剂也可与有机肥混合制成菌肥使用。本发明所述的菌株k2h是从植物根围土壤中获得，与土壤生态和谐相容，无毒、无致病性，因此具有良好的实际应用之价值。生物保藏说明伯克霍尔德氏菌(burkholderiasp.)k2h，于2021年03月12日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为：cgmccno.22001。附图说明图1为伯克霍尔德氏菌k2h菌落形态；图2为伯克霍尔德氏菌k2h微观结构；图3为伯克霍尔德氏菌k2h与相关种的16srdna序列系统发育树；采用mega5.0软件，邻位连接法显示k2h与相关种的16srdna序列系统发育树，进行1000次的相似度重复计算，图中发育树节点只显示bootstrap值大于50％数值，上标的“t”表示模式菌株；图4为伯克霍尔德氏菌k2h对辣椒疫霉菌丝生长的影响；注：其中a为ck，b为k2h发酵液处理；图5表示伯克霍尔德氏菌k2h在辣椒根上的定殖；图6为伯克霍尔德氏菌k2h显著促进了辣椒生长。具体实施方式本发明提供了一株伯克霍尔德氏菌(burkholderiasp.)k2h，保藏编号为：cgmccno.22001。在本发明中，所述的伯克霍尔德氏菌k2h在tsa培养基，36℃培养24h，菌落黄色，圆形，不透明，边缘整齐，菌体呈杆状，0.4～0.6μm×0.6～1.8μm，单个或成对排列，革兰氏阴性。本发明伯克霍尔德菌k2h分离自中国福建漳州龙海市郊种植的毛豆根茎交接处，与土壤生态和谐相容，有利于充分发挥菌株的优势。本发明还提供了一种包括上述方案所述伯克霍尔德氏菌的菌剂。在本发明中，所述菌剂中伯克霍尔德氏菌的有效活菌数优选为1×108～5×1010cfu/ml。本发明还提供了上述方案所述菌剂的制备方法，包括以下步骤：将所述伯克霍尔德氏菌接种于lb液体培养液，进行发酵培养，得到菌剂。在本发明中，所述发酵培养的条件优选的包括：伯克霍尔德氏菌的种子液的od值为1.2，伯克霍尔德氏菌的接种量为lb液体培养液体积百分含量的5％～10％，lb液体培养液ph值为7.0，培养的温度为28～30℃，摇床震荡速率为180～200rpm，培养的时间60～80h。在本发明中，所述培养的时间优选为72h。本发明还提供了一种菌肥，所述菌肥包括有机肥和上述方案所述菌剂或所述制备方法得到的菌剂。在本发明中，所述有机肥优选的包括农业废弃物有机肥和/或畜禽粪便有机肥；所述菌剂和所述有机肥的质量比优选为(5～10)：1000，进一步优选为8：1000。本发明所述菌肥是将有机肥和菌剂混合后得到，本发明对所述混合的方式没有特殊要求，以混合均匀为准。本发明还提供了上述方案所述肺炎克雷伯氏菌、所述菌剂、所述制备方法得到的菌剂或所述菌肥在防治辣椒疫病和/或促进辣椒生长中的应用。在本发明中，所述优选的应用包括以下步骤：在辣椒苗期和/或成株期，施用含有所述肺炎克雷伯氏菌的菌剂或菌肥。在本发明中，当施用菌剂时，所述施用的方式包括灌根，每株辣椒的施用量为50～100ml菌剂，所述施用的次数为2～3次，进一步优选的，在辣椒苗期和成株期共施用所述菌剂2～3次。每两次施用的间隔时间为8～12d，进一步优选为10d。在本发明中，当施用菌肥时，所述菌肥的施用方式优选为穴施，每株辣椒的菌肥施用量为1～1.5斤/株，所述施用的次数优选为2次，进一步优选为在辣椒苗期和成株期各施用一次。下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例1伯克霍尔德氏菌k2h菌株的分离、筛选及鉴定菌株的分离供试材料：采自中国福建漳州龙海市郊种植的毛豆根茎交接处。取毛豆根茎交接处，在超净工作台上先用75％酒精浸泡30s，无菌水冲洗3次，再用0.1％升汞浸泡1min，75％酒精浸泡30s，无菌水冲洗5次。称取1g表面灭菌的组织块浸于l0ml磷酸盐缓冲液在无菌的研钵中研碎后静置5min，取上清液用无菌水做10倍梯度稀释，分别取原液和稀释液100μl涂布lb培养基平板，在28℃培养2～3d至长出单菌落。菌落长出后，在lb培养基平板上用划线法进行菌种纯化。二、菌株的鉴定(一)菌株形态特征菌落形态特征观察(参见图1和图2)：tsa培养基，36℃培养24h，菌落黄色，圆形，不透明，边缘整齐，菌体呈杆状，0.4～0.6μm×0.6～1.8μm，单个或成对排列，革兰氏阴性。(二)菌株16srdna序列分析菌k2h的16srdna序列分析：利用细菌16s通用引物27f(agagtttgatcctggctcag，如seqidno：1所示)和1492r(ggttaccttgttacgactt，如seqidno：2所示)扩增细菌的16srdna基因。pcr反应程序为：94℃、3min预变性，然后进行94℃、55s，50℃、50s，72℃、1min，35个循环，最后72℃、l0minpcr扩增产物进行1.2％琼脂糖凝胶电泳检测。pcr产物回收以后克隆到t载体上，选择阳性克隆送上海生工生物工程公司测序，测序结果在genbank登录和比对分析。实验结果表明，菌株k2h的16srdna片段为1371bp，blast比对结果显示与大部分burkholderia菌株的16srdna序列同源性达99％以上。因此，综合菌株的菌落形态、16srdna序列分析等分析(采用mega5.0软件，邻位连接法显示k2h与相关种的16srdna序列系统发育树参见图3)，将本发明菌株鉴定为伯克霍尔德氏菌属(burkholderiasp.)，菌株编号为k2h，同时将该菌株保藏为伯克霍尔德氏菌(burkholderiasp.)cgmccno.22001，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。16srdna区段的核苷酸序列如seqidno：3所示，具体为：实施例2生防伯克霍尔德氏菌k2h菌剂的制备将4℃保存的伯克霍尔德氏菌k2h在lb平板培养基上活化，28℃下培养24h即可得到活化菌株。用接种环挑取活化菌株k2h接种于100ml的lb培养液中，28℃，220rpm下培养24h，制备种子液。按照体积分数为5％的接种量将伯克霍尔德氏菌k2h种子液(伯克霍尔德氏菌k2h种子液的od值为1.2)接种到lb液体培养液中，28℃，180rpm下培养72h即可获得生防菌发酵液，即为生防菌菌剂，发酵所得菌剂的活菌总浓度为8×108～5×1010cfu/ml。实施例3生防伯克霍尔德氏菌k2h拮抗测定采用平板对峙培养法，将菌株k2h对辣椒疫霉菌作拮抗测定，首先在pda培养基平板中央接入辣椒疫霉菌丝块，待辣椒疫霉菌菌落长至3cm时，在菌落4周点接上菌株k2h，28℃下培养5天后测量菌株k2h对辣椒疫霉菌的抑菌带宽度，实验结果参见图4，图4结构显示菌株k2h对辣椒疫霉菌具有较好的拮抗作用，抑制率达到90.00％。实施例4生防伯克霍尔德氏菌k2h发酵液对辣椒疫病的盆栽防效辣椒品种为甜椒，实验地为常年辣椒疫病发生地。待播种出苗后7～10d，每株苗浇灌50mlk2h菌株发酵液(8×108cfu/ml)，开花期再浇灌一次100ml菌株发酵液。以50％安克可湿性粉剂800倍液(购自于天津市汉邦植物保护剂有限责任公司)灌根处理作为农药对照，以发酵培养基和清水处理的植株作为空白对照。每个处理10株苗，每处理3次重复。待发病后每天调查发病情况，统计发病率和病情指数，直至清水对照发病率达到80％以上时结束实验。病情分级标准如下：0级：接种部位无变化或稍变褐；1级：接种部位产生病斑，病斑面积占茎部面积的1/4以下；3级：接种部位病斑面积占茎部总面积的1/4～1/2左右；5级：接种部位病斑占茎部面积的1/2以上；7级：接种部位病斑连片，已形成绕茎现象，但植株并没萎蔫或枯死；9级：植株萎蔫或枯死。病情指数(％)＝[∑(各级病株数×该病级值)/(调查总株数×最高级值)]×100％防治效果(％)＝[(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数]×100％(对照指清水对照处理)。实验结果参见图5、图6和表1，图5表示伯克霍尔德氏菌k2h在辣椒根上的定殖；图6为伯克霍尔德氏菌k2h显著促进了辣椒生长，图6中前排辣椒苗为ck2(发酵培养基)处理，后排辣椒苗为伯克霍尔德氏菌k2h处理。表1表明，供试放线菌k2h发酵液能够显著降低辣椒疫病的病情指数，防治效果高达89.21％，高于化学农药50％安克可湿性粉剂800倍液的防治效果80.81％。另外从表1中还可以看出，发酵培养基处理的病情指数略低于清水对照处理的病情指数，但两者差异不显著。温室盆栽实验结果说明，k2h菌株能够有效防治辣椒疫病，展现出良好的应用潜力。表1生防伯克霍尔德氏菌k2h发酵液对辣椒疫病的盆栽防效结果处理病情指数％防治效果％k2h发酵液11.27±2.18c89.21％ck1(50％安克可湿性粉剂800倍液)16.56±3.21b80.81％ck2(发酵培养基)80.23±2.12a--ck3(清水)81.25％±2.25a--以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。序列表<110>福建省农业科学院植物保护研究所<120>一株伯克霍尔德氏菌、包括伯克霍尔德氏菌的菌剂、菌肥及制备方法和应用<160>3<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1agagtttgatcctggctcag20<210>2<211>19<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2ggttaccttgttacgactt19<210>3<211>1369<212>dna<213>伯克霍尔德氏菌(burkholderiasp.)<400>3cagcacgggtgcttgcacctggtggcgagtggcgaacgggtgagtaatacatcggaacat60gtcctgtagtgggggatagcccggcgaaagccggattaataccgcatacgatctacggat120gaaagcgggggaccttcgggcctcgcgctatagggttggccgatggctgattagctagtt180ggtggggtaaaggcctaccaaggcgacgatcagtagctggtctgagaggacgaccagcca240cactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtggggaattttggaca300atgggcgaaagcctgatccagcaatgccgcgtgtgtgaagaaggccttcgggttgtaaag360cacttttgtccggaaagaaatccttggctctaatacagtcgggggatgacggtaccggaa420gaataagcaccggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtagggtgcaagcgtta480atcggaattactgggcgtaaagcgtgcgcaggcggtttgctaagaccgatgtgaaatccc540cgggctcaacctgggaactgcattggtgactggcaggctagagtatggcagaggggggta600gaattccacgtgtagcagtgaaatgcgtagagatgtggaggaataccgatggcgaaggca660gccccctgggccaatactgacgctcatgcacgaaagcgtggggagcaaacaggattagat720accctggtagtccacgccctaaacgatgtcaactagttgttggggattcatttccttagt780aacgtagctaacgcgtgaagttgaccgcctggggagtacggtcgcaagattaaaactcaa840aggaattgacggggacccgcacaagcggtggatgatgtggattaattcgatgcaacgcga900aaaaccttacctacccttgacatggtcggaatcctgctgagaggtgggagtgctcgaaag960agaaccggcgcacaggtgctgcatggctgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggtta1020agtcccgcaacgagcgcaacccttgtccttagttgctacgcaagagcactctaaggagac1080tgccggtgacaaaccggaggaaggtggggatgacgtcaagtcctcatggcccttatgggt1140agggcttcacacgtcatacaatggtcggaacagagggttgccaacccgcgagggggagct1200aatcccagaaaaccgatcgtagtccggattgcactctgcaactcgagtgcatgaagctgg1260aatcgctagtaatcgcggatcagcatgccgcggtgaatacgttcccgggtcttgtacaca1320ccgcccgtcacaccatgggagtgggttttaccagaagtggctagtctaa1369当前第1页12