全禽源遗传系统及其在制备H7N9禽流感疫苗中的应用

全禽源遗传系统及其在制备h7n9禽流感疫苗中的应用
技术领域
1.本发明涉及反向遗传学技术和动物传染病技术领域，更具体地，涉及一种全禽源反向遗传操作系统及其在制备h7n9亚型禽流感疫苗中的应用。


背景技术：

2.禽流感（avian influenza，ai）是由禽流感病毒（avian influenza virus，aiv）引起的一种感染和/或疾病综合征，严重影响家禽养殖业的发展并威胁人类健康，家禽感染后可表现出不同的临床症状，根据致病性不同可将其分为低致病性禽流感（low pathogenic avian influenza，lpai）和高致病性禽流感（highly pathogenic avian influenza，hpai）。2013年出现的低致病性h7n9亚型禽流感病毒在我国禽群和人群中广泛流行，而2016年下半年，广东地区出现了高致病性h7n9亚型禽流感变异株，并迅速在养殖场和人群中传播和流行。h7n9亚型禽流感病毒进化和变异迅速，对动物和人类产生极大威胁，快速研制保护性好的禽流感疫苗十分重要。
3.为了满足大规模生产要求，减少由于疫苗供应不足或免疫效果差等原因造成的损失，迫切需要制备出免疫保护效果理想的疫苗株。因此，必须对流行毒株进行改造，除保持原有的免疫原性、消除其致病能力外，还要提高疫苗候选株在鸡胚培养过程中的病毒滴度。利用反向遗传学技术构建禽流感疫苗是目前主要的技术手段，然而现有技术中通过选择利用人流感疫苗骨架来构建重组禽流感疫苗（例如：hoffmann e,krauss s, perez d et al. eight
‑
plasmid system forrapid generation of influenza virus vaccines. vaccine, 2002, 20:3165
‑ꢀ
3170），由于含有人源基因，容易造成重组禽流感疫苗感染人类的风险。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于克服现有技术中存在的上述缺陷和不足，提供一种全禽源反向遗传操作系统。
5.本发明的第二个目的在于提供所述全禽源反向遗传操作系统在制备h7n9亚型禽流感疫苗中的应用。
6.本发明的第三个目的在于提供一种h7n9亚型禽流感重组毒株。
7.本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：一种基于h5n2亚型禽流感d7株的全禽源反向遗传操作系统（d7系统），为h5n2亚型禽流感d7株的八质粒反向遗传操作系统，所述八质粒为分别包含h5n2亚型禽流感d7株pb2、pb1、pa、ha、np、na、m和ns 8个基因片段的重组质粒；所述d7株的八个内部基因pb2、pb1、pa、ha、np、na、m和ns的核苷酸序列依次如seq id no：1～8所示。
8.所述以h5n2亚型禽流感d7株制备的疫苗为华南农业大学于2013年研制出的全球第一个全禽源的水禽专用h5n2亚型禽流感灭活疫苗；本发明利用该水禽专用且高度适应鸡胚的禽流感病毒d7株，建立了基于d7株的八质粒反向遗传操作系统（d7系统）用于禽流感疫
苗开发。以d7系统为骨架拯救出重组禽流感病毒的全部基因片段都来自禽源，这保留了禽流感病毒与人流感病毒之间所固有的种间屏障，降低了重组禽流感疫苗感染人类的风险，完全满足生物安全性要求。
9.优选地，所述重组质粒为psmc
‑
pb2，psmc
‑
pb1，psmc
‑
pa，psmc
‑
ha，psmc
‑
np，psmc
‑
na，psmc
‑
m，psmc
‑
ns。
10.具体地，所述psmc载体的构建方法为将pci载体质粒上的bsmbi酶切位点去除，得到pci
‑
new，通过基因合成的方式得到转录启动子序列、终止子序列以及转录元件；最后将载体pci
‑
new及获得的转录元件用xhoi、mlui双酶切，酶切鉴定为阳性的质粒即为psmc。
11.本发明基于d7系统能够快速生产出与流行毒株匹配的h7n9亚型禽流感疫苗株，对于防控高致病性h7n9亚型禽流感有重要意义。因此本申请请求保护上述任一所述全禽源反向遗传操作系统在制备禽流感疫苗中的应用。
12.优选地，所述禽流感疫苗为h7n9亚型禽流感疫苗的应用。
13.本发明还提供一种h7n9亚型禽流感重组毒株，是由高致病性h7n9亚型禽流感流行毒株改造后的ha基因和na基因与d7系统的六个内部基因pb2、pb1、pa、np、m和ns构成；所述改造后的ha基因序列如seq id no：9所示，na基因序列如seq id no：10所示。d7系统的六个内部基因与高致病性h7n9亚型禽流感流行毒株改造后的ha基因和na基因“6+2”组合拯救出的重组病毒能在鸡胚上保持良好的生长滴度和抗原性。
14.优选地，所述高致病性h7n9亚型禽流感流行毒株为a/chicken/liaoning/19155/2019（h7n9，ln155株）。
15.本发明还提供所述h7n9亚型禽流感重组毒株的制备方法，是将高致病性h7n9亚型禽流感流行毒株改造后的ha基因和na基因与d7系统的六个内部基因pb2、pb1、pa、np、m和ns一起拯救出重组病毒，即得。
16.具体地，所述方法具体包括构建分别表达d7系统的6个质粒即pb2、pb1、pa、np、m、ns和构建分别表达seq id no：9所述序列的改造后ha基因和seq id no：10所述序列na基因的2个质粒，将所述8种质粒混合，并与转染试剂加入到293t细胞中，培养后获得h7n9亚型禽流感重组病毒株。
17.本发明通过修饰高致病性h7n9亚型禽流感病毒ln155株的ha基因的裂解位点（由pevpkrkrtar/glf改造为pevpkg
‑‑‑‑
r/glf），随后将na基因和裂解位点修饰后的ha基因与d7系统的六个内部基因以“6+2”的形式重配转染293t细胞，成功拯救出重组病毒。
18.作为一种优选地实施方式，本发明还提供所述h7n9亚型禽流感灭活疫苗的制备方法，具体包括如下步骤：（1）反向遗传八质粒系统载体psmc的构建首先利用pcr技术将pci载体质粒（promega公司产品）上的bsmbi酶切位点去除，得到pci
‑
new，通过基因合成的方式得到转录启动子序列、终止子序列以及转录元件；最后将载体pci
‑
new及获得的转录元件用xhoi、mlui双酶切，将酶切鉴定为阳性的质粒命名为psmc。
19.（2）d7反向遗传系统的构建与验证将扩增出的d7株的8个基因片段（pb2、pb1、pa、ha、np、na、m和ns）连接到反向遗传载体psmc，阳性质粒分别命名为psmc
‑
pb2，psmc
‑
pb1，psmc
‑
pa，psmc
‑
ha，psmc
‑
np，psmc
‑
na，
psmc
‑
m，psmc
‑
ns，建立d7系统反向遗传禽流感疫苗开发平台；将8个阳性质粒共转染293t细胞，48 h后取细胞培养液接种9～11日龄spf鸡胚，成功拯救出的病毒可在鸡胚上稳定传代，经测序鉴定，证明d7反向系统构建成功。
20.（3）重组病毒的ha和na基因片段的扩增根据h7亚型高致病性禽流感病毒 ln155株的ha片段序列设计删除ha基因裂解位点的分段引物，利用融合pcr的方法对ha基因的序列进行定向改造，同时，用通用引物扩增出na基因的全长序列，改造后的片段命名为rha和rna。rha基因序列如seq id no：9所示，rna基因序列如seq id no：10所示。
21.（4）目的质粒的构建把片段rha和rna克隆到psmc表达载体，即利用限制性内切酶bsmbi把rha和rna片段插入psmc表达载体中，经测序鉴定，阳性重组质粒命名为psmc
‑
rha和psmc
‑
rna。
22.（5）重组病毒rln155的拯救重组质粒psmc
‑
rha和psmc
‑
rna与来自d7系统的psmc
‑
pb2、psmc
‑
pb1、psmc
‑
pa、psmc
‑
np、psmc
‑
m、psmc
‑
ns共转染293t细胞，48 h后，收取转染细胞及其上清液，接种9～11日龄spf鸡胚。60 h后，收获有血凝活性的尿囊液，通过pcr以及测序鉴定确认获得的病毒为目的重组毒株rln155，即h7n9亚型禽流感重组毒株。
23.本发明还提供一种基于反向遗传技术的重组全禽源h7n9亚型禽流感疫苗候选株h71903，包括免疫量的上述任一所述的h7n9亚型禽流感病毒株抗原。本发明进一步利用上述h7n9亚型禽流感重组病毒株研制出抗原匹配性和安全性出色的疫苗候选株h71903，所述疫苗能够提高对近年高致病性禽流感流行毒株的交叉反应性，可诱导家禽产生高水平的抗体和良好的保护效果，为防控禽流感提供了有效的工具。
24.本发明还提供上述任一所述h7n9亚型禽流感重组病毒或任一所述的重组全禽源h7n9亚型禽流感疫苗候选株h71903在制备预防和治疗h7n9亚型禽流感病毒的药物中的应用。
25.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：（1）本发明提供了一种基于h5n2亚型禽流感d7株的全禽源反向遗传操作系统（d7系统），全部基因片段都来自禽源，保留了禽流感病毒与人流感病毒之间所固有的种间屏障，降低人类感染风险，其利用该系统能快速生产出与流行毒株匹配的h7n9亚型禽流感疫苗株，对于防控高致病性h7n9亚型禽流感有重要意义，是一种安全高效的全禽源反向遗传系统。
26.（2）本发明还提供了h7n9亚型禽流感病毒株，通过h5n2亚型禽流感d7系统与高致病性h7n9亚型禽流感流行毒株改造后的ha基因和na基因“6+2”组合拯救出的重组病毒，能在鸡胚上保持良好的生长滴度和抗原性，且以d7株为骨架的重组禽流感为无致病力毒株，完全满足生物安全性要求。利用该重组病毒研制出抗原匹配性和安全性出色的疫苗h71903能够提高其与近年高致病性禽流感流行毒株的交叉反应性，可诱导家禽产生高水平的抗体和良好的保护效果，而且可保护其免受其他高致病性h7亚型禽流感病毒的攻击，为防控禽流感提供了有效的工具。
附图说明
27.图1为本发明中禽流感疫苗候选株h71903的构建及应用流程图。
28.图2为本发明中pci
‑
new载体构建示意图。
29.图3为本发明中psmc载体构建示意图。
30.图4为本发明中供体毒株ha基因和修饰后的ha基因pcr扩增结果图。泳道1和2为修饰后的ha基因，泳道3和4为供体毒株的ha基因；m为250 bp dna ladder。
31.图5为本发明中供体毒株ln155株的na基因pcr扩增结果图。泳道1为供体毒株na基因；m为250 bp dna ladder。
32.图6为本发明中修饰后的ln155株的rha基因的裂解位点与原序列对比的氨基酸示意图。
33.图7为本发明中免疫组和对照组spf鸡攻毒后存活率图。
具体实施方式
34.以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
35.除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
36.禽流感毒株a/duck/guangdong/d7/2007（h5n2）（简称d7株），由人兽共患病防控制剂国家地方联合工程实验室分离并保存。
37.高致病性禽流感毒株a/chicken/liaoning/19155/2019（h7n9，简称为ln155株），由人兽共患病防控制剂国家地方联合工程实验室分离并保存。
38.本发明禽流感疫苗候选株h71903的构建及应用流程图如图1，具体包括如下实施方式。
39.实施例1 基于d7株的全禽源禽流感疫苗反向遗传操作系统的构建1、反向遗传八质粒系统载体psmc的构建（如图2和图3）（1）pci载体的改造pci载体为promega公司产品（货号：br180）。为了将pci载体质粒上的bsmbi酶切位点去除，用限制性内切酶eari酶切pci载体，将得到长片段a和短片段b。在短片段b上设计扩增引物pci
‑
eari
‑
1和pci
‑
eari
‑
2。
40.pci
‑
eari
‑
1：5
’‑
tagcgagaggccgcacg
‑3’
；pci
‑
eari
‑
2：5
’‑
tcttcgttcggtcacagcttctgtaag
‑3’
；并以短片段b为模板扩增得到片段c；回收上述pcr产物得到片段c，与片段a分别用eari酶切、回收后，连接，转化，挑菌，抽质粒，用bsmbi酶切及测序鉴定，验证正确的质粒命名为pci
‑
new。
41.（2）转录元件的获得通过基因合成的方式得到转录启动子序列、终止子序列以及转录元件。
42.（3）pci
‑
new及转录元件的酶切将载体pci
‑
new及步骤（2）获得的转录元件用xhoi、mlui双酶切。
43.（4）pci
‑
new及转录元件酶切产物的连接、转化
将步骤（3）中的pci
‑
new载体和转录元件酶切回收产物连接，转化，挑菌，抽质粒，酶切鉴定。
44.（5）酶切鉴定将步骤（4）中抽取的可疑质粒分别用bsmbi单酶切、xhoi、mlui双酶切鉴定。
45.（6）测序鉴定将步骤（5）中酶切鉴定为阳性的质粒送测序，验证序列准确无误的质粒命名为psmc。
46.2、d7系统的构建利用反向遗传载体psmc，与扩增出的d7株的8个基因片段（pb2、pb1、pa、ha、np、na、m和ns，其核苷酸序列依次如seq id no：1～8所示）连接，分别命名为psmc
‑
pb2、psmc
‑
pb1、psmc
‑
pa、psmc
‑
ha、psmc
‑
np、psmc
‑
na、psmc
‑
m、psmc
‑
ns，建立d7系统反向遗传疫苗开发平台，为疫苗株提供内部基因。经共转染8个质粒进入293t细胞可以成功组装出一株有血凝活性的h5n2禽流感病毒，并可在鸡胚上稳定传代，经测序鉴定，证明该反向系统构建成功。
47.实施例2 h7n9亚型禽流感重组毒株的构建1、病毒rna的提取和反转录使用总rna抽提试剂盒提取尿囊液的总rna，参照m
‑
mlv反转录酶说明书，反转引物序列为：5
’‑
agcaaaagcagg
‑3’
，进行反转录得到cdna。
48.2、引物设计参照流感病毒的8个片段设计的通用引物，设计ha及na片段全长扩增引物；根据ln155株的ha的序列设计改造ha基因裂解位点的分段引物，具体序列如下，其中带下划线处为限制性内切酶bsmbi的识别序列。
49.ln155
‑
ha1
‑
f：5
’‑
tgaggttccaaagggaagaggcctatttggtgctatagc
‑3’
ln155
‑
ha2
‑
r：5
’‑
aaataggcctcttccctttggaacctcaggaacattcttc
‑3’
bm
‑
ha
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1f：5
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tattcgtctcagggagcaaaagcagggg
‑3’
bm
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ns
‑
890r：5
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atatcgtctcgtattagtagaaacaagggtgtttt
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bm
‑
na
‑
1f：5
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tattcgtctcagggagcaaaagcaggagt
‑3’
bm
‑
na
‑
1413r：5
’‑
atatcgtctcgtattagtagaaacaaggagtttttt
‑3’
3、ha片段的修饰和na片段的扩增及纯化利用高保真的dna聚合酶，采用分段引物扩增的方式对ln155株的ha片段进行分段pcr修饰扩增、融合pcr扩增和全长na基因扩增。
50.其中带有bsmbi酶切位点的上下游流感通用引物分别搭配分段引物，各扩增出ha1和ha2两部分，最后使用融合pcr的方法扩增出完整的修饰后的ha片段。同时，扩增出na片段。pcr扩增后，用提前配置好的1%的琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行初步检测，切下扩增成功的修饰后的ha基因片段和na基因片段，分别命名为rha和rna，扩增结果分别如图4和图5所示。rha经测序鉴定后与原序列比对，确定裂解位点已改造成功（如图6），rha和rna基因序列分别如seq id no：9和seq id no：10所示。
51.4、目的质粒的构建、筛选及纯化分别将扩增后的目的片段rha和rna与psmc表达载体用限制性内切酶bsmbi进行酶切消化（55℃水浴3 h）。
52.将各目的片段与psmc表达载体的酶切产物进行连接后，转化dh5a感受态细胞，涂板倒置经37℃培养过夜，通过菌液pcr初步筛选阳性克隆。具体操作如下：挑取单个菌落于加入500
ꢀµ
l氨苄抗性lb的ep管中，置于37℃摇床上，振荡培养3～4 h。进行菌液pcr扩增，并取10
ꢀµ
l pcr产物进行电泳检测。对测序正确的菌液进一步扩大培养，去内毒素抽提质粒，并测定其浓度和纯度，在
‑
40℃保存备用。
53.5、重组病毒rln155的拯救及鉴定细胞准备：转染前一天，选择生长状态良好的293t细胞用胰酶消化并计数，将适合浓度的细胞铺到12孔细胞培养板，置于含有5% co2的37℃培养箱中培养。单层细胞密度达到90%左右时用于后续实验。
54.转染步骤：将转染所需的8种质粒（300 ng/质粒）加入150 ml无血清培养基opti
‑
mem中，混合均匀，命名为a液；取4.8 μl转染试剂lipofectamine 2000加至另一150 μl opti
‑
mem中，命名为b液，混合均匀，室温静置5 min；再将a加入b液中，静置20 min。取出准备好的293t细胞，将原培养基弃去，用灭菌pbs洗两遍，加入质粒与脂质体混合液，置于含5% co2的37℃孵育4～6 h，更换含有bsa的dmem培养基继续培养。48 h后，收取细胞板的上清及细胞，接种至9～11日龄spf胚。接种60 h后，测定其尿囊液有无血凝活性，收获有血凝活性的尿囊液，测序鉴定，连续传五代，分装后
‑
80℃保存备用。
55.重组病毒的鉴定：提取拯救成功的病毒的rna，用rt
‑
pcr法进行全基因组测序，经鉴定正确后，将救获的重组病毒命名为rln155。
56.实施例3 重组病毒rln155制备疫苗h719031、疫苗的制备抗原的大量制备：将制苗毒株rln155使用无菌dmem细胞培养基进行稀释，稀释到10
‑4，取9～11日龄spf胚，将稀释好的病毒液无菌接种到鸡胚尿囊腔内，0.2 ml/枚，封口后放入37℃培养箱，孵育60 h后，在生物安全柜内收集鸡胚尿囊液，并测定其血凝（ha）效价。
57.抗原灭活：将上述所收集的病毒液使用终浓度为0.1%的甲醛灭活，密封之后放入摇床内，37℃孵育24 h；然后取该灭活的病毒液接种到9～11日龄的spf鸡胚，0.2 ml/枚，37℃培养48 h后，检测其血凝效价，验证病毒是否已完全灭活。
58.灭活油乳剂疫苗h71903的制备：配置水相，取灭活的抗原液rln155，97份，加入3份吐温
‑
80，充分混匀；配置油相，取ｍarcol
‑
52白矿油94份，加入6份司本
‑
80，充分混匀，高压灭菌备用。将油相与水相2：1的比例使用乳化机进行乳化，25000 r/min乳化5 min。在混匀的过程中可以取几滴制备好的灭活疫苗于冷水的表面，如果只有第一滴扩散，其他的不扩散，判定其剂型为油包水型。再将制备好的疫苗放入离心机中离心，3000 r/min离心15 min，观察有无分层破乳的情况。将制备检验好的疫苗命名为h71903，并将其分装好放入4℃保存。
59.2、血清交叉血凝抑制试验（hi试验）spf鸡免疫h71903疫苗和h7亚型禽流感商品化灭活疫苗rgd76 21 d后，采集血清，分别与2016年～2019年间12株病毒进行血清hi交叉试验（如表1）。结果表明h71903疫苗与
rgd76相比，整体血清交叉hi效价更高，且对流行毒株的反应性好。
[0060] 表1 hi（log2）交叉实验测定结果3、h71903疫苗株的spf鸡免疫攻毒保护试验为了验证h71903疫苗株的免疫效果，本试验将毒株sd1115、ln155、heb1908和ln（其中毒株sd1115为h7n2，其余三株毒均为h7n9）分别稀释成100ld
50
，a/b/c/d组分别连同5只对照鸡依次使用sd1115、ln155、heb1908和ln毒株进行滴鼻接种攻毒，0.2 ml/只，对照组分别命名为sd1115
‑
control、ln155
‑
control、heb1908
‑
control和ln
‑
control；免疫鸡攻毒后在隔离器中连续观察14 d，于感染后第5 d采集鸡的喉头及泄殖腔拭子，测定血凝效价并分析其排毒情况。
[0061]
（1）鸡免疫血清hi抗体效价免疫第21 d，采集隔离器中所有免疫及未免疫鸡的血液并分离出血清，将毒株ln155作为抗原，进行hi试验，各组试验鸡hi抗体滴度如表2，结果显示a、b、c和d四个组的hi中和效价都处于较高水平，抗体效价的几何均数（gmt）分别为7.5、7.5、7.0和7.5。
[0062] 表2 各组试验鸡hi抗体滴度（log2）（2）spf鸡感染后存活率以100ld
50
的病毒量攻毒免疫鸡与对照鸡，连续14 d对鸡的状态进行观察和记录，
四组实验鸡均存活下来，而未经免疫的对照鸡则在第2 d或第3 d便出现精神沉郁、食欲不振，且在第5 d左右出现死亡，说明使用重组的灭活疫苗h71903对鸡进行免疫后可使鸡获得保护（如图7）。
[0063]
（3）spf鸡感染后咽/肛拭子病毒检测在攻毒后的第5 d，采集所有实验组与对照组鸡的咽拭子及泄殖腔拭子并检测其排毒情况，根据表3可知，四组免疫鸡在攻毒5 d后均无排毒，说明该疫苗可以使鸡抵抗高致病性h7亚型禽流感病毒的致死性攻击。而对照组鸡在第3～6 d全部死亡，在第5 d采集的活鸡的拭子中也能检测到排毒。
[0064] 表3 免疫鸡排毒情况注：“+”表示病毒分离阳性，
“‑”
表示病毒分离阴性。
[0065]
重组禽流感灭活疫苗株h71903的试验结果表明，该疫苗对21日龄的spf鸡具有较好的免疫效果，不仅诱导免疫鸡产生高抗体水平，而且可保护其免受其他高致病性h7亚型禽流感病毒的攻击，保护率高达100%（如图7）。
[0066]
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。