本发明涉及海洋微藻技术领域，特别涉及一种杜氏盐藻培养基及其制备方法和培养方法。
背景技术：
杜氏盐藻(学名dunaliellasalina)是一种嗜盐的绿色微藻，属绿藻纲团藻目，可以生活在0.5-5.0mnacl的盐浓度环境中，由于其不具有细胞壁，且细胞膜富有弹性使其能够适应各种极端环境。在高盐度、高光强度、温度胁迫、缺氮等非生物胁迫因素下杜氏盐藻的β-胡萝卜素含量上升，其中高光和高盐胁迫下效果最为显著。有研究报道，其β-胡萝卜素的含量可高达干重的14％，环境胁迫下每个藻细胞含有约5-10倍的β-胡萝卜素。光学显微镜下可见β-胡萝卜的特征吸收光谱使盐藻细胞呈现鲜红色。
胡萝卜素由于其分子中含有多个双键的化学结构特点以及极低的极性，使其自身具有抗氧化性主要表现在它能够淬灭多达1000个自由基，也就是有清除自由基的能力。由于其抗氧化性，可以降低机体衰老以及预防疾病的发生，如肾脏病、癌症、动脉粥样化硬化和高血压等。同时，β-胡萝卜素还具有增强免疫力等功能。因此β-胡萝卜素被广泛应用于保健品、药品等有关人体健康的行业，同样也作为药物和着色剂广泛应用于食品和化妆品行业。
目前盐藻生产胡萝卜素效率低，只能依靠室外太阳光照，自养为主，易受外部环境影响，并且容易滋生杂菌，盐藻产出量不高。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明提供了一种杜氏盐藻培养基及其制备方法和培养方法。该发明解决了盐藻生长缓慢和胡萝卜素积累低的问题。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种杜氏盐藻培养基，包括前期一级培养基和后期二级培养基；
前期一级培养基的组成为：硝酸钠0.1～2.0g/l、磷酸二氢钾0.01～0.10g/l、葡萄糖0.1～2.0g/l、碳酸氢钠0.05～0.50g/l、铁盐母液0.1～2.0ml/l、微量元素母液1.0～5.0ml/l、氯化钠10～100g/l、水补足至1l；
后期二级培养基的组成为：硝酸钠0.1～1.0g/l、磷酸二氢钾0.01～0.10g/l、碳酸氢钠0.1～2.0g/l、铁盐母液0.1～1.0ml/l、微量元素母液0.1～2.0ml/l、氯化钠100～200g/l、水补足至1l；
铁盐母液的组成为：乙二胺四乙酸二钠1.0～5.0g、氯化铁0.1～1.0g、水补足至1l；
微量元素母液的组成为：硼酸0.1～1.0g、硫酸铜10～100mg、硫酸锌50～150mg、二氯化钴10～100mg、氯化锰10～100mg、钼酸铵0.1～1.0g、水补足至1l。
作为优选，前期一级培养基的组成为：硝酸钠0.5～1.0g/l、磷酸二氢钾0.02～0.06g/l、葡萄糖0.5～1.5g/l、碳酸氢钠0.10～0.20g/l、铁盐母液0.8～1.2ml/l、微量元素母液1.0～2.0ml/l、氯化钠50～70g/l、水补足至1l；
后期二级培养基的组成为：硝酸钠0.1～0.5g/l、磷酸二氢钾0.01～0.05g/l、碳酸氢钠0.5～1.5g/l、铁盐母液0.3～0.7ml/l、微量元素母液0.5～1.5ml/l、氯化钠140～180g/l、水补足至1l；
铁盐母液的组成为：乙二胺四乙酸二钠1.0～3.0g、氯化铁0.1～0.5g、水补足至1l；
微量元素母液的组成为：硼酸0.4～0.8g、硫酸铜40～80mg、硫酸锌60～100mg、二氯化钴30～70mg、氯化锰20～60mg、钼酸铵0.2～0.5g、水补足至1l。
优选地，前期一级培养基的组成为：硝酸钠0.75g/l、磷酸二氢钾0.04g/l、葡萄糖1.0g/l、碳酸氢钠0.15g/l、铁盐母液1ml/l、微量元素母液1.5ml/l、氯化钠50g/l、水补足至1l；
后期二级培养基的组成为：硝酸钠0.25g/l、磷酸二氢钾0.02g/l、碳酸氢钠1.0g/l、铁盐母液0.5ml/l、微量元素母液1ml/l、氯化钠180g/l、水补足至1l；
铁盐母液的组成为：乙二胺四乙酸二钠2.0g、氯化铁0.24g、水补足至1l；
微量元素母液的组成为：硼酸0.61g、硫酸铜60mg、硫酸锌86mg、二氯化钴51mg、氯化锰41mg、钼酸铵0.38g、水补足至1l。
作为优选，前期一级培养基的ph值为7.5～8.5，后期二级培养基的ph值为7.5～8.5。
优选地，前期一级培养基的ph值为7.5，后期二级培养基的ph值为7.5。
本发明还提供了上述杜氏盐藻培养基的制备方法，包括：将硝酸钠、磷酸二氢钾、葡萄糖、碳酸氢钠、铁盐母液、微量元素母液、氯化钠溶于水，调节ph值，灭菌，得到前期一级培养基；
将硝酸钠、磷酸二氢钾、碳酸氢钠、铁盐母液、微量元素母液、氯化钠溶于水，调节ph值，灭菌，得到后期二级培养基。
作为优选，灭菌的温度为120～130℃。
本发明还提供了一种杜氏盐藻的培养方法，包括以下步骤：
1)将杜氏盐藻藻种接种于前期一级培养基中进行第一培养；
2)将步骤1)所得对数生长期的杜氏盐藻接种于后期二级培养基中进行第二培养。
本发明培养方法分两步培养，前期低盐扩培，后期高盐积累胡萝卜素，根据盐藻生长不同时期去调节光照与温度，不仅能提高盐藻培养密度，还可以提高胡萝卜素产量，缩短培养时间，节约成本。
本发明通过实验室合理利用光照，调控温度，则可以使盐藻生产不受地域环境影响，在任何时候都可生产大量盐藻。
作为优选，第一培养的条件为：培养温度25～32℃，光照强度3000～8000lux，光照周期12h/d，每天摇瓶三次。
优选地，第一培养的条件为：培养温度25℃，光照强度5000lux，光照周期12h/d，每天摇瓶三次。
作为优选，第二培养的条件为：培养温度20～30℃，光照强度30000～50000lux，光照周期18h/d，每天摇瓶三次。
优选地，第二培养的条件为：培养温度28℃，光照强度50000lux，光照周期18h/d，每天摇瓶三次。
作为优选，步骤1)与步骤2)之间还包括：将培养物进行离心，得到对数生长期的杜氏盐藻。
作为优选，离心的转速为3000～4000r/min，时间为5～10min。
优选地，离心的转速为3000r/min，时间为10min。
本发明提供了一种杜氏盐藻培养基及其制备方法和培养方法。该培养基包括前期一级培养基和后期二级培养基；前期一级培养基的组成为：硝酸钠、磷酸二氢钾、葡萄糖、碳酸氢钠、铁盐母液、微量元素母液、氯化钠；后期二级培养基的组成为：硝酸钠、磷酸二氢钾、碳酸氢钠、铁盐母液、微量元素母液、氯化钠；铁盐母液的组成为：乙二胺四乙酸二钠、氯化铁；微量元素母液的组成为：硼酸、硫酸铜、硫酸锌、二氯化钴、氯化锰、钼酸铵。本发明具有的技术效果为：
本发明通过前期低盐，充足营养物质和适当的光照使杜氏盐藻快速生长，后期高盐度，低营养盐和强光照为杜氏盐藻提供不利环境，迫使杜氏盐藻积累胡萝卜素，该方法既有利于盐藻生长，又不影响胡萝卜素积累。
具体实施方式
本发明公开了一种杜氏盐藻培养基及其制备方法和培养方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明中所用培养基原料均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1：
配制前期一级培养基：硝酸钠0.75g/l、磷酸二氢钾0.04g/l、葡萄糖1.0g/l、碳酸氢钠0.15g/l、铁盐母液1ml/l、微量元素母液1.5ml/l；其中，铁盐母液配方为：乙二胺四乙酸二钠2.0g、氯化铁0.24g，加水定容至1l。微量元素母液配方为：硼酸0.61g、硫酸铜60mg、硫酸锌86mg、二氯化钴51mg、氯化锰41mg、钼酸铵0.38g，加水定容至1l。
加入50/l氯化钠，调ph7.5，121℃高温灭菌。接杜氏盐藻种于前期培养液三角瓶中进行培养，培养温度25℃，光照强度5000lux，光照周期：开始光照t1，停止光照t2，t1:t2＝1:1，每天摇瓶三次。
配制后期二级培养基：硝酸钠0.25g/l、磷酸二氢钾0.02g/l、碳酸氢钠1.0g/l、铁盐母液0.5ml/l、微量元素母液1ml/l。
加入180g/l氯化钠，调ph7.5，121℃高温灭菌。
前期培养结束后，取对数生长期盐藻离心，离心转速为3000r/min，时间为10min，去除前期培养液，置于新配制二期培养液中培养，培养温度28℃，光照强度50000lux，光照周期：开始光照t1，停止光照t2，t1:t2＝3:1，每天摇瓶三次。
对比例1：
配制培养基：硝酸钠0.75g/l、磷酸二氢钾0.04g/l、葡萄糖1.0g/l、碳酸氢钠0.15g/l、铁盐母液1ml/l、微量元素母液1.5ml/l；铁盐母液配方为：乙二胺四乙酸二钠2.0g、氯化铁0.24g，加水定容至1l。微量元素母液配方为：硼酸0.61g、硫酸铜60mg、硫酸锌86mg、二氯化钴51mg、氯化锰41mg、钼酸铵0.38g，加水定容至1l。
加入50/l氯化钠，调ph7.5，121℃高温灭菌。接杜氏盐藻种于培养液三角瓶中进行培养，培养温度25℃，光照强度3000lux，光照周期：开始光照t1，停止光照t2，t1:t2＝1:1，每天摇瓶三次。
对比例2：
配制培养基：硝酸钠0.25g/l、磷酸二氢钾0.02g/l、碳酸氢钠1.0g/l、铁盐母液0.5ml/l、微量元素母液1ml/l；铁盐母液配方为：乙二胺四乙酸二钠2.0g、氯化铁0.24g，加水定容至1l。微量元素母液配方为：硼酸0.61g、硫酸铜60mg、硫酸锌86mg、二氯化钴51mg、氯化锰41mg、钼酸铵0.38g，加水定容至1l。
加入180g/l氯化钠，调ph7.5，121℃高温灭菌。接杜氏盐藻种于培养液三角瓶中进行培养，培养温度28℃，光照强度50000lux，光照周期：开始光照t1，停止光照t2，t1:t2＝1:1，每天摇瓶三次。
试验例
使用f/2培养基，25℃恒温，12h5000lux光照培养，作为对比实验。
f/2培养基配方为：硝酸钠75mg/l、磷酸二氢钠5mg/l、氯化铁3.16mg、硫酸铜0.01mg、硫酸锌0.023mg、二氯化钴0.012mg、氯化锰0.18mg、钼酸钠0.07mg、维生素b10.1mg、维生素b120.5mg，加水定容至1l。
实验数据如下：
表1
由上表可知本发明所提供培养基及其培养方法，不仅使杜氏盐藻短期内大量增长，还能有利于其胡萝卜素积累。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。