一种CD276基因人源化的非人动物及其构建方法和应用与流程

一种cd276基因人源化的非人动物及其构建方法和应用
技术领域
1.本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及人源化改造的转基因非人动物，尤其是人源化改造的转基因啮齿类动物，例如转基因小鼠。更具体的，涉及包含人cd276基因序列的转基因小鼠，其构建方法和用途。


背景技术：

2.cd276，又被称为b7
‑
h3、b7rp
‑
2，为i型跨膜蛋白，属于b7家族。该家族成员还包括：b7.1、b7.2、icos
‑
l、pd
‑
l1、pd
‑
l2、b7
‑
h4，以及随后发现的b7
‑
h6、vista、b7
‑
h7。b7家族成员在抗原递呈细胞均有表达，包括树突状细胞、巨噬细胞以及b细胞；与b7.1仅局限表达于淋巴细胞不同，cd276在多种正常的组织也有表达，表达量较低；但其表达受多种细胞因子调控，例如，ifn
‑
γ可以上调cd276的表达，il4会降低其表达。b7家族成员与不同的受体结合可以起到共刺激或抑制作用，如与b7
‑
cd28结合起到激活作用，而与b7
‑
ctla4结合起到抑制作用，早期的研究认为cd276促进t细胞的正向调节，但后续的研究发现cd276在t细胞免疫中发挥共抑制作用，即cd276同时具有共刺激和共抑制的双重免疫作用。
3.随着研究深入，cd276被发现在多种肿瘤中大量表达，如：前列腺癌、乳腺癌、结肠癌、肺癌、胃癌等，促进肿瘤的生长、转移、耐药，与患者预后及疾病进展密切相关。有研究发现cd276分子有膜型和可溶性两种形式，可溶性cd276分子由基质金属蛋白酶从活化的t细胞、单核细胞、dc细胞表面剪切形成，在正常的人外周血中可以检测到。可溶性cd276可以激活nf
‑
κb信号通路增强胰腺癌细胞的侵袭和转移能力；此外，非小细胞肺癌患者胸腔积液中的可溶性cd276含量明显高于健康人水平，可作为相关肿瘤诊断和预后判断的指标。目前，至少有三种cd276单克隆抗体已经进入到临床阶段，omburtamab单抗在实体瘤临床试验中表现出较好的安全性和有效性，有效地延长了患者的生存期，已经进入临床3期；enoblituzumab进入临床2期，1期临床显示没有剂量相关毒性，以及免疫相关副作用，对抑制肿瘤有效；mgc
‑
018是一种adc(antibody
‑
drug conjugate)药物，也已经进入临床2期。
4.实验动物疾病模型对于研究人类疾病发生的病因、发病机制、开发防治技术和开发药物是不可缺少的研究工具。但由于动物与人类的生理结构和代谢系统本身的差异，传统的动物模型并不能很好的反映人体的真实状况，在动物体内建立更接近人类的生理特征的疾病模型是生物医药行业的迫切需求。目前，尚未有cd276基因人源化非人动物的报道。


技术实现要素：

5.实施方案1，一种人源化cd276蛋白，所述的人源化cd276蛋白包含人cd276蛋白的全部或部分。
6.实施方案2，如实施方案1所述的人源化cd276蛋白，所述的人源化cd276蛋白包含人cd276蛋白的信号肽、跨膜区、胞质区和/或胞外区的全部或部分，优选的，所述的人源化cd276蛋白包含人cd276蛋白胞外区的全部或部分，其中，所述的人cd276蛋白胞外区的部分包含至少200、250、300或350个氨基酸，优选的，所述的人源化cd276蛋白包含人cd276基因
的2号至10号外显子编码的氨基酸序列的全部或部分，进一步优选的，包含3号至6号外显子编码的氨基酸序列的全部或部分。
7.实施方案3，如实施方案1或2所述的人源化cd276蛋白，所述的人源化cd276蛋白包括选自下列组中的一种：
8.a)seq id no：4或seq id no：12所示氨基酸序列的全部或部分；
9.b)与seq id no：4或seq id no：12所示氨基酸序列全部或部分的同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
10.c)与seq id no：4或seq id no：12所示氨基酸序列的全部或部分差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；
11.d)与seq id no：4或seq id no：12所示的氨基酸序列的全部或部分，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列；
12.任选地，所述seq id no：4所示氨基酸序列的部分为seq id no：4的第34
‑
417位、seq id no：4第32
‑
456位、或者seq id no：4的第30
‑
459位。
13.实施方案4，一种人源化cd276基因，所述的人源化cd276基因包含人cd276基因的部分，
14.任选地，所述的人源化cd276基因编码实施方案1
‑
3任一所述的人源化cd276蛋白。
15.实施方案5，如实施方案4所述的人源化cd276基因，所述的人源化cd276基因包含人cd276基因的1号至10号外显子的全部或部分；进一步优选的，包含3号至7号外显子的全部或部分；再进一步优选的，包含3号外显子至6号外显子编码的氨基酸序列的全部或部分。
16.实施方案6，如实施方案4或5所述的人源化cd276基因，所述的人源化cd276基因包含下列组中的一种：
17.(a)为seq id no：5所示核苷酸序列的全部或部分；
18.(b)与seq id no：5所示核苷酸序列的同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
19.(c)与seq id no：5所示核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或
20.(d)具有seq id no：5所示核苷酸序列的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
21.实施方案7，如实施方案4
‑
6任一所述的人源化cd276基因，所述的人源化cd276基因转录的mrna选自下列组中的一种：
22.(i)为seq id no：13所示核苷酸序列的全部或部分；
23.(ii)与seq id no：13所示核苷酸序列的同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
24.(iii)与seq id no：13所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或
25.(iv)与seq id no：13所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
26.实施方案8，如实施方案4
‑
7任一所述的人源化cd276基因，所述的人源化cd276基
因包含编码人cd276蛋白的cdna。
27.实施方案9，如实施方案4
‑
8任一所述的人源化cd276基因，所述的人源化cd276基因还包含人cd276非编码区，
28.任选地，所述的人源化cd276基因中人的cd276是纯合或者杂合。
29.实施方案10，一种cd276靶向载体，所述的cd276靶向载体包含供体dna序列，所述的供体dna序列包含人cd276基因的部分，优选的，所述的供体dna序列包含人cd276基因的2号至10号外显子的全部或部分；再进一步优选的，包含3号外显子至6号外显子的全部或部分，更进一步优选的，供体dna序列包含与seq id no：5具有至少60％、65％、70％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的核苷酸序列、包含seq id no：5或与seq id no：5所述核苷酸序列一致。
30.实施方案11，如实施方案10所述的靶向载体，所述的供体dna序列包含编码人cd276蛋白的cdna的至少部分。
31.实施方案12，如实施方案10或11所述的靶向载体，所述的靶向载体还包含人cd276非编码区。
32.实施方案13，如实施方案10
‑
12任一所述的cd276靶向载体，所述的cd276靶向载体还包含5’臂，其选自非人动物cd276基因基因组dna的100
‑
10000个长度的核苷酸；优选的，所述的5’臂与ncbi登录号为nc_000075.6至少具有90％同源性的核苷酸；进一步优选的，所述5’臂序列与seq id no：6至少具有90％同源性，或者如seq id no：6所示；和/或，所述的cd276靶向载体还包含3’臂，其选自非人动物cd276基因基因组dna的100
‑
10000个长度的核苷酸；优选的，所述的3’臂与ncbi登录号为nc_000075.6至少具有90％同源性的核苷酸；进一步优选的，所述的3’臂序列与seq id no：7至少具有90％同源性，或者如seq id no：7所示。
33.实施方案14，一种cd276基因人源化的非人动物的构建方法，所述的构建方法包括用包含人cd276核苷酸序列的部分导入非人动物cd276基因座，所述的非人动物体内表达人或人源化cd276蛋白。
34.实施方案15，如实施方案14所述的构建方法，所述的人源化cd276蛋白如权利要求1
‑
3任一所述的人源化cd276蛋白。
35.实施方案16，如实施方案14或15所述的构建方法，所述的非人动物的基因组中还包含人或人源化cd276基因，所述的人源化cd276基因如实施方案4
‑
9任一所述的人源化cd276基因。
36.实施方案17，如实施方案14
‑
16任一所述的构建方法，所述的导入的人cd276基因的部分包含人cd276基因的2号至10号外显子的全部或部分核苷酸序列；更进一步优选的，包含3号至7号外显子的全部或部分核苷酸序列；再进一步优选的，包含3号外显子的部分、4号至5号外显子的全部和6号外显子的部分核苷酸序列，其中3号外显子的部分包含编码胞外区的核苷酸序列。
37.实施方案18，如实施方案14
‑
17任一所述的构建方法，所述的构建方法包括将人cd276基因的部分导入非人动物3号至4号外显子。
38.实施方案19，如实施方案14
‑
18任一所述的构建方法，使用实施方案12
‑
15任一所述的cd276靶向载体进行非人动物的构建。
39.实施方案20，如实施方案14
‑
19任一所述的构建方法，所述非人动物为至少包含人或人源化pd
‑
l1、pd
‑
1、cd28、ctla4、il4、csf1、il34、ccr2、cd40、cxcr4和vegf基因中至少一种的人源化的非人动物；优选的，所述非人动物为包含人或人源化pd
‑
1与cd276基因修饰的非人动物。
40.实施方案21，一种包含人源化cd276基因人源化改造的细胞、组织或者器官，所述的细胞、组织或者器官包含实施方案4
‑
9任一所述的人源化cd276基因，所述的细胞、组织或者器官表达实施方案1
‑
3任一所述的人源化cd276蛋白。
41.实施方案22，一种表达实施方案1
‑
3任一所述的人源化cd276蛋白或包含实施方案4
‑
9任一所述的人源化cd276基因的构建体。
42.实施方案23，根据实施方案1
‑
3任一所述的人源化cd276蛋白、实施方案4
‑
9任一所述的人源化cd276基因、实施方案10
‑
13任一所述的cd276靶向载体、实施方案14
‑
20任一所述的构建方法获得的非人动物，实施方案21所述的细胞、组织或者器官或者实施方案22所述的构建体，所述的非人动物为非人哺乳动物；优选的，所述的非人哺乳动物为啮齿类动物；进一步优选的，所述的啮齿类动物为小鼠或大鼠。
43.实施方案24，来源于实施方案1
‑
3任一所述的人源化cd276蛋白、实施方案4
‑
9任一所述的人源化cd276基因、实施方案14
‑
20任一所述的构建方法获得的非人动物、实施方案21所述的细胞、组织或者器官、实施方案22所述的构建体在需要涉及人类细胞的免疫过程的产品开发，制造抗体，或者作为药理学、免疫学、微生物学、医学研究的模型系统中的应用；或者在生产和利用动物实验疾病模型，用于开发新的诊断策略和/或治疗策略中的应用；或者在筛选、验证、评价或研究cd276通路功能、人cd276通路信号机理、靶向人cd276的抗体、靶向人的药物、药效，免疫相关疾病药物以及抗肿瘤或抗炎症药物，筛选和评估人用药及药效研究方面的应用。
44.本发明的第一方面，提供了一种人源化cd276蛋白，所述的人源化cd276蛋白包含人cd276蛋白的全部或部分。
45.优选的，所述的人源化cd276蛋白包含人cd276蛋白的信号肽、跨膜区、胞质区和/或胞外区的全部或部分。
46.进一步优选的，所述的人源化cd276蛋白包含人cd276蛋白胞外区的全部或部分。
47.在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化cd276蛋白还包含非人动物cd276蛋白的部分，优选为非人动物cd276蛋白的信号肽、跨膜区和/或胞质区。
48.在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化cd276蛋白包含信号肽、跨膜区、胞质区和胞外区，其中，胞外区包含人cd276蛋白胞外区的全部或部分，其中，所述的人cd276蛋白胞外区的部分包含至少200、250、300或350个氨基酸，例如至少200、220、250、270、300、320、350、360、370、380、381、382、383、384、385、390、400、410、420、421、422、423、424、425、430、438个氨基酸的与人cd276蛋白胞外区一致，进一步优选的，包含384个氨基酸的人cd276蛋白胞外区。
49.为保证人源化cd276蛋白既包含结合抗人cd276抗体的抗原表位，又不影响人源化cd276蛋白包含的其他区域的正常功能。故对于胞外区，优选部分片段来源于人cd276蛋白胞外区，胞外区的n端和/或c端至少1
‑
10个氨基酸来源于非人动物。进一步优选的，胞外区包含与seq id no：4的第34
‑
417位、第32
‑
456位、或者第30
‑
459位具有至少60％、65％、
70％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的氨基酸序列。
50.优选的，来源于人的cd276还可以包括seq id no：4的第34
‑
417位两端向外延伸的与非人动物相同氨基酸残基的序列，所述相同氨基酸残基可以来自胞外区和/或信号肽，例如包括seq id no：4的第32
‑
456位、或者第30
‑
459位的胞外区，也可以包括seq id no：4的第26
‑
459位的胞外区和信号肽。
51.更为优选的，胞外区包含与seq id no：4的第34
‑
417位、第32
‑
456位、或者第30
‑
459位具有至少60％同一性的氨基酸序列，并且所述氨基酸序列为由不同于seq id no：3的其他的人类cd276 mrna翻译的胞外区，最为优选的，胞外区来源于人cd276的序列包含seq id no：4的第34
‑
417位、第32
‑
456位、或者第30
‑
459位所示氨基酸序列，或者胞外区来源于人cd276的序列如seq id no：4的第34
‑
417位、第32
‑
456位、或者第30
‑
459位所示；信号肽、跨膜区和胞质区来源于非人动物。
52.优选的，所述的人源化cd276蛋白包含人cd276基因的2号至10号外显子编码的氨基酸序列的全部或部分。进一步优选的，包含2号至10号外显子中的任一种、两种、三种以上、连续两种或连续三种以上外显子的组合编码的氨基酸序列的全部或部分。更进一步优选的，包含3号至7号外显子编码的氨基酸序列的全部或部分，再进一步优选的，包含3号外显子至6号外显子的全部和7号外显子的部分编码的氨基酸序列的全部或部分，再进一步优选的，包含3号外显子的部分、4号至5号外显子的全部和6号外显子的部分编码的氨基酸序列的全部或部分，其中3号外显子的部分包含编码胞外区的核苷酸序列，优选至少包含3号外显子中编码末尾1
‑
10个氨基酸的核苷酸序列，更优选的，至少包含3号外显子中编码末尾1
‑
20个氨基酸的核苷酸序列，进一步优选的，3号外显子的部分不包含编码至少前2个氨基酸的核苷酸序列；3号外显子的部分至少包含20bp的核苷酸序列，例如至少包含20、50、70、100、150、200、220、250、270、300、310、315、316、317、318、319、320、324、330、333、335、339bp的核苷酸序列，进一步优选的，包含319bp的核苷酸序列；6号外显子的部分包含编码胞外区的核苷酸序列，优选至少包含6号外显子中编码第1至第10个氨基酸的核苷酸序列，更优选至少包含6号外显子中编码第1至第20个氨基酸的核苷酸序列；6号外显子的部分至少包含20bp的核苷酸序列，例如至少包含20、50、70、100、150、160、170、175、176、177、178、179、180、190、200、220、250、270、290、297bp的核苷酸序列，进一步优选的，包含179bp的核苷酸序列。
53.优选的，所述的人源化cd276蛋白还包含非人动物cd276基因编码的氨基酸序列的全部或部分，优选为非人动物cd276基因第2号、和第5
‑
8号外显子编码的信号肽、跨膜区和胞质区，更优选还包括第3号、4号和5号外显子编码的部分胞外区。
54.在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化cd276蛋白选自下列组中的一种：
55.a)所述人源化cd276蛋白中来源于人cd276蛋白的氨基酸序列为seq id no：4所示氨基酸序列的全部或部分；
56.b)所述人源化cd276蛋白中来源于人cd276蛋白的氨基酸序列与seq id no：4所示氨基酸序列同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
57.c)所述人源化cd276蛋白中来源于人cd276蛋白的氨基酸序列与seq id no：4所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或
58.d)所述人源化cd276蛋白中来源于人cd276蛋白的氨基酸序列与seq id no：4所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。
59.任选地，所述seq id no：4所示氨基酸序列的部分为seq id no：4的第34
‑
417位、seq id no：4第32
‑
456位、或者seq id no：4的第30
‑
459位。
60.在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化cd276蛋白的氨基酸序列包含下列组中的一种：
61.a)为seq id no：4第34
‑
417位、第32
‑
456位、或者第30
‑
459位氨基酸序列的全部或部分；
62.b)与seq id no：4的第34
‑
417位、第32
‑
456位、或者第30
‑
459位氨基酸序列同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
63.c)与seq id no：4的第34
‑
417位、第32
‑
456位、或者第30
‑
459位所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或
64.d)与seq id no：4的第34
‑
417位、第32
‑
456位、或者第30
‑
459位所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。
65.在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化cd276蛋白选自下列组中的一种：
66.i)为seq id no：12氨基酸序列的全部或部分；
67.ii)与seq id no：12氨基酸序列同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
68.iii)与seq id no：12所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或
69.iv)与seq id no：12所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。
70.本发明的第二方面，提供了一种人源化cd276基因，所述的人源化cd276基因包含人cd276基因的部分。
71.优选的，所述的人源化cd276基因包含编码人cd276蛋白的信号肽、胞外区、跨膜区和/或胞质区的全部或部分核苷酸序列。进一步优选的，包含编码人cd276蛋白胞外区的全部或部分核苷酸序列。更进一步优选的，包含编码人cd276蛋白胞外区的部分核苷酸序列，编码胞外区n端和/或c端至少1
‑
10个氨基酸的核苷酸序列来源于非人动物，其中，所述的人cd276蛋白胞外区的部分包含至少200、250、300或350个氨基酸，例如至少200、220、250、270、300、320、350、360、370、380、381、382、383、384、385、390、400、410、420、421、422、423、424、425、430、438个氨基酸的与人cd276蛋白胞外区一致，进一步优选的，包含384个氨基酸的人cd276蛋白胞外区。最为优选的，编码胞外区的核苷酸序列包含编码与seq id no：4的第34
‑
417位、第32
‑
456位、或者第30
‑
459位具有至少60％、65％、70％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的氨基酸序列，更优选的，所述编码胞外区的核苷酸序列包含编码与seq id no：4的第34
‑
417位、第32
‑
456位、或者第30
‑
459位具有至少60％同一性的氨基酸序列，并且来源于不同于seq id no：3的其他的人类转录本，最为优选的，所述编码胞外区的核苷酸序列包含编码seq id no：4的第34
‑
417位、第32
‑
456位、或者第30
‑
459位或者如seq id no：4的第34
‑
417位、第32
‑
456位、或者第30
‑
459位所示氨基酸序列的核苷酸序列。
72.优选的，所述的人源化cd276基因包含编码人cd276胞外区的核苷酸序列以及非人动物cd276信号肽、胞质区和跨膜区的核苷酸序列。进一步优选的，所述的人源化cd276基因编码上述的人源化cd276蛋白。
73.优选的，所述的人源化cd276基因包含人cd276基因的1号至10号外显子的全部或部分。进一步优选的，包含1号至10号外显子中的任一种、两种、三种以上、连续两种或连续三种以上外显子的组合的全部或部分。更进一步优选的，包含3号至7号外显子的全部或部分。再进一步优选的，包含3号外显子至6号外显子的全部和7号外显子的部分编码的氨基酸序列的全部或部分，再进一步优选的，包含3号外显子的部分、4号至5号外显子的全部和6号外显子的部分，其中3号外显子的部分包含编码胞外区的核苷酸序列，优选至少包含3号外显子中编码末尾1
‑
10个优选为1
‑
20个氨基酸的核苷酸序列，进一步优选的，3号外显子的部分不包含编码至少前2个氨基酸的核苷酸序列；3号外显子的部分至少包含20bp的核苷酸序列，例如至少包含20、50、70、100、150、200、220、250、270、300、310、315、316、317、318、319、320、330、335、339bp的核苷酸序列，进一步优选的，包含319bp的核苷酸序列；6号外显子的部分包含编码胞外区的核苷酸序列，优选至少包含6号外显子中编码第1至第10个，优选为1
‑
20个氨基酸的核苷酸序列，更优选至少包含6号外显子中编码第1至10，第1
‑
20，第1
‑
30，第1
‑
40，第1
‑
50，第1
‑
60个氨基酸的核苷酸序列；6号外显子的部分至少包含20bp的核苷酸序列，例如至少包含20、50、70、100、150、160、170、175、176、177、178、179、180、190、200、220、250、270、290、297bp的核苷酸序列，进一步优选的，包含179bp的核苷酸序列。
74.优选的，所述的人源化cd276基因还包含非人动物cd276基因第2号外显子、5号至8号外显子，进一步还包含3号、4号和5号外显子部分编码胞外区至少1个氨基酸残基的核苷酸序列。
75.在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化cd276基因选自下列任一组：
76.(a)所述人源化cd276基因中来源于人cd276基因的核苷酸序列为seq id no：3所示核苷酸序列的全部或部分；
77.(b)所述人源化cd276基因中来源于人cd276基因的核苷酸序列与seq id no：3所示核苷酸序列同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
78.(c)所述人源化cd276基因中来源于人cd276基因的核苷酸序列与seq id no：3所示核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或
79.(d)所述人源化cd276基因中来源于人cd276基因的核苷酸序列与seq id no：3所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸残基的核苷酸序列。
80.在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化cd276基因包含下列组中的一种：
81.(a)为seq id no：5所示核苷酸序列的全部或部分；
82.(b)与seq id no：5所示核苷酸序列的同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
83.(c)与seq id no：5所示核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或
84.(d)具有seq id no：5所示核苷酸序列的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
85.在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化cd276基因转录的mrna选自下列组中的一种：
86.(i)为seq id no：13所示核苷酸序列的全部或部分；
87.(ii)与seq id no：13所示核苷酸序列的同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
88.(iii)与seq id no：13所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或
89.(iv)与seq id no：13所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
90.优选的，所述的人源化cd276基因包含编码人cd276蛋白的cdna。
91.优选的，所述的人源化cd276基因包含人3号至6号外显子的cdna序列。
92.优选的，所述的人源化cd276基因还包含人cd276非编码区。
93.任选地，所述的人源化cd276基因中人的cd276是纯合或者杂合。
94.优选的，所述的人源化cd276基因还包括特异性诱导物或阻遏物。进一步优选的，所述的特异性诱导物或阻遏物可以为常规诱导或阻遏的物质。
95.在本发明的一个具体实施方式中，所述的特异性诱导物选自四环素系统(tet
‑
off system/tet
‑
on system)或他莫昔芬系统(tamoxifen system)。
96.本发明的第三方面，提供了一种cd276靶向载体，所述的cd276靶向载体包含供体dna序列，所述的供体dna序列包含人cd276基因的部分。
97.优选的，所述的供体dna序列包含人cd276基因的1号至10号外显子的全部或部分。进一步优选的，包含2号至10号外显子中的任一种、两种、三种以上、连续两种或连续三种以上外显子的组合的全部或部分。更进一步优选的，包含3号至7号外显子的全部或部分；再进一步优选的，包含3号外显子至6号外显子的全部和7号外显子的部分，更进一步优选的，包含编码胞外区的全部或部分核苷酸序列。再进一步优选的，包含3号外显子的部分、4号至5号外显子的全部和6号外显子的部分，其中3号外显子的部分包含编码胞外区的核苷酸序列，优选至少包含3号外显子中编码末尾1
‑
10个氨基酸的核苷酸序列，进一步优选的，3号外显子的部分不包含编码至少前2个氨基酸的核苷酸序列，所述至少前2个氨基酸，例如前2个、3个、4个、6个、7个、8个9个、10个、12个、14个、16个、18个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、59个；3号外显子的部分至少包含20bp的核苷酸序列，例如至少包含20、50、70、100、150、200、220、250、270、300、310、315、316、317、318、319、320、330、335、339bp的核苷酸序列，进一步优选的，包含319bp的核苷酸序列；6号外显子的部分包含编码胞外区的核苷酸序列，优选至少包含6号外显子中编码第1至第10个氨基酸的核苷酸序列；6号外显子的部分至少包含20bp的核苷酸序列，例如至少包含20、50、70、100、150、160、170、175、176、177、178、179、180、190、200、220、250、270、290、297bp的核苷酸序列，进一步优选的，包含179bp的核苷酸序列；更进一步优选的，供体dna序列包含与seq id no：5具有至少60％、65％、70％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的核苷酸序列、包含seq id no：5或与seq id no：5所述核苷酸序列一致。
98.优选的，所述的cd276靶向载体包含编码人cd276蛋白的cdna。
99.优选的，所述的cd276靶向载体包含人3号至6号外显子的cdna序列。
100.优选的，所述的cd276靶向载体还包含人cd276非编码区。
101.优选的，所述的cd276靶向载体还包含与待改变的转换区5’端同源的dna片段，即5’臂(5’同源臂)，其选自非人动物cd276基因基因组dna的100
‑
10000个长度的核苷酸。进一步优选的，所述的5’臂与ncbi登录号为nc_000075.6至少具有90％同源性的核苷酸。最为优选的，所述5’臂序列与seq id no：6至少具有90％同源性，或者如seq id no：6所示。
102.优选的，所述的cd276靶向载体还包含与待改变的转换区3’端同源的dna片段，即3’臂(3’同源臂)，其选自非人动物cd276基因基因组dna的100
‑
10000个长度的核苷酸。进一步优选的，所述的3’臂与ncbi登录号为nc_000075.6至少具有90％同源性的核苷酸。最为优选的，所述的3’臂序列与seq id no：7至少具有90％同源性，或者如seq id no：7所示。
103.优选的，所述的cd276靶向载体的待改变的转换区位于非人动物cd276基因座上。进一步优选的，所述的待改变的转换区位于非人动物cd276基因的1号至8号外显子上。再进一步优选的，所述的待改变的转换区位于非人动物cd276基因的3号至5号外显子上。最为优选的，所述的待改变的转换区位于非人动物cd276基因的3号至4号外显子上。
104.优选的，所述的cd276靶向载体还包含标记基因。进一步优选的，所述标记基因为负筛选标记的编码基因。更进一步优选的，所述负筛选标记的编码基因为白喉毒素a亚基的编码基因(dta)。
105.在本发明的一个具体实施方式中，所述的靶向载体中还包括阳性克隆筛选的抗性基因。进一步优选的，所述阳性克隆筛选的抗性基因为新霉素磷酸转移酶编码序列neo。
106.在本发明的一个具体实施方式中，所述的靶向载体中还包括特异性重组系统。进一步优选的，所述特异性重组系统为frt重组位点(也可选择常规的loxp重组系统)。所述的特异性重组系统为具有两个frt重组位点，分别连接在抗性基因的两侧。
107.本发明的第四方面，提供了靶向cd276基因的sgrna，所述的sgrna靶向非人动物cd276基因，同时所述sgrna的序列在待改变的cd276基因上的靶序列上。
108.优选的，所述sgrna的靶位点位于cd276基因的1号外显子至10号外显子序列上。
109.优选的，所述sgrna的靶位点位于cd276基因的1
‑
2号内含子至9
‑
10号内含子序列上。
110.优选的，所述sgrna的靶位点位于cd276基因的1
‑
2号内含子至2
‑
3号内含子和/或5
‑
6号内含子至6
‑
7号内含子上。
111.本发明的第五方面，提供了一种编码上述sgrna的dna分子。
112.优选的，所述的dna分子的双链为sgrna的上下游序列，或者加入酶切位点后的正向寡核苷酸序列或反向寡核苷酸序列。
113.本发明的第六方面，提供了一种包含上述sgrna或者上述dna分子的sgrna载体。
114.本发明的第七方面，提供了一种包含上述cd276靶向载体、上述靶向cd276基因的sgrna、dna分子和/或sgrna载体的细胞。
115.本发明的第八方面，提供了上述cd276靶向载体、上述靶向cd276基因的sgrna，或者上述的细胞在cd276基因修饰中的应用。优选的，所述的应用包括但不限于敲除、插入或替换。
116.本发明的第九方面，提供了一种cd276基因人源化的非人动物，所述的非人动物体内表达人或人源化cd276蛋白。
117.优选的，所述的非人动物的内源cd276蛋白表达降低或缺失。
118.优选的，所述的非人动物体内表达上述的人源化cd276蛋白。
119.优选的，所述的非人动物体内包含人cd276基因的部分，优选包含上述的人源化cd276基因。
120.优选的，所述的人cd276基因的部分或者人源化cd276基因的核苷酸序列可操作的连接至非人动物内源调控元件。
121.本发明的第十方面，提供了一种cd276基因人源化的非人动物的构建方法，所述的非人动物体内表达人或人源化cd276蛋白。
122.优选的，所述的人源化cd276蛋白如上述的人源化cd276蛋白。
123.优选的，所述的非人动物的基因组中还包含人或人源化cd276基因，所述的人源化cd276基因如上述的人源化cd276基因。
124.优选的，所述的非人动物选自上述的cd276基因人源化的非人动物。
125.优选的，所述的人cd276基因的部分或人源化cd276基因在非人动物体内通过内源或外源调控元件进行调控。进一步优选的，所述的调控元件为启动子。
126.优选的，包括用包含编码人cd276蛋白的核苷酸序列导入非人动物cd276基因座。进一步优选的，用包含编码人cd276蛋白胞外区的全部或部分核苷酸序列导入非人动物cd276基因座。更进一步优选的，所述部分核苷酸序列编码的胞外区不包含来自人的胞外区n端和/或c端至少1
‑
10个氨基酸残基。更为优选的，用包含编码seq id no：4的第34
‑
417位、第32
‑
456位、或者第30
‑
459位的核苷酸序列导入非人动物cd276基因座上，最为优选的，用包含编码seq id no：4的第34
‑
417位、第32
‑
456位、或者第30
‑
459位的核苷酸序列分别导入编码小鼠seq id no：2的第34
‑
199位、第32
‑
238位或者第30
‑
241位的核苷酸序列。
127.优选的，包括用包含人cd276基因的部分核苷酸序列导入非人动物cd276基因座。进一步优选的，用包含人cd276基因的2号至10号外显子的部分核苷酸序列导入非人动物cd276基因座上。更进一步优选的，用包含2号至10号外显子中的任一种、两种、三种以上、连续两种或连续三种以上外显子的组合的部分核苷酸序列导入非人动物cd276基因座。再进一步优选的，用包含3号至7号外显子的全部或部分核苷酸序列导入非人动物cd276基因座上。再进一步优选的，包含3号外显子至6号外显子的全部和7号外显子的部分编码的氨基酸序列的全部或部分。最为优选的，用包含3号外显子的部分、4号至5号外显子的全部和6号外显子的部分核苷酸序列导入非人动物cd276基因座，其中3号外显子的部分包含编码胞外区的核苷酸序列，优选至少包含3号外显子中编码末尾1
‑
10，1
‑
20个优选为1
‑
40、1
‑
80或1
‑
100个氨基酸的核苷酸序列，更优选的，至少包含3号外显子中编码末尾1
‑
100个氨基酸的核苷酸序列，进一步优选的，3号外显子的部分不包含编码至少前2个氨基酸的核苷酸序列，3号外显子的部分至少包含20bp的核苷酸序列，例如至少包含20、50、70、100、150、200、220、250、270、300、310、315、316、317、318、319、320、330、335、339bp的核苷酸序列，进一步优选的，包含319bp的核苷酸序列；6号外显子的部分包含编码胞外区的核苷酸序列，优选至少包含6号外显子中编码第1
‑
10个，1
‑
20，1
‑
30，1
‑
40，1
‑
50，1
‑
60个氨基酸的核苷酸序列，更优选至少包含6号外显子中编码第1至第60个氨基酸的核苷酸序列，6号外显子的部分至少包含20bp的核苷酸序列，例如至少包含20、50、70、100、150、160、170、175、176、177、178、179、180、190、200、220、250、270、290、297bp的核苷酸序列，进一步优选的，包含179bp的核苷酸
序列。
128.优选的，所述的构建方法包括将人cd276基因的部分导入非人动物3号至4号外显子。
129.在本发明的一个具体实施方式中，用包含seq id no：5所示核苷酸序列导入非人动物cd276基因座。
130.在本发明的一个具体实施方式中，用包含编码人cd276蛋白的cdna序列导入非人动物cd276基因座。
131.在本发明的一个具体实施方式中，用包含编码人源化cd276蛋白的核苷酸序列导入非人动物cd276基因座。
132.在本发明的一个具体实施方式中，用包含人源化cd276基因的核苷酸序列导入非人动物cd276基因座。
133.优选的，本技术中所述的导入包括但不限于插入、替换或转基因，所述的替换优选为原位替换。
134.优选的，所述的插入或替换的位点为cd276基因的内源调控元件之后。
135.优选的，所述的插入为首先破坏非人动物内源cd276基因的编码框，随后进行插入操作。或者所述的插入步骤即可给内源cd276基因造成移码突变又可以实现插入人源序列的步骤。
136.进一步优选的，可在插入序列中加入辅助序列(例如终止密码子等)或其他方法(例如，翻转序列，或敲除序列)使得插入位点后的非人动物内源cd276蛋白不能正常表达。
137.优选的，所述的非人动物是纯合或者杂合的。
138.优选的，所述非人动物的基因组中至少一个染色体上包含人源化cd276基因。
139.优选的，所述的非人动物中至少一个细胞表达人或人源化cd276蛋白。
140.优选的，使用基因编辑技术进行非人动物的构建，所述的基因编辑技术包括利用胚胎干细胞的基因打靶技术、规律成簇间隔短回文重复(crispr/cas9)技术、锌指核酸酶(zfn)技术、转录激活子样效应因子核酸酶(talen)技术、归巢核酸内切酶(兆碱基大范围核酶)或其他分子生物学技术。
141.优选的，使用cd276靶向载体进行非人动物的构建，其中，所述的cd276靶向载体包含供体dna序列，所述的供体dna序列包含人cd276基因的部分。优选的，包含人cd276基因的2号至10号外显子的全部或部分。进一步优选的，包含2号至10号外显子中的任一种、两种、三种以上、连续两种或连续三种以上外显子的组合的全部或部分。再进一步优选的，包含3号外显子至6号外显子的全部和7号外显子的部分，更进一步优选的，包含3号外显子的部分、4号至5号外显子的全部和6号外显子的部分，其中3号外显子的部分包含编码胞外区的核苷酸序列，优选至少包含3号外显子中编码末尾1
‑
10个氨基酸的核苷酸序列，进一步优选的，3号外显子的部分不包含编码至少前2个氨基酸的核苷酸序列；3号外显子的部分至少包含20bp的核苷酸序列，例如至少包含20、50、70、100、150、200、220、250、270、300、310、315、316、317、318、319、320、330、335、339bp的核苷酸序列，进一步优选的，包含319bp的核苷酸序列；6号外显子的部分包含编码胞外区的核苷酸序列，优选至少包含6号外显子中编码第1至第10个氨基酸的核苷酸序列；6号外显子的部分至少包含20bp的核苷酸序列，例如至少包含20、50、70、100、150、160、170、175、176、177、178、179、180、190、200、220、250、270、290、
297bp的核苷酸序列，进一步优选的，包含179bp的核苷酸序列；更进一步优选的，供体dna序列包含与seq id no：5具有至少60％、65％、70％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的核苷酸序列、包含seq id no：5或与seq id no：5所述核苷酸序列一致。
142.在本发明的一个具体实施方式中，包含与seq id no：5具有至少60％、65％、70％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的核苷酸序列、包含seq id no：5或与seq id no：5所述核苷酸序列一致。
143.优选的，所述的cd276靶向载体还包含与待改变的转换区5’端同源的dna片段，即5’臂，其选自非人动物cd276基因基因组dna的100
‑
10000个长度的核苷酸；优选的，所述的5’臂与ncbi登录号为nc_000075.6至少具有90％同源性的核苷酸；进一步优选的，所述5’臂序列与seq id no：6至少具有90％同源性，或者如seq id no：6所示；和/或，所述的cd276靶向载体还包含与待改变的转换区3’端同源的dna片段，即3’臂，其选自非人动物cd276基因基因组dna的100
‑
10000个长度的核苷酸；优选的，所述的3’臂与ncbi登录号为nc_000075.6至少具有90％同源性的核苷酸；进一步优选的，所述的3’臂序列与seq id no：7至少具有90％同源性，或者如seq id no：7所示。
144.优选的，使用sgrna进行非人动物的构建。其中，所述的sgrna靶向非人动物cd276基因，同时所述sgrna的序列在待改变的cd276基因上的靶序列上。
145.优选的，所述sgrna的靶位点位于cd276基因的1号外显子至10号外显子序列上。
146.优选的，所述sgrna的靶位点位于cd276基因的1
‑
2号内含子至9
‑
10号内含子序列上。
147.优选的，所述sgrna的靶位点位于cd276基因的1
‑
2号内含子至2
‑
3号内含子和/或5
‑
6号内含子至6
‑
7号内含子上。
148.本发明的第十一方面，提供了一种cd276基因敲除的非人动物，所述的非人动物缺失cd276基因的全部或部分核苷酸序列。
149.优选的，所述的非人动物缺失cd276基因的1号至10号外显子的全部或部分核苷酸序列。进一步优选的，缺失3号至7号外显子的核苷酸序列。再进一步优选的，缺失3号至6号外显子的核苷酸序列。最为优选的，缺失编码胞外区的核苷酸序列。
150.本发明的第十二方面，提供了一种cd276基因敲除的非人动物的构建方法，包括采用sgrna进行非人动物的构建。优选的，所述的sgrna靶向非人动物cd276基因，同时所述sgrna的序列在待改变的cd276基因上的靶序列上。
151.优选的，所述sgrna的靶位点位于cd276基因的1号外显子至10号外显子序列上。
152.优选的，所述sgrna的靶位点位于cd276基因的1
‑
2号内含子至9
‑
10号内含子序列上。
153.优选的，所述sgrna的靶位点位于cd276基因的1
‑
2号内含子至2
‑
3号内含子和/或5
‑
6号内含子至6
‑
7号内含子上。
154.本发明的第十三方面，提供了一种多基因修饰的非人动物的构建方法，包括如下步骤：
155.(一)提供上述的cd276基因人源化的非人动物、上述的构建方法获得cd276基因人源化的非人动物；
156.(二)将步骤(一)提供的非人动物与其他基因修饰的非人动物交配、体外受精或直
接进行基因编辑，并进行筛选，得到多基因修饰的非人动物。
157.优选的，所述的其他基因修饰的非人动物为至少包含人或人源化pd
‑
l1、pd
‑
1、cd28、ctla4、il4、csf1、il34、ccr2、cd40、cxcr4和vegf基因中至少一种的人源化的非人动物。进一步优选的，所述的多基因修饰的非人动物为包含人或人源化pd
‑
1与cd276基因修饰的非人动物。
158.优选的，所述的多基因修饰的非人动物为双基因人源化非人动物、三基因人源化非人动物、四基因人源化非人动物、五基因人源化非人动物、六基因人源化非人动物、七基因人源化非人动物、八基因人源化非人动物或九基因人源化非人动物。
159.优选的，所述的多基因修饰的非人动物的基因组中人源化的多个基因中的每一个基因均可以是纯合或杂合的。
160.本发明的第十四方面，提供了一种上述的构建方法获得的非人动物或其子代。
161.本发明的第十五方面，提供了一种动物模型，所述的动物模型来源于上述的非人动物、上述的构建方法获得的非人动物，或者，上述的非人动物或其子代。优选的，所述的动物模型为荷瘤或炎症动物模型。
162.本发明的第十六方面，提供了一种动物模型的制备方法，所述的制备方法包括构建上述的cd276基因人源化的非人动物，cd276基因敲除的非人动物，或者多基因修饰的非人动物或其子代的步骤。优选的，还包括植入肿瘤细胞的步骤。优选的，所述的动物模型为荷瘤或炎症动物模型。
163.本发明的第十七方面，提供了上述的cd276基因人源化的非人动物，cd276基因敲除的非人动物，或者多基因修饰的非人动物或其子代在制备动物模型中的应用。优选的，所述的动物模型为荷瘤或炎症动物模型。
164.本发明的第十八方面，提供了一种细胞或细胞系或原代细胞培养物，所述细胞或细胞系或原代细胞培养物来源于上述的非人动物、上述的构建方法获得的非人动物、上述的非人动物或其子代或者上述的动物模型。优选的，所述的细胞或细胞系或原代细胞培养物不能发育为动物个体。
165.本发明的第十九方面，提供了一种组织或器官或其培养物，所述组织或器官或其培养物来源于上述的非人动物、上述的构建方法获得的非人动物、上述的非人动物或其子代或者上述的动物模型。优选的，所述的组织或器官或其培养物不能发育为动物个体。
166.本发明的第二十方面，提供了一种荷瘤后的瘤组织，所述的瘤组织来源于上述的非人动物、上述的构建方法获得的非人动物、上述的非人动物或其子代或者上述的动物模型。优选的，所述的荷瘤后的瘤组织不能发育为动物个体。
167.本发明的第二十一方面，提供了一种cd276基因人源化的细胞，所述的细胞表达人或人源化cd276蛋白；优选的，所述的细胞表达上述的人源化cd276蛋白。
168.优选的，所述细胞中内源cd276蛋白表达降低或缺失。
169.优选的，所述的细胞的基因组中包含人cd276。优选的，所述的细胞包含上述的人源化cd276基因。
170.优选的，所述的细胞不能发育为动物个体。
171.本发明的第二十二方面，提供了一种cd276基因敲除的细胞，所述的细胞缺失cd276基因的全部或部分。
172.优选的，缺失cd276基因的1号至10号外显子的全部或部分。进一步优选的，缺失cd276基因的3号至7号外显子的全部或部分。更进一步优选的，缺失cd276基因的3号至6外显子的全部或部分。最为优选的，缺失编码胞外区的核苷酸序列。
173.优选的，所述的细胞不能发育为动物个体。
174.本发明的第二十三方面，提供了一种表达上述的人源化cd276蛋白的构建体。优选的，所述的构建体包含上述的人源化cd276基因。
175.本发明的第二十四方面，提供了一种包含上述构建体的细胞。优选的，所述的细胞不能发育为动物个体。
176.本发明的第二十五方面，提供了一种包含上述细胞的组织。优选的，所述的组织不能发育为动物个体。
177.本发明的第二十六方面，提供了来源于上述的人源化cd276蛋白、上述的人源化cd276基因、上述的非人动物、上述的构建方法获得的非人动物、上述的非人动物或其子代、上述的动物模型、上述的细胞或细胞系或原代细胞培养物、上述的组织或器官或其培养物、上述的荷瘤后的瘤组织、上述的细胞、上述的构建体、上述的细胞或上述的组织在需要涉及人类细胞的免疫过程的产品开发，制造抗体，或者作为药理学、免疫学、微生物学、医学研究的模型系统中的应用；或者在生产和利用动物实验疾病模型，用于开发新的诊断策略和/或治疗策略中的应用；或者在筛选、验证、评价或研究cd276通路功能、人cd276通路信号机理、靶向人的抗体、靶向人的药物、药效，免疫相关疾病药物以及抗肿瘤或抗炎症药物，筛选和评估人用药及药效研究方面的应用。
178.优选的，在制备治疗肿瘤、病毒感染、炎症、自身免疫缺陷、过敏、移植排斥反应等的药物中的应用。
179.优选的，所述应用不是疾病的治疗和/或诊断方法。
180.本发明的第二十七方面，提供了一种人cd276特异性调节剂的筛选方法，所述的筛选方法包括向植入肿瘤细胞的个体施加调节剂，检测肿瘤抑制性；其中，所述的个体选自上述的非人动物、上述的构建方法获得的非人动物、上述的非人动物或其子代或者上述的荷瘤或炎症模型。
181.优选的，所述的调节剂选自car
‑
t、药物。进一步优选的，所述的药物为抗体。
182.优选的，所述的调节剂为单抗或双特异性抗体或两种及两种以上药物的联合使用。
183.优选的，所述检测包括测定肿瘤细胞的大小和/或增殖速率。
184.优选的，所述检测的方法包括游标卡尺测量、流式细胞检测和/或动物活体成像检测。
185.优选的，所述的检测包括评估个体体重、脂肪量、活化途径、神经保护活性或代谢变化，所述的代谢变化包括食物消耗或水消耗的变化。
186.优选的，所述的肿瘤细胞来源于人或非人动物。
187.优选的，所述人cd276特异性调节剂的筛选方法不是治疗方法。该方法用来筛选或评价药物，对候选药物的药效进行检测和比较，以确定哪些候选药物可以作为药物，哪些不能作为药物，或者，比较不同药物的药效敏感程度，即治疗效果不是必然的，只是一种可能性。
188.本发明的第二十八方面，提供了一种干预方案的评价方法，所述的评价方法包括向个体植入肿瘤细胞，向植入肿瘤细胞的个体施加干预方案，对施加干预方案后的个体进行肿瘤抑制效果检测和评价；其中，所述的个体选自上述的非人动物，上述的构建方法获得的非人动物，上述的非人动物或其子代，或者上述的动物模型。
189.优选的，所述的干预方案选自car
‑
t、药物治疗。进一步优选的，所述的药物为抗原结合蛋白。所述的抗体结合蛋白为抗体。
190.优选的，所述的肿瘤细胞来源于人或非人动物。
191.优选的，所述干预方案的评价方法不是治疗方法。该评价方法对干预方案的效果进行检测和评价，以确定该干预方案是否有治疗效果，即治疗效果不是必然的，只是一种可能性。
192.本发明的第二十九方面，提供了一种来源于上述的非人动物、上述的构建方法获得的非人动物、上述的非人动物或其子代、上述的动物模型在制备人cd276特异性调节剂中的用途。
193.本发明的第三十方面，提供了一种来源于上述的非人动物、上述的构建方法获得的非人动物、上述的非人动物或其子代、上述的动物模型在制备治疗肿瘤、炎症或自身免疫疾病的药物中的用途。
194.本发明所述的cd276基因人源化的非人动物，其体内可正常表达人或人源化cd276蛋白，可用于针对人cd276通路靶位点的药物筛选、药效评估、免疫疾病、炎症和肿瘤治疗，可以加快新药研发过程、节约时间和成本。
195.优选的，上述的非人动物可以选自啮齿类动物、猪、兔子、猴子等任何可以进行基因编辑制备基因人源化的非人动物。
196.优选的，上述的非人动物为非人哺乳动物。进一步优选的，所述的非人哺乳动物为啮齿类动物。更进一步优选的，所述的啮齿类动物为大鼠或小鼠。
197.优选的，所述的非人动物是免疫缺陷的非人哺乳动物。进一步优选的，所述的免疫缺陷的非人哺乳动物为免疫缺陷的啮齿类动物、免疫缺陷的猪、免疫缺陷的兔子或免疫缺陷的猴子。更进一步优选的，所述的免疫缺陷的啮齿类动物为免疫缺陷的小鼠或大鼠。最为优选的，所述免疫缺陷鼠是nod
‑
prkdc
scid il
‑
2rγ
null
小鼠、nod
‑
rag 1
‑
/
‑
‑
il2rg
‑
/
‑
(nrg)小鼠、rag 2
‑
/
‑
‑
il2rg
‑
/
‑
(rg)小鼠、nod/scid小鼠或者裸鼠。
198.本发明所述的“免疫相关疾病”包括但不限于过敏、哮喘、心肌炎、肾炎、肝炎、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、硬皮病、甲状腺功能亢进、原发性血小板减少性紫癜、自身免疫性溶血性贫血、溃疡性结肠炎、自身免疫性肝病、糖尿病、疼痛或神经障碍等。
199.本发明所述的“炎症”包括急性炎症，也包括慢性炎症。具体的，包括但不限于变质性炎症、渗出性炎症(浆液性炎、纤维素性炎、化脓性炎、出血性炎、坏死性炎、卡他性炎)、增生性炎症、特异性炎症(结核、梅毒、麻疯、淋巴肉芽肿等)。
200.本发明所述的“肿瘤”包括但不限于淋巴瘤、非小细胞肺癌、白血病、卵巢癌、鼻咽癌、乳腺癌、子宫内膜癌、结肠癌、直肠癌、胃癌、膀胱癌、肺癌、支气管癌、骨癌、前列腺癌、胰腺癌、肝和胆管癌、食管癌、肾癌、甲状腺癌、头颈部癌、睾丸癌、胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、黑色素瘤、骨髓增生异常综合征、以及肉瘤。其中，所述的白血病选自急性淋巴细胞性(成淋巴细胞性)白血病、急性骨髓性白血病、髓性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、多发性骨髓
瘤、浆细胞白血病、以及慢性骨髓性白血病；所述淋巴瘤选自霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤，包括b细胞淋巴瘤、弥漫性大b细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区b细胞淋巴瘤、t细胞淋巴瘤、和瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症；所述肉瘤选自骨肉瘤、尤文肉瘤、平滑肌肉瘤、滑膜肉瘤、软组织肉瘤、血管肉瘤、脂肪肉瘤、纤维肉瘤、横纹肌肉瘤、以及软骨肉瘤。
201.本发明所述的“全部或部分”，“全部”为整体，“部分”为整体中的局部，或者组成整体的个体。
202.本发明所述的“人源化xxx蛋白”，包含来源于人xxx蛋白的部分和非人xxx蛋白的部分。例如人源化cd276蛋白。
203.其中，所述的“人源化cd276蛋白”包含连续或间隔的1
‑
480个氨基酸序列与人cd276蛋白的氨基酸序列一致，优选为连续或间隔1
‑
480个或其中的任何一个数值与人cd276蛋白的氨基酸序列一致。
204.本发明所述的“人源化xxx基因”，包含来源于人xxx基因的部分和非人xxx基因的部分。例如人源化cd276基因。
205.其中，所述的“人源化cd276基因”包含连续或间隔的20bp
‑
30kb个核苷酸序列与人cd276基因的核苷酸序列一致，优选为连续或间隔的100
‑
3295个，或其中的任何一个数值个核苷酸序列与人cd276基因的核苷酸序列一致。
206.本发明所述的“xx号至xxx号外显子”或“xx号至xxx号外显子的全部”包含外显子及其期间的内含子的核苷酸序列，例如所述的“1号至4号外显子”包含1号外显子、1
‑
2号内含子、2号外显子、2
‑
3号内含子、3号外显子、3
‑
4号内含子和4号外显子的全部核苷酸序列。
207.本发明所述的“x
‑
xx号内含子”表示x号外显子与xx号外显子之间的内含子。例如“1
‑
2号内含子”表示1号外显子与2号外显子之间的内含子。
208.本发明所述的“基因座”广义上讲代表基因在染色体上所占的位置，狭义上讲代表某一基因上的一段dna片段，即可以是一个基因也可以是一个基因的一部分。例如所述的“cd276基因座”表示cd276基因1号至10号外显子上的任选一段的dna片段。在本发明的一个具体实施方式中，被替换的cd276基因座可以是cd276基因1号至10号外显子上的任选一段的dna片段。
209.本发明所述的“核苷酸序列”包含天然的或经过修饰的核糖核苷酸序列、脱氧核糖核苷酸序列。优选为dna、cdna、pre
‑
mrna、mrna、rrna、hnrna、mirnas、scrna、snrna、sirna、sgrna、trna。
210.本发明所述的“三个以上”包括但不限于三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个等。
211.本发明所述的“连续三个以上”包括但不限于连续三个、连续四个、连续五个、连续六个、连续七个、连续八个、连续九个或连续十个等。其中“1号至10号外显子的连续三个以上”包括连续三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个外显子，还包括期间的内含子核苷酸序列。
212.本发明所述“治疗(treating)”(或“治疗(treat)”或“治疗(treatment)”)表示减缓、中断、阻止、控制、停止、减轻、或逆转一种体征、症状、失调、病症、或疾病的进展或严重性，但不一定涉及所有疾病相关体征、症状、病症、或失调的完全消除。术语“治疗
(treating)”等是指在疾病已开始发展后改善疾病或病理状态的体征、症状等等的治疗干预。
213.本发明所述“同源性”，是指在使用氨基酸序列或核苷酸序列的方面，本领域技术人员在保证与已知序列相似结构或功能的前提下，可以根据实际工作需要对序列进行调整，使使用序列与现有技术获得的序列相比，具有(包括但不限于)1％，2％，3％，4％，5％，6％，7％，8％，9％，10％，11％，12％，13％，14％，15％，16％，17％，18％，19％，20％，21％，22％，23％，24％，25％，26％，27％，28％，29％，30％，31％，32％，33％，34％，35％，36％，37％，38％，39％，40％，41％，42％，43％，44％，45％，46％，47％，48％，49％，50％，51％，52％，53％，54％，55％，56％，57％，58％，59％，60％，70％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，99.1％，99.2％，99.3％，99.4％，99.5％，99.6％，99.7％，99.8％，99.9％的同一性。
214.本领域的技术人员能够确定并比较序列元件或同一性程度，以区分另外的小鼠和人序列。
215.在一个方面，所述非人动物是哺乳动物。在一个方面，所述非人动物是小型哺乳动物，例如跳鼠科。在一个实施方式中，所述人源化非人动物是啮齿动物。在一个实施方式中，所述啮齿动物选自小鼠、大鼠和仓鼠。在一个实施方式中，所述啮齿动物选自鼠家族。在一个实施方式中，所述基因修饰的动物来自选自丽仓鼠科(例如小鼠样仓鼠)、仓鼠科(例如仓鼠、新世界大鼠和小鼠、田鼠)、鼠总科(真小鼠和大鼠、沙鼠、刺毛鼠、冠毛大鼠)、马岛鼠科(登山小鼠、岩小鼠、有尾大鼠、马达加斯加大鼠和小鼠)、刺睡鼠科(例如多刺睡鼠)和鼹形鼠科(例如摩尔大鼠、竹大鼠和鼢鼠)家族。在一个特定实施方式中，所述基因修饰的啮齿动物选自真小鼠或大鼠(鼠总科)、沙鼠、刺毛鼠和冠毛大鼠。在一个实施方式中，所述基因修饰的小鼠来自鼠科家族成员。在一个实施方式中，所述动物是啮齿动物。在一个特定实施方式中，所述啮齿动物选自小鼠和大鼠。在一个实施方式中，所述非人动物是小鼠。
216.在一个特定实施方式中，所述非人动物是啮齿动物，其为选自balb/c、a、a/he、a/j、a/wysn、akr、akr/a、akr/j、akr/n、ta1、ta2、rf、swr、c3h、c57br、sjl、c57l、dba/2、km、nih、icr、cfw、faca、c57bl/a、c57bl/an、c57bl/grfa、c57bl/kalwn、c57bl/6、c57bl/6j、c57bl/6byj、c57bl/6nj、c57bl/10、c57bl/10scsn、c57bl/10cr和c57bl/ola的c57bl、c58、cba/br、cba/ca、cba/j、cba/st、cba/h品系的小鼠。
217.除非特别说明，本发明的实践将采取细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组dna和免疫学的传统技术。这些技术在以下文献中进行了详细的解释。例如：molecular cloning a laboratory manual，2nded.，ed.by sambrook，fritschandmaniatis(cold spring harbor laboratory press：1989)；dna cloning，volumes i and ii(d.n.glovered.，1985)；oligonucleotide synthesis(m.j.gaited.，1984)；mullisetal.u.s.pat.no.4，683，195；nucleic acid hybridization(b.d.hames&s.j.higginseds.1984)；transcription and translation(b.d.hames&s.j.higginseds.1984)；culture of animal cells(r.i.freshney，alanr.liss，inc.，1987)；immobilized cells and enzymes(irl press，1986)；b.perbal，a practical guide to molecular cloning(1984)；the series，methods in enzymology(j.abelson and m.simon，eds.inchief，academic press，inc.，new york)，specifically，
vols.154and 155(wuetal.eds.)and vol.185，
″
gene expression technology
″
(d.goeddel，ed.)；gene transfer vectors for mammalian cells(j.h.miller and m.p.caloseds.，1987，cold spring harbor laboratory)；immunochemical methods in cell and molecular biology(mayer and walker，eds.，academic press，london，1987)；handbook of experimental immunology，volumes v(d.m.weir and c.c.blackwell，eds.，1986)；and manipulating the mouse embryo，(cold spring harbor laboratory press，cold spring harbor，n.y.，1986)。
附图说明
218.以下，结合附图来详细说明本发明的实施例，其中：
219.图1：鼠cd276基因座和人cd276基因座对比示意图(非按比例)；
220.图2：cd276基因人源化小鼠基因座示意图(非按比例)；
221.图3：cd276(b7h3)基因打靶策略及cd276靶向载体设计示意图；
222.图4：采用neo探针进行southern blot鉴定的结果图，其中，wt为野生型c57bl/6小鼠，d01，d02，d03，d04，d05，d05，d07，d08，d09为克隆编号；
223.图5：去除阳性克隆筛选标记基因策略示意图；
224.图6：cd276基因人源化小鼠f1代鼠尾pcr鉴定结果，其中，f1
‑
1、f1
‑
2、f1
‑
3为f1代小鼠编号，wt为野生型小鼠，m为marker，pc为未去neo的阳性克隆细胞，h2o为水对照，图(a)为使用引物对cd276
‑
wt
‑
f和cd276
‑
wt
‑
r扩增小鼠内源的野生型cd276基因片段；图(b)为使用引物对cd276
‑
wt
‑
f和cd276
‑
mut
‑
r扩增修饰后的cd276基因片段，用以验证cd276靶向载体是否正确插入小鼠基因组位点；图(c)为使用引物对cd276
‑
frt
‑
f和cd276
‑
frt
‑
r扩增neo片段，用以验证抗性基因是否去除；
225.图7：rt
‑
pcr检测结果，其中，+/+为野生型c57bl/6小鼠，h/h为cd276人源化纯合子小鼠，gapdh为内参对照；
226.图8：将小鼠结肠癌细胞mc38
‑
hcd276植入人源化cd276小鼠体内，利用enoblituzumab抗体进行抗肿瘤药效试验后小鼠的体重，各组实验动物平均体重无显著差异；
227.图9：将小鼠结肠癌细胞mc38
‑
hcd276植入人源化cd276小鼠体内，利用enoblituzumab抗体进行抗肿瘤药效试验后小鼠体重变化，各组实验动物平均体重无显著差异；
228.图10：将小鼠结肠癌细胞mc38
‑
hcd276植入人源化cd276小鼠体内，用enoblituzumab抗体进行抗肿瘤药效试验，治疗组实验动物肿瘤平均体积呈现明显差异，且g2治疗组实验动物肿瘤平均体积明显小于g1对照组；
229.图11：小鼠和人cd276蛋白比对结果；
230.图12：将小鼠结肠癌细胞mc38
‑
hcd276植入人源化cd276小鼠体内，用抗鼠pd
‑
1抗体、enoblituzumab联用进行肿瘤药效试验，g1
‑
g4各组实验动物平均体重无明显差异；
231.图13；将小鼠结肠癌细胞mc38
‑
hcd276植入人源化cd276小鼠体内，用抗鼠pd
‑
1抗体、enoblituzumab联用进行肿瘤药效试验，g1
‑
g4各组实验动物平均体重变化无明显差异；
232.图14：将小鼠结肠癌细胞mc38
‑
hcd276植入人源化cd276小鼠体内，用抗鼠pd
‑
1抗
体、enoblituzumab联用进行肿瘤药效试验，与g1组相比，g2
‑
g4各组小鼠肿瘤平均体积明显小于对照组。
233.图15：野生型c57bl/6小鼠和cd276人源化纯合子小鼠(b7
‑
h3)脾脏中白细胞亚型检测结果；
234.图16：野生型c57bl/6小鼠和cd276人源化纯合子小鼠(b7
‑
h3)脾脏中t细胞亚型检测结果；
235.图17：野生型c57bl/6小鼠和cd276人源化纯合子小鼠(b7
‑
h3)淋巴结中白细胞亚型检测结果；
236.图18：野生型c57bl/6小鼠和cd276人源化纯合子小鼠(b7
‑
h3)淋巴结中t细胞亚型检测结果；
237.图19：野生型c57bl/6小鼠和cd276人源化纯合子小鼠(b7
‑
h3)外周血中白细胞亚型检测结果；
238.图20：野生型c57bl/6小鼠和cd276人源化纯合子小鼠(b7
‑
h3)外周血中t细胞亚型检测结果。
具体实施方式
239.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的部分实施例，而不是全部。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
240.在下述实施例中，设备和材料是从以下所指出的几家公司获得：
241.mfei、ndei、hindiii厂家neb，货号分别为r3589v、r0111v、r3104v；
242.lipopolysaccharides from escherichia coli o111:b4购自sigma，货号：l2630；
243.attune nxt acoustic focusing cytometer购自thermofisher，型号attunenxt；
244.primescript 1ststrandcdnasynthesiskit购自takara，型号6110a；
245.heraeus
tm fresco
tm 21microcentrifuge购自thermofisher，型号fresco 21；
246.enoblituzumab厂家biolegend，货号343606；
247.purified anti
‑
mouse cd16/32antibody购自biolegend，货号：101302；
248.brilliant violet 510
tm anti
‑
mouse cd45购自biolegend，货号：103138；
249.percp anti
‑
mouse ly
‑
6g/ly
‑
6c(gr
‑
1)antibody购自biolegend，货号：108426；
250.brilliant violet 421
tm anti
‑
mouse cd4购自biolegend，货号：100438；
251.fitc anti
‑
mouse f4/80购自biolegend，货号：123108；
252.pe anti
‑
mouse cd8a antibody购自biolegend，货号：100708；
253.pe/cy
tm 7mouse anti
‑
mouse nk1.1购自bd pharmingen，货号：552878；
254.apc anti
‑
mouse/rat foxp3购自ebioscience，货号：17
‑
5773
‑
82；
255.fitc anti
‑
mouse cd19购自biolegend，货号：115506；
256.percp/cy5.5 anti
‑
mouse tcrβchain购自biolegend，货号：109228；
257.apc hamster anti
‑
mouse tcrβchain购自bd pharmingen
tm
，货号：553174；
258.brilliant violet 605
tm anti
‑
mouse cd11c购自biolegend，货号：117334；
259.pe anti
‑
mouse/human cd11b购自biolegend，货号：101208。
260.实施例1 cd276基因人源化小鼠的构建
261.本实施例对小鼠进行改造，使该小鼠体内包含编码人源化cd276蛋白的核苷酸序列，得到经过修饰的小鼠可表达人源化cd276蛋白。本实施例使用的小鼠cd276及人cd276的信息如下：小鼠cd276基因(ncbi gene id:102657)位于9号染色体nc_000075.6的第58524300至58555033位，具有8个外显子，转录本nm_133983.4(序列如seq id no：1所示)及其编码蛋白np_598744.1(序列如seq id no:2所示)。人cd276基因(ncbi gene id：80381)位于15号染色体nc_000015.10第73683966至73714518位，具有10个外显子，转录本nm_001024736.2(序列如seq id no:3所示)，其编码蛋白np_001019907.1(序列如seq id no:4所示)。基因结构对比示意图如图1所示。
262.为了达到本发明的目的，在小鼠内源cd276基因座引入部分编码人cd276蛋白的核苷酸序列，得到经遗传修饰的非人动物体内可表达人或人源化cd276蛋白。具体的，通过基因编辑技术，用人cd276基因3号外显子部分序列至6号外显子部分序列替换小鼠cd276基因3号外显子部分至4号外显子部分序列，得到如图2所示的dna序列，实现对小鼠cd276基因的人源化改造。
263.打靶策略示意图如图3所示，小鼠cd276的dna来自于细菌人工染色体(bac)rp23
‑
92m21，人cd276的dna为直接合成。其中，靶向载体上含有上游同源臂(又称5’同源臂)、下游同源臂(又称3’同源臂)以及含人cd276基因序列的a片段，5’同源臂为4063bp，位于ncbi登录号为nc_000075.6的第58537588至58541650位(seq id no:6)，3’同源臂为5208bp，位于ncbi登录号为nc_000075.6的第58529690至58534897位(seq id no:7),a片段上包含人cd276基因的3号外显子部分至6号外显子部分，大小为2080bp，与ncbi登录号为nc_000015.10第73702275至73704354位相同(seq id no:5)；a片段中人dna片段上游与小鼠序列的连接设计为：
[0264]5’‑
tcacccccaggagctgtggaagtccaggtccctgaagacccagtggtggcactggtgggca
‑3’
(seq id no:8)，其中ggtc中c为小鼠最后一个核苷酸，cctg中第一个c为人第一个核苷酸。人dna片段下游与小鼠序列的连接设计为:
[0265]5’‑
actggcaacgtgaccacgtcgcagatggccaacgagcagggcttgttcgatgttcacagcgtgctgagggt
‑3’
(seq id no:9),其中gcag中第二个g为人最后一个核苷酸，ggct中第一个g为小鼠第一个核苷酸。靶向载体上还包括用于阳性克隆筛选的抗性基因，即新霉素磷酸转移酶编码序列neo，并在抗性基因的两侧装上两个同向排列的位点特异性重组系统frt重组位点，组成neo盒(neo cassette)。neo盒上游与小鼠序列的连接设计为：
[0266]
cttaaatctctggtttccaggtcagcactagttcaagtaggcaccaattgaagcttgatatcgaattccgaagttcctattctctagaaagtataggaacttca(seq id no:10)，其中gcac中第二个c为小鼠最后一个核苷酸，caat中c为neo盒第一个核苷酸。neo盒下游与小鼠的的连接设计为：
[0267]5’‑
aagttcctattctctagaaagtataggaacttcatcagtcaggtacataatggtggatcccttcagtgcttggggatctaaagagggttcaggctcacct
‑3’
(seq id no:11)，其中atcc中，第二个c为neo盒最后一个核苷酸，cttc中第一个c为小鼠第一个核苷酸。此外，还在靶向载体3’同源臂下游构建了具有负筛选标记的编码基因(白喉毒素a亚基的编码基因(dta)。改造后的人源化
小鼠cd276的mrna序列如seq id no:13，表达的蛋白序列如seq id no：12所示。
[0268]
靶向载体构建可采用常规方法进行，如酶切连接、直接合成等。构建好的靶向载体通过酶切进行初步验证后，再送测序公司进行测序验证。将测序验证正确的靶向载体电穿孔转染入c57bl/6小鼠的胚胎干细胞中，利用阳性克隆筛选标记基因对得到的细胞进行筛选，并利用pcr和southern blot技术进行检测确认外源基因的整合情况，筛选出正确的阳性克隆细胞。
[0269]
pcr使用引物es
‑
f1和es
‑
r1及es
‑
f2和es
‑
r2分别进行扩增，结果9个克隆全部为阳性克隆，编号为：d01、d02、d03、d04、d05、d06、d07、d08、和d09，将经pcr鉴定为阳性的克隆再进行southern blot(分别用mfei或ndei或hindiii消化细胞dna并使用3个探针进行杂交，探针及目的片段长度如表1所示检测，结果如图4所示，d01、d02、d03、d06、d07、d08、d09全部为阳性克隆且无随机插入，经测序进一步验证该7个克隆全部为阳性克隆。
[0270]
表1：cd276基因检测探针
[0271]
限制性内切酶探针野生型重组序列mfei5’probe18.8kb9.0kbndei3’probe8.3kb12.1kbhindiiineo probe
‑‑
8.3kb
[0272]
其中，pcr引物序列如下：
[0273]
es
‑
f1：5
’‑
gctcgactagagcttgcgga
‑3’
(seq id no:14)；
[0274]
es
‑
r1：5
’‑
tctgttcatcctctcacaggcacag
‑3’
(seq id no:15)；
[0275]
es
‑
f2：5
’‑
ctgtgtacctgaggctagaccacatg
‑3’
(seq id no:16)；
[0276]
es
‑
r2：5
’‑
agggatgcgttgccctgtgc
‑3’
(seq id no:17)；
[0277]
southern blot的探针引物序列如下：
[0278]5’
探针(5’probe)：
[0279]5’
probe
‑
f：5
’‑
ggcagcagatggggctaagatgaat
‑3’
(seq id no:18)
[0280]5’
probe
‑
r：5
’‑
cgaaagactacagagtgctttggcct
‑3’
(seq id no:19)
[0281]3’
探针(3’probe)：
[0282]3’
probe
‑
f：5
’‑
tgcgtttgggagggaaacagacatt
‑3’
(seq id no:20)
[0283]3’
probe
‑
r：5
’‑
aactgtgaggctctgaacattcggc
‑3’
(seq id no:21)
[0284]
neo探针(neo probe)：
[0285]
neoprobe
‑
f：5
’‑
ggatcggccattgaacaagat
‑3’
(seq id no:22)
[0286]
neoprobe
‑
r：5
’‑
cagaagaactcgtcaagaaggc
‑3’
(seq id no:23)
[0287]
将筛选出的正确阳性克隆细胞(黑色鼠)按照本领域已知的技术导入已分离好的囊胚中(白色鼠)，得到的嵌合囊胚转移至培养液中短暂培养后移植至受体母鼠(白色鼠)的输卵管，可生产f0代嵌合体鼠(黑白相间)。将f0代嵌合鼠与野生型鼠回交获得f1代鼠，再将f1代杂合小鼠互相交配即可获得f2代纯合子鼠。还可将阳性鼠与flp工具鼠交配去除阳性克隆筛选标记基因(该过程示意图见图5)后，再通过互相交配即可得到人源化cd276基因纯合子小鼠。通过pcr鉴定子代小鼠体细胞的基因型(引物如表2所示)，示例性的f1代小鼠(已去除neo标记基因)的鉴定结果见图6，其中，编号为f1
‑
1、f1
‑
2和f1
‑
3的3只小鼠均为阳性杂合小鼠。
[0288]
表2：cd276基因检测引物序列
[0289][0290]
上述结果表明使用本方法能构建出可稳定传代且无随机插入的人源化cd276基因工程小鼠。
[0291]
根据上述方法，将来源于人的cd276还可以包括seq id no：4的第34
‑
417位两端向外延伸的与非人动物相同氨基酸残基的序列(参见图11)，所述相同氨基酸残基可以来自胞外区和/或信号肽，例如包括seq id no：4的第32
‑
456位、或者第30
‑
459位的胞外区，改造后的人源化小鼠cd276的mrna序列如seq id no:13，表达的蛋白序列如seq id no：12所示。也可以包括seq id no：4的第26
‑
459位的胞外区和信号肽。
[0292]
rt
‑
pcr检测：提取人源化小鼠脾脏细胞rna，利用逆转录试剂盒逆转录成cdna，利用引物mcd276
‑
f1(seq id no:30)：ggaccaaggcagtgcctact，mcd276
‑
r1(seq id no:31)：tggtcaccatgttccctggacgt扩增大小为239bp的小鼠cd276片段，用引物hcd276
‑
f1(seq id no:32):cagctggtgcacagctttgct,hcd276
‑
r1(seq id no:33)：ggcagctgtaggtgccatttgca扩增大小为442bp的人cd276片段，利用gapdh
‑
f(seq id no:34)：aggtcggtgtgaacggatttg，gapdh
‑
r(seq id no:26)：tgtagaccatgtagttgaggtca扩增大小为123bp的gapdh片段，gapdh作为内参。实验结果如图7所示,在野生型c57bl/6小鼠(+/+)可以检测到小鼠cd276(h/h)，纯合子人源化小鼠细胞中未检测到小鼠cd276，只检测到人源化cd276，说明我们获得小鼠体内有人源化cd276 mrna表达。
[0293]
对野生型c57bl/6小鼠和cd276人源化纯合子小鼠脾脏中的白细胞和t细胞免疫分型情况进行流式检测。选取6
‑
8周龄野生型c57bl/6小鼠和cd276基因人源化纯合子小鼠各3只，安乐死后取脾脏细胞、淋巴结和外周血，分别用抗鼠cd16/32抗体purified anti
‑
mouse cd16/32antibody、抗鼠cd45抗体brilliant violet 510
tm anti
‑
mo use cd45、抗鼠ly
‑
6g/ly
‑
6c(gr
‑
1)抗体percp anti
‑
mouse ly
‑
6g/ly
‑
6c(gr
‑
1)ant ibody、抗鼠cd4抗体brilliant violet 421
tm anti
‑
mouse cd4、抗鼠f4/80抗体fitc anti
‑
mouse f4/80antibody、抗鼠cd8a抗体pe anti
‑
mouse cd8a antibody、鼠源nk细胞表面抗体pe/cy
tm 7mouse anti
‑
mouse nk1.1、抗鼠foxp3抗体apc anti
‑
mou se/rat foxp3 antibody、抗鼠cd19抗体fitc anti
‑
mouse cd19 antibody、小鼠抗体percp/cy5.5 anti
‑
mouse tcrβ
chain、小鼠抗体apc hamster anti
‑
mouse tcrβchain、抗鼠cd11c抗体brilliant violet 605
tm anti
‑
mouse cd11c和抗cd11b抗体peanti
‑
mouse/human cd11b识别染色后进行流式检测。脾脏中白细胞亚型和t细胞亚型检测结果分别如图15和图16所示，淋巴结中白细胞亚型和t细胞亚型检测结果分别如图17和图18所示，外周血中白细胞亚型和t细胞亚型检测结果分别如图19和图20所示，从图中可以看出，cd276基因人源化纯合子小鼠脾脏中b细胞(b cells)、t细胞(t cells)、nk细胞(nk cells)、粒细胞(granulocyte)、dc细胞(dc cell)、巨噬细胞(macrophage)和单核细胞(monocyte)等白细胞亚型与c57bl/6野生型小鼠一致(图15)，cd4+t细胞(cd4)、cd8+t(cd8)细胞和tregs细胞(treg cells)等t细胞亚型百分比与c57bl/6野生型小鼠一致(图16),淋巴结、外周血中b细胞(b cells)、t细胞(t cells)、nk细胞(nk cells)、cd4
+
t细胞(cd4)、cd8+t细胞(cd8)、粒细胞(granulocyte)、dc细胞(dc cell)、巨噬细胞(macrophage)和单核细胞(monocyte)等白细胞亚型与c57bl/6野生型小鼠一致(图17和图19)，cd4+t细胞(cd4)、cd8+t(cd8)细胞和tregs细胞(treg cells)等t细胞亚型百分比与c57bl/6野生型小鼠一致(图18和图20)，表明cd276基因的人源化改造没有影响小鼠体内白细胞的分化、发育和在淋巴组织中的分布。
[0294]
以上结果表明，本实施例成功构建出可表达人源化cd276蛋白的cd276基因人源化小鼠。
[0295]
实施例2双基因和多基因人源化小鼠及其应用
[0296]
利用实施例1制得的cd276小鼠还可以制备双人源化或多人源化小鼠模型。如，前述实施例中，显微注射及胚胎移植过程使用的受精卵细胞选择来源于其它基因修饰小鼠的受精卵细胞，可选择例如pd
‑
1基因人源化小鼠的受精卵细胞进行基因编辑，可以进一步得到cd276和pd
‑
1基因修饰的双基因人源化小鼠。也可将本方法得到的cd276小鼠纯合或杂合子与其它基因修饰纯合或杂合小鼠交配，对其后代进行筛选，根据孟德尔遗传规律，可有一定几率得到cd276人源化与其它基因修饰的双基因或多基因修饰的杂合小鼠，再将杂合子相互交配可以得到双基因或多基因修饰的纯合子。
[0297]
以双重人源化cd276/pd
‑
1小鼠的生成为例。由于鼠cd276与pd
‑
1基因分别均位于9号和1号染色体上，选择实施例1制备的cd276基因人源化小鼠与pd
‑
1基因人源化的小鼠交配，通过阳性子代小鼠的筛选，最终得到双重人源化cd276/pd
‑
1小鼠。
[0298]
类似的方法可用于三基因人源化小鼠的生成为例。可先选择将其中任一基因人源化的两种小鼠交配后，再与第三种基因人源化小鼠交配，通过阳性子代小鼠的筛选，最终得到三重基因人源化的小鼠。
[0299]
实施例3动物模型体内药效验证
[0300]
取cd276纯合小鼠(4
‑
5周)，皮下接种小鼠结肠癌细胞mc38
‑
hcd276(即cd276基因人源化mc38细胞)，待肿瘤体积约100
±
50mm3后随机分为对照组(g1)或治疗组(g2)，每组5只小鼠。每周腹腔注射两次，共注射6次，治疗组注射enoblituzumab(抗人cd276抗体)，对照组注射等体积的同型对照抗体(higg)。每周测量肿瘤体积2次并称量小鼠的体重2次，接种后单只小鼠肿瘤体积达到3000mm3时执行安乐死结束试验。
[0301]
整体来看，各组实验过程中，动物健康状态良好。在实验终点时，各组动物体重均出现增长。所有实验治疗组和对照组小鼠体重(图8
‑
图9)在整个实验周期内均无显著区别，表明动物对enoblituzumab耐受良好。但从量瘤结果上看(图10，表3)，在分组后第21天，所
有对照组小鼠肿瘤在实验周期内均持续生长，对照组平均肿瘤体积为1393
±
113mm3，治疗组平均肿瘤体积为980
±
156mm3，治疗组小鼠的肿瘤体积明显小于对照组，治疗组小鼠的肿瘤体积均出现不同程度的缩小，可见在使用靶向人cd276抗体治疗后，具有较好的治疗和抑制肿瘤生长能力，且未对动物产生明显毒性作用，安全性较好。
[0302]
表3肿瘤体积、存活情况及体积抑制率
[0303][0304]
实施例4联合用药体内药效验证
[0305]
与实施例3方法类似，给药方案如下表4，每周测量肿瘤体积2次并称量小鼠的体重2次，接种后单只小鼠肿瘤体积达到3000mm3时执行安乐死结束试验。结果显示，整个试验周期内，所有治疗组(g2、g3、g4)与对照组(g1)小鼠体重稳定增长(图12)，体重变化无显著差别(图13)，说明cd276人源化小鼠对enoblituzumab和抗鼠pd
‑
1抗体(invivomab anti
‑
mouse pd
‑
1(cd279)，购自bio x cell公司，cat no：be0146)耐受良好。从肿瘤体积测量结果上看，所有对照组小鼠肿瘤体积在实验周期内均持续生长，但与对照组相比，所有治疗组小鼠的肿瘤体积呈现不同程度的缩小(图14)。在实验终点(分组后第25天)时，对照组g1平均肿瘤体积为1690
±
279mm3，治疗组g2、g3、g4平均肿瘤体积分别为829
±
180mm3、1103
±
185mm3、563
±
131mm3，且g2、g4组与对照组(g1)的瘤体积相比均具有显著的差异(p＜0.05)；从治疗效果上，治疗组g2、g3、g4的tgi
tv
％分别为54.3％、37.1％和71.2％，其中g4组肿瘤体积增长明显受到抑制(tgi
tv
＞60％)，说明与enoblituzumab或抗鼠pd
‑
1抗体单药治疗相比，enoblituzumab和pd
‑
1抗体联用可能具有协同作用，能够更好的抑制肿瘤生长。
[0306]
表4给药方案
[0307][0308]
表5肿瘤体积、存活情况及体积抑制率
[0309][0310]
*p值<0.05**p值<0.01
[0311]
以上实验证明了本方法制备cd276人源化小鼠可用于筛选抗人cd276抗体及体内药效检测，可作为体内研究的活体替代模型，用于人cd276信号通路调节剂的筛选、评估和治疗。
[0312]
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。