用于治疗脊髓性肌萎缩的腺相关病毒载体及其用途的制作方法

1.本发明涉及基因治疗领域，尤其涉及用于治疗脊髓性肌萎缩的腺相关病毒载体及其用途。


背景技术：

2.脊髓性肌萎缩(spinal muscular atrophy，sma)是一种运动神经元退行性的罕见病，该病以脊髓前角运动神经元变性为特征，有时也可累及脑干运动神经元。临床上主要表现为运动神经元进行性、对称性肌无力和萎缩，近端重于远端，下肢重于上肢。由于肌肉无力，呼吸、运动和吞咽等均有影响。在美国，新生婴儿中的发病率为1/6000
‑
10000，人群中携带率为1/40
‑
60。国内的发病情况尚无官方统计，因该病的发病无种族特异性，推测国内共有患者3
‑
5万人，每年新增1500
‑
2500患者。
3.sma发病与5号染色体中smn基因突变有关，smn编码全长的smn(smn
‑
fl)，其编码蛋白全长包含294个氨基酸，分子量为38kd。smn分子在细胞质和细胞核内表达，主要与分子转录调控有关。smn与gemins等分子形成蛋白复合体，与snrnp复合物相互结合进入细胞核，形成gem body(简称gb)，调控细胞内基因的转录。细胞中缺失smn分子，转录水平降低，在运动神经元中尤其明显，造成运动神经元活性下降，从而使神经突触连接减少，肌肉活力降低。人体内共有两个smn等位基因，靠近端粒的smnl及靠近着丝粒的smn2。两者高度同源，在编码区内的差异仅外显子7的同义突变，其他差异均位于非编码区。smnl基因表达产物90％为功能性smn蛋白，而smn2基因转录本90％缺少外显子7，只有10％的包含外显子7的转录本，仅表达10％左右的功能性smn蛋白。sma患者的smn1基因缺失，smn2基因的第7个外显子突变导致smn蛋白水平降低。根据smn2基因中第7个外显子的突变拷贝数，可以将患者分为4种类型。smai型患者一般在出生后2周到3月内发病，肌肉张力严重衰竭，患儿很难坐立，2岁左右因呼吸衰竭去世；ii型患者一般在6
‑
18月内发病，能够坐立，却很难独立行走，一般在成年后死亡；iii型患者随着年龄的增大，慢慢丧失行走能力，但是寿命正常；iv型患者一般在青少年发病，有轻微的运动障碍，寿命不受影响。由于sma尚未被国家纳入新生儿疾病的筛查体系，推测未来10
‑
20年国内的sma患者数量稳定增加。
4.fda批准上市第一个sma药物是biogen公司研发的反义寡核苷酸药物(isis
‑
smnrx)，其通过修饰smn2基因的前信使rna剪接，从而产生正常的smn蛋白，主要治疗ii型sma病人。但是，该药物服用后易造成泌尿系统毒性，易使患者的血小板降低和导致凝血障碍等不良反应。研发一种对患者疗效更安全、适应症更广泛的药物是未来的研发方向。2019年5月，fda批准了诺华公司的基因治疗药物zolgensma，该药物使用非复制型腺相关病毒作为人smn功能性基因的递送载体来治疗sma患者，虽然取得一定治疗效果，但价格昂贵，一般普通患者消费不起。因此，对于sma疾病，我国目前仍迫切需要一种能广泛接受且更有效治疗sma的药物以及方法。


技术实现要素：

5.本发明基于单基因突变导致患者体内缺失smn分子的发病机制，通过基因治疗方法在患者体内直接补充smn基因。候选药物用双链aav腺相关病毒载体携带正常的smn基因进入脊髓，通过转录和翻译，产生适应体内环境的正常smn蛋白。
6.在一方面，本发明提供了一种重组核酸分子，其包含可操作的依次连接的启动子、杂合内含子和编码功能性运动神经元存活蛋白的核酸序列。
7.在一方面，本发明提供了一种重组载体，其包含本文中所述的重组核酸分子。
8.在另一方面，本发明提供了一种重组腺相关病毒(raav)，其包含aav衣壳和载体基因组，所述载体基因组包含aav反向末端重复序列(itr)、编码运动神经元存活蛋白(smn)的核酸序列和引导smn在宿主细胞中表达的表达控制序列。
9.在某些实施方案中，重组腺相关病毒(raav)是自身互补腺相关病毒(scaav)。
10.在某些实施方案中，重组腺相关病毒(raav)是重组的aav2/9腺相关病毒。
11.在另一方面，本发明涉及适于鞘内施用于动物受试者的具有aav衣壳的重组腺相关病毒(raav)，所述aav衣壳内包封含有aav itr(反向末端重复序列)及受调节元件控制的编码smn的核酸，所述调节元件引导smn在宿主细胞中表达(“raav.smn”)。此类raav.smn是复制缺陷型的，并有利地可用于将smn递送至诊断患有smn缺陷的受试者的cns；特别是诊断患有sma的人受试者。在一个优选实施方案中，该raav.smn转导脑和脊髓中的神经元，且特别是运动神经元。在另一优选实施方案中，本发明的raav.smn未被可能存在于待治疗的受试者中的aav9衣壳的抗血清所中和。在某些实施方案中，该核酸序列编码seq id no:9或10或与其共享至少95％同一性的序列。
12.在某些实施方案中，编码人smn蛋白(“hsmn”)的核酸序列可以是密码子优化的。参见例如，编码该smn蛋白的核酸序列是seq id no:6的smn序列，或与其共享至少70％同一性的序列。
13.在另一方面，本发明提供了一种分离的宿主细胞，其包含本文中所述的重组载体或重组腺相关病毒(raav)。
14.在另一方面，本发明提供了一种药物组合物，其包含药学上可接受的载体和如本文中所述的重组腺相关病毒(raav)。
15.在另一方面，本发明提供了本文中所述的重组核酸分子、重组载体、重组腺相关病毒(raav)、宿主细胞和/或药物组合物在制备用于预防或治疗的脊髓性肌萎缩药物中的用途。
16.在又一方面，本发明提供了在受试者中治疗脊髓性肌萎缩的方法。该方法包括向需要其的受试者施用如本文中所述的药物组合物。
17.本发明提供一种更有效地、起效快地用于治疗脊髓性肌萎缩的重组腺相关病毒(raav)。
18.下面结合附图和具体实施方式对本公开做进一步说明，并非对本公开的限制。凡是依照本专利申请公开内容所进行的任何本领域等同替换，均属于本专利的保护范围。
附图说明
19.图1示出了psc
‑
cmv的质粒图谱。
20.图2示出了itr间插入片段的两种不同结构。
21.图3示出了psnav2.0
‑
cag
‑
egfp的质粒图谱。
22.图4a示出了l
‑
g1和l
‑
g2重组质粒在293细胞中的转染效率(24h)。其中f表示荧光，l表示白光。图4b示出了l
‑
g1和l
‑
g2重组质粒在pc12细胞中的转染效率(24h)。其中f表示荧光，l表示白光。图4c示出了不同重组病毒在pc12细胞中感染效率的比较。其中f表示荧光，l表示白光。
23.图5示出了含有不同mini内含子元件的结构图。
24.图6示出了含有不同mini内含子元件的重组载体转染细胞后的表达情况，其中nc表示未转染对照组。其中，图6a代表pc12细胞，图6b代表293细胞。
25.图7a示出了含有不同mini内含子元件的重组载体转染293细胞后对其增殖活性的影响。其中pc指阳性对照，是实验中加入血清的未感染样品相对于撤去血清的未感染样品的cck8活性od值的倍数。图7b示出了含有不同mini内含子元件的重组病毒感染成纤维细胞后对其增殖活性的影响。其中pc指阳性对照，是实验中加入血清的未感染样品相对于撤去血清的未感染样品的cck8活性od值的倍数。
26.图8示出了候选药物在病人成纤维细胞中smn rna表达水平，其中ctrl表示未感染病毒对照。smn
△
7表示缺失外显子7。
27.图9示出了候选药物在病人成纤维细胞中smn蛋白表达水平，其中ctrl表示未感染病毒对照。
28.图10示出了候选药物促进gb形成。其中dapi指4',6
‑
二脒基
‑2‑
苯基吲哚(4',6
‑
diamidino
‑2‑
phenylindole)，dic指differentia interference contrast(微干涉相差)，m指叠加图片，将红色与蓝色两个通道叠加在一起的图片。
29.图11a和图11b均示出了候选药物以剂量依赖的方式促进gb形成。
30.图12示出了候选药物促进病人成纤维细胞存活。
31.图13示出了候选药物抑制pc12细胞凋亡。
32.图14示出了候选药物抑制病人成纤维细胞凋亡。
33.图15示出了重组病毒scaav2/9
‑
l
‑
g1感染脊髓运动神经元。其中，m指叠加图片，是将gfp、chat和dapi三种通道叠加在一起的图片。
34.图16示出了候选药物(l
‑
ors1)与重组病毒(l
‑
ors4)在提高小鼠存活率方面的比较。
35.图17示出了候选药物以剂量依赖方式促进小鼠在转棒实验中的抓棒时间。其中ng表示正常对照组，mg表示模型对照组，ldg表示低剂量给药组，mdg表示中剂量给药组，hdg表示高剂量给药组。
36.图18示出了候选药物以剂量依赖方式促进小鼠肌肉力量(肌力值)的增加。其中ng表示正常对照组，mg表示模型对照组，ldg表示低剂量给药组，mdg表示中剂量给药组，hdg表示高剂量给药组。
37.图19
‑
21示出了候选药物(l
‑
ors1)缓解小鼠骨骼肌萎缩。其中图19为正常对照组，图20为模型对照组，图21为供试品高剂量给药组。显微镜下放大倍数200
×
。
38.图22
‑
24示出了候选药物(l
‑
ors1)缓解小鼠脊髓萎缩。其中图22为正常对照组，图23为模型对照组，图24为供试品高剂量给药组。显微镜下放大倍数100
×
。
39.图25
‑
27示出了候选药物(l
‑
ors1)缓解小鼠脑组织萎缩。其中图25为正常对照组，图26为模型对照组，图27为供试品高剂量给药组。显微镜下放大倍数100
×
。
具体实施方式
40.i.定义
41.除非另外指出，本发明的实践将采用本领域技术中的常规化学、生物化学、重组dna技术和免疫学的方法。这样的技术在文献中有充分解释(参见例如fundamentalvirology，第二版，vol.i&ii(b.n.fields和d.m.knipe编)；handbook of experimentalimmunology，vois.i
‑
fv(d.m.weir和cc.blackwell编，blackwell scientificpublications)；t.e.creighton，proteins:structures and molecular properties(w.h.freeman和company，1993)；a.l.lehninger，biochemistry(worth publishers,inc.，current addition)；sambrook,等，molecular cloning:alaboratory manual(第2版，1989)；methods in enzymology(s.colowick和n.kaplan编，academic press,inc.)。
42.为了便于理解本公开内容的各个实施方案，提供了特定术语的以下解释：
43.腺相关病毒(aav)：感染人和其他一些灵长类物种的小的复制缺陷性无包膜病毒。已知aav不造成疾病并且引起非常轻微的免疫应答。使用aav的基因疗法载体可以感染分裂细胞和静止期细胞，并且可以保持染色体外状态而不整合到宿主细胞的基因组中。这些特征使得aav成为用于基因疗法的有吸引力的病毒载体。
44.给药/给予：通过有效的途径向受试者提供或给予药剂，例如治疗剂(例如，重组aav)。示例性给药途径包括但不限于注射(例如，皮下、肌内、真皮内、腹膜内和静脉内)、口服、导管内、舌下、直肠、经皮、鼻内、阴道和吸入途径。
45.密码子优化的：“密码子优化的”核酸是指已经被改变以使得密码子最适于特定系统(例如，特定物种或物种的组)中的表达的核酸序列。例如，核酸序列可以优化用于在哺乳动物细胞或特定哺乳动物物种(例如人细胞)中表达。密码子优化不改变所编码蛋白质的氨基酸序列。
46.增强子：通过提高启动子的活性来提高转录速率的核酸序列。
47.内含子：基因中不包含蛋白质的编码信息的一段dna。内含子在信使rna翻译之前被移除。杂合内含子(hybrid intron)：是一种组合内含子，其包括来自一个以上天然内含子的序列。
48.反向末端重复(itr)：有效复制所需的腺相关病毒基因组中的对称核酸序列。itr序列位于aav dna基因组的每一端。itr充当病毒dna合成的复制起点，并且是产生aav整合型载体的必要的顺式元件。
49.分离的：“分离的”生物组分(例如，核酸分子、蛋白质、病毒或细胞)已经被从其中所述组分天然存在的生物体的细胞或组织中或者生物体本身中的其他生物组分(例如其他染色体和染色体外dna和rna、蛋白质和细胞)中基本上分离或纯化。已经“分离”的核酸分子和蛋白质包括通过标准纯化方法纯化的那些。该术语还包括通过在宿主细胞中重组表达制备的核酸分子和蛋白质，以及化学合成的核酸分子和蛋白质。
50.可操作地连接：当第一核酸序列与第二核酸序列被放置为具有功能关系时，第一
核酸序列与第二核酸序列可操作地连接。例如，如果启动子影响编码序列的转录或表达，则启动子与编码序列可操作地连接。通常，可操作地连接的dna序列是连续的，并且当有必要连接两个蛋白质编码区时，其在相同阅读框中。
51.可药用载体：本公开内容中可以使用的可药用载体(溶剂(vehicle))是常规的。remington’s pharmaceutical sciences,by e.w.martin,mackpublishing co.,easton,pa,15th edition(1975)描述了适合一种或更多种治疗性化合物、分子或试剂的药物递送的组合物和制剂。
52.通常，载体的性质取决于所使用的特定给药方式。例如，胃肠外制剂通常包含可注射流体，其包括药学和生理学上可接受的流体，例如水、生理盐水、平衡盐溶液、水性右旋糖、甘油等作为溶剂。对于固体组合物(例如，粉末剂、丸剂、片剂或胶囊剂形式)，可以包含常规无毒固体载体，例如药物级甘露醇、乳糖、淀粉或硬脂酸镁。除了生物学中性载体外，待给予的药物组合物还可以包含少量无毒辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、防腐剂和ph缓冲剂等，例如醋酸钠或脱水山梨糖醇单月桂酸酯.
53.预防、治疗或改善疾病：“预防”疾病(例如gsd
‑
ia)是指抑制疾病的全面发生。“治疗”是指在疾病开始发生后改善疾病或病理病症的体征或症状的治疗性介入。“改善”是指降低疾病的体征或症状的数目或严重性。
54.启动子：指导/引起核酸(例如，基因)的转录的dna区域。启动子包括转录起始位点附近的必要核酸序列。通常，启动子位于其转录的基因附近。启动子区域还任选地包括远端增强子或阻遏物元件，其可以位于距转录起始位点数千个碱基对远。
55.重组：重组核酸分子是指这样的核酸分子，其具有非天然存在的序列，或者具有通过两个序列片段的人为组合(否则地话，其将是分开的)制备的序列。这种人为组合可以通过化学合成或者通过分离的核酸分子片段的人为操作(如通过基因工程技术)实现。
56.同样地，重组病毒是包含非天然存在的序列或通过至少两个不同来源的序列的人为组合制备的序列的病毒。术语“重组”还包括仅通过天然核酸分子、蛋白质或病毒的一部分的添加、置换或缺失改变的核酸、蛋白质和病毒。本文使用的“重组aav”是指其中包装有重组核酸分子(例如，编码g6pase
‑
α的重组核酸分子)的aav颗粒。
57.血清型：通过抗原的特征组区分的一类密切相关的微生物(例如，病毒)。
58.受试者：活的多细胞脊椎动物生物体，包括人和非人哺乳动物的类别。
59.合成：通过人工手段在实验室产生，例如合成核酸可以在实验室化学合成。
60.治疗有效量：足以在用试剂治疗的受试者或者细胞中取得所需效果的特定药物或治疗试剂(例如重组aav)的量。试剂的有效量取决于多种因素，包括但不限于被治疗的受试者或细胞，以及治疗性组合物的给药方式。
61.载体：载体是允许插入外源核酸而不破坏载体在宿主细胞中复制和/或整合的能力的核酸分子。载体可以包含允许其在宿主细胞中复制的核酸序列，例如复制起点。载体还可以包含一种或更多种选择性标记基因和其他遗传元件。表达载体是包含必要的调控序列以允许插入的基因转录和翻译的载体。在本文的一些实施方案中，载体是aav载体。序列同一性：两个或更多个核酸序列之间或者两个或更多个氨基酸序列之间的同一性或相似性是根据序列之间的同一性或相似性表示。序列同一性可以根据百分比同一性测量；百分比越高，序列越相同。序列相似性可以根据百分比相似性测量(考虑保守性氨基酸置换)；百分比
越高，序列越相似。当使用标准方法比对时，核酸或氨基酸序列的同源物或直系同源物具有相对高的序列同一性/相似性程度。与来自相关性更远的物种(例如，人和线虫(c.elegans)序列)相比，当直系同源蛋白质或cdna来自更紧密相关的物种(例如，人和小鼠序列)时，这种同源性更显著。
62.序列同一性比较的长度可在基因组的全长上，基因编码序列的全长，或至少大约500至5000个核苷酸的片段是期望的。但是，在较小片段(例如具有至少大约9个核苷酸，通常至少大约20至24个核苷酸、至少大约28至32个核苷酸、至少大约36或更多个核苷酸)中的同一性也可以是期望的。
63.可在全长的蛋白、多肽、大约32个氨基酸、大约330个氨基酸或其肽片段或相应的核酸序列编码序列上容易地测定氨基酸序列的百分比同一性。合适的氨基酸片段的长度可以为至少大约8个氨基酸，并可以为至最多大约700个氨基酸。通常，当提到两种不同序列之间的“同一性”、“同源性”或“相似性”时，参照“比对”序列确定“同一性”、“同源性”或“相似性”。“比对”序列或“比对”是指多个核酸序列或蛋白(氨基酸)序列，其通常含有与参考序列相比缺失或额外的碱基或氨基酸的校正。
64.使用任何公共或市售可得的多序列比对程序来进行比对。序列比对程序可用于氨基酸序列，例如“clustal x”、“map”、“pima”、“msa”、“blockmaker”、“meme”和“match
‑
box”程序。通常，这些程序中的任一种以默认设置使用，尽管本领域技术人员可以按需改变这些设置。或者，本领域技术人员可以采用至少提供如参考算法或程序所提供的同一性或比对水平的另一算法或计算机程序。参见例如j.d.thomson等人,nucl.acids.res.,“acomprehensive comparison of multiple sequence alignments”,27(13):2682
‑
2690(1999)。
65.多序列比对程序还可用于核酸序列。此类程序的实例包括“clustal w”、“capsequence assembly”、“blast”、“map”和“meme”，其可以通过互联网上的web服务器来访问。此类程序的其它来源是本领域技术人员已知的。或者，还使用vector nti应用程序。还存在许多可用于测量核苷酸序列同一性的本领域已知的算法，包括在上述程序中包含的那些。作为另一实例，可以使用fasta
tm
(gcg version 6.1中的一个程序)来比较多核苷酸序列。fasta
tm
提供了询问与搜索序列之间最佳重叠区域的比对和百分比序列同一性。例如，可以使用fasta
tm
以其在gcg version6.1(经此引用并入本文)中提供的默认参数(字长为6，和用于打分矩阵的nopam因子)来确定核酸序列之间的百分比序列同一性。
66.在一方面，提供了编码功能性smn蛋白的编码序列。各种smn1分子和smn蛋白的核苷酸和氨基酸序列是已知的。例如，ncbi登录号nm_000344(人)、np_000335(人)、nm_011420(小鼠)、eu791616(猪)、nm_001131470(猩猩)、nm_131191(斑马鱼)、bc062404(大鼠)、nm_001009328(猫)、nm_001003226(狗)、nm_175701(奶牛)。在一个实施方案中，功能性smn1的编码多核苷酸序列是seq id no:8所示的序列或与其共享95％同一性的序列。在一个实施方案中，提供了修饰的hsmn1编码序列。优选地，修饰的hsmn1编码序列与全长天然hsmn1编码序列具有小于大约80％的同一性，优选大约75％或更小的同一性。在一个实施方案中，修饰的hsmn1编码序列的特征在于在aav介导的递送(例如raav)之后与天然hsmn1相比改进的翻译速率。在一个实施方案中，修饰的hsmn1编码序列与全长天然hsmn1编码序列共享小于大约80％、79％、78％、77％、76％、75％、74％、73％、72％、71％、70％、69％、68％、67％、
66％、65％、64％、63％、62％、61％或更小的同一性。在一个实施方案中，修饰的hsmn1编码序列是seq id no:6，或与seq id no:6共享70％、75％、80％、85％、90％、95％或更大的同一性的序列。
67.在一个实施方案中，修饰的hsmn1编码序列是密码子优化的序列，针对受试物种中的表达而进行了优化。本文中所用的“受试者”是哺乳动物，例如人、小鼠、大鼠、豚鼠、狗、猫、马、牛、猪或非人灵长类，如猴子、黑猩猩、狒狒或大猩猩。在一个优选实施方案中，该受试者是人。在一个实施方案中，该序列经密码子优化用于在人内表达。
68.密码子优化的编码区可以通过各种不同的方法来设计。可以使用可在线获得的方法(例如geneart)、公开的方法、或提供密码子优化服务的公司，例如dna2.0(menlo park,ca)来进行这种优化。例如，在美国国际专利公开号wo 2015/012924中描述了一种密码子优化方法，其经此引用全文并入本文。还参见例如美国专利公开号2014/0032186和美国专利公开号2006/0136184。适当地，修改该产品的开放阅读框(orf)的整个长度。但是，在一些实施方案中，可以仅改变orf的片段。通过使用这些方法中的一种，可以对任意给定的多肽序列施加所述频率，并生产编码该多肽的密码子优化的编码区的核酸片段。
69.许多选择可用于对密码子进行实际改变或用于合成如本文中所述设计的密码子优化的编码区。可以使用本领域普通技术人员熟知的标准和常规的分子生物学操作来进行此类修饰或合成。在一种方法中，通过标准方法合成了各自长度为80
‑
90个核苷酸并跨越所需序列长度的一系列互补寡核苷酸对。合成这些寡核苷酸对，使得它们在退火时形成含有粘性末端的80
‑
90个碱基对的双链片段，例如合成该对中的各寡核苷酸以超出与该对中另一寡核苷酸互补的区域延伸3、4、5、6、7、8、9、10或更多个碱基。各寡核苷酸对的单链末端被设计为与另一寡核苷酸对的单链末端退火。使该寡核苷酸对退火，并随后使这些双链片段中的大约五至六个经由粘性单链末端一起退火，和随后它们连接在一起并克隆到标准细菌克隆载体中，例如可获自invitrogen corporation,carlsbad,calif的载体。随后通过标准方法对该构建体进行测序。制备数个由连接在一起的5至6个80至90个碱基对的片段(即大约500个碱基对的片段)组成的这些构建体，以使整个所需序列显示为一系列的质粒构建体。随后用适当的限制酶切割这些质粒的插入物，并连接在一起以形成最终构建体。最终构建体随后克隆到标准细菌克隆载体中，并进行测序。另外的方法对本领域技术人员会是显而易见的。此外，基因合成容易购得。
70.在一个实施方案中，将本文中描述的修饰的hsmn1基因工程化为可用于生成病毒载体和/或递送至宿主细胞的合适的遗传元件(载体)，例如裸dna、噬菌体、转座子、粘粒、游离基因等等，其传送在其上携带的hsmn1序列。所选载体可以通过任何合适的方法来递送，包括转染、电穿孔、脂质体递送、膜融合技术、高速dna包覆小球、病毒感染和原生质体融合。用于制造此类构建体的方法是核酸操作领域技术人员已知的，并包括基因工程、重组工程和合成技术。参见例如sambrook等人,molecular cloning:alaboratory manual,coldspring harbor press,cold spring harbor,ny。
71.在一方面，提供了包含该hsmn1核酸序列的表达盒。本文中所用的“表达盒”是指包含启动子hsmn1序列的核酸分子，并为此可以包括其它调节序列，该盒可以包装到病毒载体(例如病毒粒子)的衣壳中。通常，用于生成病毒载体的此类表达盒含有本文中描述的hsmn1序列，其侧接病毒基因组的包装信号，以及其它表达控制序列，如本文中描述的那些。例如，
对于aav病毒载体而言，包装信号是5’反向末端重复(itr)和3’itr。当包装到aav衣壳中时，与该表达盒结合的itrs在本文中被称为“重组aav(raav)基因组”或“载体基因组”。
72.由此，在一方面，提供了腺相关病毒载体，其包含aav衣壳和至少一种表达盒，其中所述至少一种表达盒包含编码smn1的核酸序列和引导smn1序列在宿主细胞中表达的表达控制序列。该aav载体还包含aav itr序列。在一个实施方案中，该itrs来自于与提供衣壳的不同的aav。在一个优选实施方案中，该itr序列来自aav2，或其缺失版本(δitr)，其可能因方便起见而使用并加速调节许可(regulatory approval)。但是，可以选择来自其它aav源的itr。当itr的源是来自aav2且aav衣壳来自另一aav源时，所得载体可以被称为是假型的。通常，aav载体基因组包含aav 5’itr(hsmn1编码序列和任何调节序列)以及aav 3’itr。但是，这些元件的其它构造可能是合适的。已经描述了其中缺失d
‑
序列和末端解析位点(trs)的5’itr的缩短版本(称为δitr)。在一些实施方案中，使用全长aav 5’和3’itrs。
73.在一方面，提供了一种构建体，其是可用于生成病毒载体的dna分子(例如质粒)。含有所需载体元件的说明性质粒包含如seq id no:9或10所示的多核苷酸序列。该seq id no:9所示的多核苷酸序列包含以下的核酸序列：巨细胞病毒早期增强子(cmve)元件(seq id no:9的nt 1
‑
287)，鸡β
‑
肌动蛋白(chicken beta
‑
actin，cba)启动子(seq id no:9的nt 288
‑
565)，杂合内含子(hybrid intron)(seq id no:9的nt 566
‑
793)，hsmn(seq id no:9的nt 822
‑
1706，共计885bp)，牛生长激素(bgh)基因的多聚腺苷酸(polya)(seq id no:9的nt 1742
‑
1966)。该seq id no:10所示的多核苷酸序列包含以下的核酸序列：巨细胞病毒早期增强子(cmve)元件(seq id no:10的nt 1
‑
287)，鸡β
‑
肌动蛋白(chicken beta
‑
actin，cba)启动子(seq id no:10的nt 288
‑
565)，杂合内含子(hybrid intron)(seq id no:10的nt 566
‑
793)，hsmn(seq id no:10的nt 822
‑
1706，共计885bp)，牛生长激素(bgh)基因的多聚腺苷酸(polya)(seq id no:10的nt 1742
‑
1966)。
74.使用本文中所述的其它合成hsmn1编码序列和本文中所述的其它表达控制元件可以生成其它表达盒。
75.该表达盒通常含有启动子序列作为表达控制序列的一部分，例如位于所选5’itr序列与该hsmn1编码序列之间。本文中描述的说明性质粒和载体使用含有巨细胞病毒早期增强子(cmve)和鸡β
‑
肌动蛋白(cba)启动子。或者，可以使用其它神经元特异性启动子[参见例如在http://chinook.uoregon.edu/promoters.html处访问的lockery lab神经元特异性启动子数据库]。此类神经元特异性启动子包括但不限于例如突触蛋白i(syn)、钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶ii、微管蛋白αi、神经元特异性烯醇化酶和血小板衍生生长因子β链启动子。参见hioki等人,gene therapy,2007年6月,14(11):872
‑
82,其经此引用并入本文。其它神经元特异性启动子包括67kda谷氨酸脱羧酶(gad67)、同源框dlx5/6、谷氨酸受体1(glur1)、前速激肽原1(tac1)启动子、神经元特异性烯醇化酶(nse)和多巴胺能受体1(drd1a)启动子。参见例如delzor等人,human gene therapy methods.2012年8月,23(4):242
‑
254。在另一实施方案中，该启动子是gusb启动子http://www.jci.org/articles/view/41615#b30。
[0076]
其它启动子如组成型启动子、可调型启动子[参见例如wo 2011/126808和wo2013/04943]，或响应生理信号(cues)的启动子可以用在本文中所述的载体中。该启动子可以选自不同的源，例如人巨细胞病毒(cmv)即时早期增强子/启动子、sv40早期增强子/启动子、
jc polymovirus启动子、髓鞘碱性蛋白(mbp)或胶质细胞原纤维酸性蛋白(gfap)启动子、单纯疱疹病毒(hsv
‑
1)潜伏相关启动子(lap)、劳斯肉瘤病毒(rsv)长末端重复(ltr)启动子、神经元特异性启动子(nse)、血小板衍生生长因子(pdgf)启动子、hsyn、黑色素浓集激素(mch)启动子、cba、基质金属蛋白酶启动子(mpp)与鸡β肌动蛋白启动子。
[0077]
除了启动子之外，表达盒和/或载体可以含有一种或多种其它合适的转录起始、终止、增强子序列、有效rna加工信号如剪接和聚腺苷酸化(polya)信号；稳定细胞质mrna的序列，例如wpre；增强翻译效率的序列(即kozak共有序列)；增强蛋白稳定性的序列；以及在需要时，增强编码产物分泌的序列。合适的polya序列的实例包括例如sv40、sv50、牛生长激素(bgh)、人生长激素和合成polya。合适的增强子的一个实例是cmv增强子。其它合适的增强子包括适于cns指示的那些。在一个实施方案中，该表达盒包含一种或多种表达增强子。在一个实施方案中，该表达盒含有两种或更多种表达增强子。这些增强子可以是相同的，或可以彼此不同。例如，增强子可以包括cmv即时早期增强子。这种增强子可以存在于彼此相邻定位的两个拷贝中。或者，该增强子的双拷贝可以通过一个或多个序列分隔。在又一实施方案中，该表达盒进一步含有内含子，例如鸡β肌动蛋白内含子。其它合适的内含子包括本领域中已知的那些，例如描述在wo 2011/126808中。任选地，可以选择一种或多种序列以稳定mrna。此类序列的一个实例是修饰的wpre序列，其可以在该polya序列的上游和该编码序列的下游工程化[参见例如ma zanta
‑
boussif等人,gene therapy(2009)16:605
‑
619]。
[0078]
这些控制序列“可操作地连接”到hsmn1基因序列上。本文中所用的术语“可操作地连接”是指与相关基因邻接的表达控制序列和以反式或在一定距离上起作用以控制相关基因的表达控制序列两者。
[0079]
腺相关病毒(aav)病毒载体是用于递送至靶细胞的具有核酸序列包装至其中的aav蛋白衣壳的aav dnase抗性粒子。aav衣壳由60个衣壳(帽)蛋白亚基vp1、vp2和vp3组成，其根据所选aav以大约1:1:10至1:1:20的比以二十面体对称排列。该aav衣壳可以选自本领域已知的那些，包括其变体。在一个实施方案中，该aav衣壳选自有效转导神经元细胞的那些。在一个实施方案中，该aav衣壳选自aav1、aav2、aav7、aav8、aav9、aavrh.10、aav5、aavhu.11、aav8dj、aavhu.32、aavhu.37、aavpi.2、aavrh.8、aavhu.48r3及其变体。参见royo等人,brain res,2008年1月,1190:15
‑
22；petrosyan等人,gene therapy,2014年12月,21(12):991
‑
1000；holehonnur等人,bmc neuroscience,2014,15:28；以及cearley等人,mol ther.2008年10月,16(10):1710
–
1718，其各自经此引用并入本文。本文中可用的其它aav衣壳包括aavrh.39、aavrh.20、aavrh.25、aav10、aavbb.1和aav bb.2及其变体。作为aav病毒载体(dnase抗性病毒粒子)的衣壳的源，可以选择其它aav血清型，包括例如aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav6.2、aav7、aav8、aav9、rh10、aavrh64r1、aavrh64r2、rh8、rh.10、任何已知或提及的aav的变体或尚待发现的aav。参见例如美国公开专利申请号2007
‑
0036760
‑
a1；美国公开专利申请号2009
‑
0197338
‑
a1；ep 1310571。还参见wo 2003/042397(aav7和其它猿猴aav)、美国专利7790449和美国专利7282199(aav8)、wo2005/033321和us 7,906,111(aav9)、以及wo 2006/110689和wo 2003/042397(rh.10)。或者，基于任何所述aav的重组aav可以用作aav衣壳的源。这些文献还描述了可以选择用于生成aav的其它aav，并经此引用并入。在一些实施方案中，用于该病毒载体的aav帽可以通过前述aav帽之一或其编码核酸的诱变(即通过插入、缺失或取代)来产生。在一些实施方案中，该aav衣壳是嵌
合的，包含来自两种或三种或四种或更多种前述aav衣壳蛋白的结构域。在一些实施方案中，该aav衣壳是来自两种或三种不同的aav或重组aav的vpl、vp2和vp3单体的嵌合体。在一些实施方案中，raav组合物包含超过一种的前述帽。如本文中所用，关于aav，术语变体是指衍生自已知aav序列的任何aav序列，包括在氨基酸或核酸序列上共享至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或更大的序列同一性的那些。在另一实施方案中，该aav衣壳包括与任何所述或已知aav衣壳序列包含至最多大约10％变异的变体。也就是说，该aav衣壳与本文中提供的和/或本领域已知的aav衣壳共享大约90％的同一性至大约99.9％的同一性、大约95％至大约99％的同一性、或大约97％至大约98％的同一性。在一个实施方案中，该aav衣壳与aav衣壳共享至少95％的同一性。当确定aav衣壳的百分比同一性时，可以对任何可变蛋白(例如vp1、vp2或vp3)进行该比较。在一个实施方案中，该aav衣壳与aav8 vp3共享至少95％的同一性。在另一实施方案中，使用自身互补型aav。
[0080]
在一个实施方案中，该衣壳是aav9衣壳或其变体。
[0081]
在一个实施方案中，提供了自身互补型aav。上下文中的缩写“sc”是指自身互补型。“自身互补型aav”是指其中重组aav核酸序列所携带的编码区被设计为形成分子内双链dna模板的构建体。在感染时而不是等待第二链的细胞介导合成，该scaav的两个互补半部将缔合以形成准备即时复制和转录的一个双链dna(dsdna)单元。参见例如d m mccarty等人,“self
‑
complementary recombinant adeno
‑
associated virus(scaav)vectorspromote efficient transduction independently of dna synthesis”,gene therapy(2001年8月),第8卷,第16期,第1248
‑
1254页。自身互补型aav描述在例如美国专利号6,596,535；7,125,717和7,456,683中，其各自经此引用全文并入本文。
[0082]
生成和分离适于递送至受试者的aav病毒载体的方法在本领域中是已知的。参见例如美国公开专利申请号2007/0036760(2007年2月15日)；美国专利7790449；美国专利7282199；wo 2003/042397；wo 2005/033321；wo 2006/110689和us 7588772 b2。在一种系统中，用编码侧接itr的转基因的构建体和编码rep与cap的构建体瞬时转染生产细胞系。在第二系统中，用编码侧接itr的转基因的构建体瞬时转染稳定提供rep和cap的包装细胞系。在各自这些系统中，aav病毒体响应于感染辅助腺病毒或疱疹病毒而产生，其中需要从污染病毒中分离raav。近来，开发了不需要用辅助病毒感染以回收aav的系统，由该系统以反式还提供了所需辅助功能(即腺病毒e1、e2a、va和e4或疱疹病毒ul5、ul8、ul52和ul29以及疱疹病毒聚合酶)。在这些较新的系统中，辅助功能可以通过用编码所需辅助功能的构建体瞬时转染该细胞来提供，或者该细胞可以被工程化以稳定含有编码该辅助功能的基因，其表达可以以转录水平或转录后水平来控制。在又一种系统中，通过用基于杆状病毒的载体感染将侧接itr的转基因和rep/cap基因引入到昆虫细胞中。对于这些生产系统的概述，通常参见例如zhang等人,2009,“adenovirus
‑
adeno
‑
associated virus hybrid for large
‑
scale recombinant adeno
‑
associated virus production”,human gene therapy 20:922
‑
929，其各自的内容经此引用全文并入本文。制造和使用这些和其它aav生产系统的方法还描述在下列美国专利中，其各自的内容经此引用全文并入本文：5,139,941；5,741,683；6,057,152；6,204,059；6,268,213；6,491,907；6,660,514；6,951,753；7,094,604；7,172,893；7,201,898；7,229,823和7,439,065。
[0083]
任选地，本文中所述的hsmn1基因可用于产生除raav之外的病毒载体。此类其它病毒载体可以包括适于可采用的基因疗法的任何病毒，包括但不限于腺病毒；疱疹病毒；慢病毒；逆转录病毒等等。合适地，当产生这些其它载体中的一种时，其作为复制缺陷型病毒载体产生。
[0084]“复制缺陷型病毒”或“病毒载体”是指合成或人工病毒粒子，其中含有相关基因的表达盒包装在病毒衣壳或包膜中，其中也包装在该病毒衣壳或包膜中的任何病毒基因组序列是复制缺陷的；即它们不能产生子代病毒体，但是保留了感染靶细胞的能力。在一个实施方案中，该病毒载体的基因组不包括编码复制所需的酶的基因(该基因组可以被工程化为“无内容”——仅含有侧接扩增和包装人工基因组所需信号的相关转基因)，但是这些基因可以在生产过程中提供。因此，其被认为对用于基因疗法是安全的，因为除了在复制所需病毒酶的存在下，复制和被子代病毒体感染不会发生。此类复制缺陷型病毒可以是腺相关病毒(aav)、腺病毒、慢病毒(整合或非整合)或另一合适的病毒源。
[0085]
本文中还提供的是药物组合物。本文中描述的药物组合物设计为通过任何合适的途径或不同途径的组合递送至需要其的受试者。在一个实施方案中，需要直接递送至cns并可经由鞘内注射来进行。术语“鞘内施用”是指靶向脑脊液(csf)的递送。这可以通过直接注射到脑室或腰椎csf中、通过枕下穿刺或通过其它合适的方法来完成。meyer等人,molecular therapy(2014年10月31日)证明了直接csf注射的功效，当使用与iv施用相比低10倍的剂量时，其导致在小鼠和非人灵长类的整个脊髓中的广泛的转基因表达。该文献经此引用并入本文。在一个实施方案中，该组合物经由脑室内病毒注射来递送(参见例如kim等人,j vis exp.2014年9月15日；(91):51863,其经此引用并入本文)。还参见passini等人,hum gene ther.2014年7月；25(7):619
‑
30,其经此引用并入本文。在另一实施方案中，该组合物经由腰椎注射来递送。
[0086]
通常，这些递送方法被设计为避免直接全身递送含有本文中所述的aav组合物的悬浮液。合适地，这可以具有与全身施用相比减少剂量、降低毒性和/或减少对aav和/或转基因产物的不期望的免疫反应的益处。
[0087]
或者，可以选择其它施用途径(例如口服、吸入、鼻内、气管内、动脉内、眼内、静脉内、肌内和其它肠胃外(parental)途径)。
[0088]
本文中描述的hsmn1递送构建体可以以单一组合物或多种组合物递送。任选地，可以递送两种或多种不同的aav[参见例如wo 2011/126808和wo 2013/049493]。在另一实施方案中，此类多种病毒可以含有不同的复制缺陷型病毒(例如aav、腺病毒和/或慢病毒)。或者，可以通过非病毒构建体，例如“裸dna”、“裸质粒dna”、rna和mrna来介导递送；与各种递送组合物和纳米粒子结合，包括例如胶束、脂质体、阳离子脂质
‑
核酸组合物、聚多糖(poly
‑
glycan)组合物和其它聚合物、基于脂质和/或胆固醇
‑
核酸缀合物，以及如本文中所述的其它构建体。参见例如x.su等人,mol.pharmaceutics,2011,8(3),第774
‑
787页；网络出版:2011年3月21日；wo2013/182683、wo 2010/053572和wo 2012/170930，其均经此引用并入本文，此类非病毒hsmn1递送构建体可以通过前述途径施用。
[0089]
该病毒载体，或非病毒dna或rna转移部分，可以用生理可接受载体配制以用于基因转移和基因疗法应用。可以选择多种合适的纯化方法。描述适于从载体粒子中分离空衣壳的纯化方法的实例，例如2016年12月9日提交的国际专利申请号pct/us16/65976及其优
先权文件，2016年4月13日提交的美国专利申请号62/322,098和2015年12月11日提交的且题为“scalable purification method for aav8”的美国专利申请号62/266,341中描述的方法，其经此引用并入本文。还参见以下文献中描述的纯化方法：2016年12月9日提交的国际专利申请号pct/us16/65974，及其优先权文件，2016年4月13日提交的美国专利申请号62/322,083，和2015年12月11日提交的62/266,351(aav1)；2016年12月9日提交的国际专利申请号pct/us16/66013，及其优先权文件，2016年4月13日提交的美国临时申请号62/322,055和2015年12月11日提交的62/266,347(aavrh10)；和2016年12月9日提交的国际专利申请号pct/us16/65970，及其优先权申请美国临时申请号62/266,357和62/266,357(aav9)，其经此引用并入本文。简而言之，描述了两步骤纯化方案，其从raav生产细胞培养物的澄清浓缩上清液中选择性捕获并分离含有基因组的raav载体粒子。该方法利用了在高盐浓度下进行的亲和捕获方法，随后是在高ph下进行的阴离子交换树脂方法，以提供基本不含raav中间体的raav载体粒子。
[0090]
在aav病毒载体的情况下，病毒基因组(vg)的定量可以用作制剂中所含剂量的量度。以本文公开的方法施用的raav的剂量将根据例如特定的raav、施用方式、治疗目标、个体和靶向的细胞类型而变化，并且可以通过本领域标准方法确定。剂量可以以病毒基因组(vg)为单位表示(即，分别为1
×
107vg、1
×
108vg、1
×
109vg、1
×
10
10
vg、1
×
10
11
vg、1
×
10
12
vg、1
×
10
13
vg、1
×
l0
14
vg、1
×
10
15
vg)。剂量也可以以每千克(kg)体重的病毒基因组(vg)为单位表示(即，分别为1
×
10
10
vg/kg、1
×
10
11
vg/kg、1
×
10
12
vg/kg、1
×
10
13
vg/kg、1
×
10
14
vg/kg、1
×
10
15
vg/kg)。滴定aav的方法描述于clark等人《人类基因治疗(hum.genether.)》1999年；10:1031
‑
1039。
[0091]
这些上述剂量可以在各种体积的载体、赋形剂或缓冲剂制剂中施用，所述体积在大约25至大约1000微升的范围内，包括该范围内的所有数字，取决于待处理的区域的尺寸、所用病毒滴度、施用途径和该方法的预期效果。在一个实施方案中，载体、赋形剂或缓冲剂的体积为至少大约25μl。在一个实施方案中，该体积为大约50μl。在另一实施方案中，该体积为大约75μl。在另一实施方案中，该体积为大约100μl。在另一实施方案中，该体积为大约125μl。在另一实施方案中，该体积为大约150μl。在另一实施方案中，该体积为大约175μl。在又一实施方案中，该体积为大约200μl。在另一实施方案中，该体积为大约225μl。在又一实施方案中，该体积为大约250μl。在又一实施方案中，该体积为大约275μl。在又一实施方案中，该体积为大约300μl。在又一实施方案中，该体积为大约325μl。在另一实施方案中，该体积为大约350μl。在另一实施方案中，该体积为大约375μl。在另一实施方案中，该体积为大约400μl。在另一实施方案中，该体积为大约450μl。在另一实施方案中，该体积为大约500μl。在另一实施方案中，该体积为大约550μl。在另一实施方案中，该体积为大约600μl。在另一实施方案中，该体积为大约650μl。在另一实施方案中，该体积为大约700μl。在另一实施方案中，该体积在大约700和1000μl之间。
[0092]
在其它实施方案中，可以选择大约1μl至150ml的体积，对成人选择更高的体积。通常，对新生婴儿，合适的体积为大约0.5ml至大约10ml，对年龄较大的婴儿可以选择大约0.5ml至大约15ml。对于学步的幼儿，可以选择大约0.5ml至大约20ml的体积。对于儿童，可以选择至最高大约30ml的体积。对于青春期前和青春期的儿童，可以选择至最高大约50ml的体积。在又一实施方案中，患者可以接受鞘内施用，选择大约5ml至大约15ml，或大约
7.5ml至大约10ml的体积。可以确定其它合适的体积和剂量。将调节该剂量以平衡治疗益处与任何副作用，并且此类剂量可以根据使用该重组载体的治疗应用而变。
[0093]
上述重组载体可以根据公开的方法递送至宿主细胞。该raav，优选悬浮在生理相容性载体中，可以施用于人或非人哺乳动物患者。在另一实施方案中，该组合物包括载体、稀释剂、赋形剂和/或佐剂。合适的载体可以由本领域技术人员鉴于转移病毒针对的适应症容易地选择。例如，合适的载体包括盐水，其可以用多种缓冲溶液(例如磷酸盐缓冲盐水)配制。其它示例性载体包括无菌盐水、乳糖、蔗糖、磷酸钙、明胶、葡聚糖、琼脂、果胶、花生油、芝麻油和水。该缓冲剂/载体应包括防止raav附着到输注管但不会干扰raav体内结合活性的组分。
[0094]
任选地，本发明的组合物除了raav与载体之外可以含有其它常规药物成分，如防腐剂或化学稳定剂。合适的示例性防腐剂包括氯丁醇、山梨酸钾、山梨酸、二氧化硫、没食子酸丙酯、对羟基苯甲酸酯类、乙基香草醛、甘油、苯酚和对氯苯酚。合适的化学稳定剂包括明胶和白蛋白。
[0095]
本发明的组合物可以包含如上定义的药学上可接受的载体。合适地，本文中描述的组合物包含悬浮在药学上合适的载体中和/或与合适的赋形剂混合的有效量的一种或多种aav，其设计为经由注射、渗透泵、鞘内导管递送至受试者，或通过另一装置或途径递送。在一个实例中，该组合物配制用于鞘内递送。在一个实施方案中，鞘内注射包括注入椎管，例如蛛网膜下隙。
[0096]
本文中描述的病毒载体可用于制备药物以便将hsmn1递送至需要其的受试者(例如人患者)、向受试者提供功能性smn和/或治疗脊髓性肌萎缩。治疗过程可以任选包括重复施用相同的病毒载体(例如aav9载体)或不同的病毒载体(例如aav9和aav10)。仍可以使用本文中描述的病毒载体和非病毒递送系统选择其它组合。
[0097]
本文中描述的hsmn1 cdna序列可以使用本领域中熟知的技术体内合成产生。例如，可以采用长dna序列方法的基于pcr的精确合成(pas)，如xiong等人,pcr
‑
basedaccurate synthesis of long dna sequences,nature protocols 1,791
‑
797(2006)所述。由young和dong描述了结合双不对称pcr和重叠延伸pcr法的方法，two
‑
step totalgene synthesis method,nucleic acids res.2004；32(7):e59。还参见gordeeva等人,j microbiol methods.improved pcr
‑
based gene synthesis method and itsapplication to the citrobacter freundii phytase gene codon modification.2010年5月；81(2):147
‑
52.epub 2010年3月10日；还参见关于寡核苷酸合成和基因合成的以下专利，gene seq.2012年4月；6(1):10
‑
21；us 8008005和us 7985565。这些文献各自经此引用并入本文。此外，经由pcr生成dna的试剂盒与方案是市售可得的。这些包括使用聚合酶，包括但不限于taq聚合酶；(new england biolabs)；high
‑
fidelity dna聚合酶(new england biolabs)；和g2聚合酶(promega)。还可以由用含有本文中所述的hsmn序列的质粒转染的细胞生成dna。试剂盒和方案是已知和市售可得的，并包括但不限于qiagen质粒试剂盒；pro filter质粒试剂盒(invitrogen)；和质粒试剂盒(sigma aldrich)。在本文中可用的其它技术包括序列特异性等温扩增方法，其消除了对热循环的需要。这些方法通常使用链置换dna聚合酶如bst dna聚合酶、大片段(large fragment)(new england biolabs)而非加热来分离双链
体dna。dna还可以经由使用逆转录酶(rt)通过扩增由rna分子生成，所述逆转录酶是rna依赖性dna聚合酶。rt聚合与原始rna模板互补的dna链，并被称为cdna。这种cdna随后可以通过pcr或如上所述的等温法进一步扩增。定制dna也可以经商业途径由公司生成，所述公司包括但不限于genscript；包括但不限于genscript；(life technologies)和integrated dnatechnologies。
[0098]
术语“表达”在本文中以其最广泛的含义使用，并包括生产rna或rna和蛋白。就rna而言，术语“表达”或“翻译”特别涉及生产肽或蛋白。表达可以是瞬时的，或可以是稳定的。
[0099]
在本发明上下文中的术语“翻译”涉及在核糖体处的过程，其中mrna链控制氨基酸序列的组装以生成蛋白或肽。
[0100]
根据本发明，如本文中所述递送“治疗有效量”的hsmn1以实现期望的结果，即治疗sma或其一种或多种症状。如本文中所述，期望的结果包括减轻肌无力、提高肌肉强度和张力(tone)、预防或减少脊柱侧凸、或保持或提高呼吸健康、或减少震颤或颤搐。其它期望的终点可以由医生来确定。
[0101]
在一些情况下，在怀孕约30至36周时在胎儿中检测到sma。在这种情况下，可能期望的是在分娩后尽可能快地治疗新生儿。还可能期望地在子宫内治疗胎儿。由此，提供了挽救和/或治疗具有sma的新生儿受试者的方法，包括向新生受试者(例如人患者)的神经元细胞递送hsnm1基因的步骤。提供了挽救和/或治疗具有sma的胎儿的方法，包括向子宫内的胎儿的神经元细胞递送hsnm1基因的步骤。在一个实施方案中，该基因在本文中所述的组合物中经由鞘内注射来递送。该方法可以利用编码功能性hsmn蛋白的任何核酸序列，无论是本文中所述的密码子优化的hsmn1还是天然hsmn1，或是与“野生型”蛋白相比具有增强活性的hsmn1等位基因，或其组合。在一个实施方案中，在子宫内的治疗定义为在胎儿中检测sma后施用如本文中所述的hsmn1构建体。参见例如david等人,recombinant adeno
‑
associatedvirus
‑
mediated in utero gene transfer gives therapeutic transgene expressionin the sheep,hum gene ther.2011年4月；22(4):419
‑
26.doi:10.1089/hum.2010.007.epub 2011年2月2日，其经此引用并入本文。
[0102]
在一个实施方案中，新生儿治疗定义为在分娩的8小时、头12小时、头24小时或头48小时内施用本文中所述的hsmn1构建体。在另一实施方案中，特别是对于灵长类(人或非人)，新生儿分娩在大约12小时至大约1周、2周、3周或大约1个月的时间内，或在大约24小时至大约48小时后。
[0103]
在另一实施方案中，对于迟发性sma，该组合物在症状发作后递送。在一个实施方案中，在生命的第一年之前开始患者的治疗(例如首次注射)。在另一实施方案中，在头一年之后、或在2至3岁后、在5岁后、在11岁后、或在更大年龄之后开始治疗。
[0104]
在另一实施方案中，该构建体在晚些时候重新施用。任选地，允许超过一次的重新施用。此类重新施用可以具有相同类型的载体、不同的病毒载体、或经由本文中所述的非病毒递送。例如，如果用编码smn的raav9治疗患者，并需要二次治疗的话，可以随后施用raav10，并且反之亦然。
[0105]
sma患者的治疗可能需要联合疗法，如在用本发明的组合物治疗之前、期间和/或之后用免疫抑制剂瞬时共治疗。用于此类共疗法的免疫抑制剂包括但不限于类固醇、抗代谢物、t细胞抑制剂和烷化剂。例如，此类瞬时治疗可以包括以递减剂量每日一次服用类固
醇(例如泼尼松(prednisole))7天，开始为大约60毫克的量，且每天减少10毫克(第7天无剂量)。可以选择其它剂量和免疫抑制剂。
[0106]“功能性hsmn1”是指编码天然smn蛋白的基因，如seq id no:8所示的基因，或提供运动神经元蛋白天然存活的至少大约50％、至少大约75％、至少大约80％、至少大约90％或大致相同、或超过100％的生物活性水平的另一smn蛋白，或其与疾病无关的天然变体或多形体。此外，smn1同源染色体——smn2，也编码该smn蛋白，但是较少有效地处理功能性蛋白。基于smn2的拷贝数，缺乏功能性hsmn1基因的受试者显示出不同程度的sma。由此，对于一些受试者，可能期望的是smn蛋白提供低于100％的天然smn蛋白的生物活性。
[0107]
在一个实施方案中，此类功能性smn具有与天然蛋白或seq idno:8所示基因编码的蛋白的全长序列具有大约95％或更大的同一性的序列，或在氨基酸水平与seq id no:8所示基因编码的蛋白具有大约97％或更大，或大约99％或更大的同一性。此类功能性smn蛋白还可以包括天然多形体。可以通过制备序列的比对并通过使用多种本领域中已知或市售可得的算法和/或计算机程序来确定该同一性[例如blast、expasy；clustalo；fasta；使用例如needleman
‑
wunsch算法、smith
‑
waterman算法]。
[0108]
存在多种用于体外测量smn表达和活性水平的测定法。参见例如上文引用的tanguy等人,2015。本文中描述的方法还可以与任何其它用于治疗sma或其症状的疗法结合。也参见wang等人,consensus statement for standard of care in spinalmuscular atropy(其提供了关于sma的当前护理标准的讨论)以及http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/nbk1352/。例如，当在sma中担心营养时，放置胃造口管是合适的。随着呼吸功能的恶化，提供气管切开术或无创呼吸支持。睡眠呼吸障碍可以通过在夜间使用持续气道正压来治疗。如果用力肺活量大于30％
‑
40％，可以安全地进行患有sma ii与sma iii的个体的脊柱侧凸手术。电动椅和其它设备可以提高生活质量。也参见美国专利号8211631，其经此引用并入本文。
[0109]
要注意的是，术语“一种”或“一个”是指一种(个)或多种(个)。由此，术语“一种”(或“一个”)、“一种或多种”和“至少一种”在本文中可互换使用。
[0110]
词语“包含(comprise、comprises和comprising)”应解释为包含性的而非排他性的。词语“组成(consist、consisting)”及其变体应解释为排他性的而非包含性的。虽然说明书中的各种实施方案出现使用“包含”的语言，但是在其它情况下，相关实施方案也意在使用“由
……
组成”或“基本由
……
组成”的语言来解释和描述。
[0111]
本文中所用的术语“大约”是指与给定的参考值相差10％(
±
10％)，除非另行规定。
[0112]
本文中所用的“疾病”、“障碍”和“病症”可互换使用，以指示受试者体内的异常状态。
[0113]
除非在本说明书中另行定义，本文中使用的技术和科学术语具有与本领域普通技术人员，并且通过参照公开文本通常理解的相同的含义，其向本领域技术人员提供了对许多本技术中使用的术语的一般指导。
[0114]
ii.具体实施方式
[0115]
在一方面，本发明提供了一种重组核酸分子，其包含可操作连接的启动子、杂合内含子、编码功能性运动神经元存活蛋白的核酸序列。
[0116]
优选地，所述启动子是cag启动子，其包含巨细胞病毒早期增强子元件和鸡β
‑
肌动蛋白启动子；所述杂合内含子序列如seq id no:3所示。
[0117]
优选地，所述巨细胞病毒早期增强子元件具有选自以下的多核苷酸序列：
[0118]
1)seq id no:1所示多核苷酸序列；
[0119]
2)seq id no:1所示多核苷酸序列经过取代、缺失或添加一个或多个核苷酸而得到的核苷酸序列；或
[0120]
3)与seq id no:1具有80％以上序列同一性的多核苷酸序列，优选具有85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％以上同一性的序列；更优选地，具有98％或99％以上同一性的序列；
[0121]
优选地，所述鸡β
‑
肌动蛋白启动子具有选自以下的多核苷酸序列：
[0122]
1)seq id no:2所示多核苷酸序列；
[0123]
2)seq id no:2所示多核苷酸序列经过取代、缺失或添加一个或多个核苷酸而得到的核苷酸序列；或
[0124]
3)与seq id no:2具有80％以上序列同一性的多核苷酸序列，优选具有85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％以上同一性的序列；更优选地，具有98％或99％以上同一性的序列。
[0125]
优选地，所述编码功能性运动神经元存活蛋白的核酸序列具有选自以下的多核苷酸序列：
[0126]
1)seq id no:6或seq id no:8所示多核苷酸序列；
[0127]
2)seq id no:6或seq id no:8所示多核苷酸序列经过取代、缺失或添加一个或多个核苷酸而得到的核苷酸序列；或
[0128]
3)与seq id no:6或seq id no:8具有80％以上序列同一性的多核苷酸序列，优选具有85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％以上同一性的序列；更优选地，具有98％或99％以上同一性的序列；
[0129]
更优选地，所述多核苷酸序列是密码子优化的序列。
[0130]
优选地，所述重组核酸分子还包含多聚腺苷酸、kozak序列、wpre和转录后调节元件中的一种或多种；其中，所述多聚腺苷酸具有选自以下的多核苷酸序列：
[0131]
1)seq id no:7所示多核苷酸序列；
[0132]
2)seq id no:7所示多核苷酸序列经过取代、缺失或添加一个或多个核苷酸而得到的核苷酸序列；或
[0133]
3)与seq id no:7具有80％以上序列同一性的多核苷酸序列，优选具有85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％以上同一性的序列；更优选地，具有98％或99％以上同一性的序列。
[0134]
优选地，所述重组核酸分子包含seq id no:4所示的多核苷酸序列；优选地，所述重组核酸分子具有选自以下的多核苷酸序列：
[0135]
1)seq id no:9或seq id no:10所示多核苷酸序列；
[0136]
2)seq id no:9或seq id no:10所示多核苷酸序列经过取代、缺失或添加一个或多个核苷酸而得到的核苷酸序列；或
[0137]
3)与seq id no:9或seq id no:10具有80％以上序列同一性的多核苷酸序列，优
选具有85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％以上同一性的序列；更优选地，具有98％或99％以上同一性的序列。
[0138]
优选地，所述重组核酸分子还包含aav反向末端重复序列；优选地，所述aav反向末端重复序列选自不同血清型的aav；优选地，所述aav反向末端重复序列选自进化支a
‑
f中的任意血清型的aav或aav1型、aav2型、aav3型、aav4型、aav5型、aav6型、aav7型、aav8型、aav9型或其杂交/嵌合型中的任意一个；更优选地，所述aav反向末端重复序列来自aav2型。
[0139]
在一方面，本发明提供一种重组载体，其包含前述的重组核酸分子，其中所述载体选自质粒载体、噬菌体载体和病毒载体组，其中病毒载体选自腺相关病毒载体、腺病毒载体、慢病毒载体和杂合病毒载体组。
[0140]
在一方面，本发明提供了一种重组腺相关病毒，其中所述重组腺相关病毒包含aav衣壳和载体基因组，所述载体基因组包含aav反向末端重复序列、编码运动神经元存活蛋白的核酸序列和引导smn在宿主细胞中表达的表达控制序列；优选地，所述重组腺相关病毒的衣壳优选aav9，更有选地，所述重组腺相关病毒为自身互补腺相关病毒。
[0141]
在一方面，本发明提供了一种分离的宿主细胞，其包含前述的重组核酸分子、重组载体或重组腺相关病毒。
[0142]
在一方面，本发明提供了一种药物组合物，其包含前述的重组核酸分子、重组载体、重组腺相关病毒和/或宿主细胞以及药学上可接受的赋形剂；优选地，其被配制用于静脉内给药。
[0143]
在一方面，本发明提供了前述的重组核酸分子、重组载体、重组腺相关病毒、宿主细胞和/药物组合物在制备用于预防或治疗脊髓性肌萎缩的药物中的用途。
[0144]
根据前一方面的用途，其中所述重组核酸分子、重组载体、重组腺相关病毒、宿主细胞和/或药物组合物可以与另一疗法结合施用。
[0145]
根据前一方面的用途，其中，所述重组核酸分子、重组载体、重组腺相关病毒、宿主细胞和/或药物组合物可以以大约1
×
10
10
vg/kg至大约1
×
10
16
vg/kg的剂量施用；优选地，所述重组腺相关病毒可以以大约5
×
10
13
vg/kg的剂量施用；优选地，所述重组腺相关病毒或组合物可以以大约2.5
×
10
12
vg/kg的剂量施用；优选地，所述载体或组合物可以施用超过一次。
[0146]
在一方面，本发明提供了在受试者中治疗脊髓性肌萎缩的方法，所述方法包括向需要其的受试者施用前述的重组核酸分子、重组载体、重组腺相关病毒、宿主细胞和/或药物组合物。优选地，所述组合物鞘内施用；优选地，所述受试者是哺乳动物；更优选地，所述受试者是人。
[0147]
下面的实施例仅仅是说明性的，而非意在限制本发明。
[0148]
实施例1质粒构建
[0149]
使用双链aav病毒的穿梭质粒psc
‑
cmv做为质粒构建的骨架，其质粒图谱如图1所示。在两端反向末端重复序列(itr)之间插入包含启动子、内含子、目的基因cdna和牛生长激素(bgh)的多聚腺苷酸(polya)的片段。插入片段的启动子为两种，一种为cag启动子，另一种为组织特异性启动子3xnrse
‑
pgk。以插入目的基因egfp为例，该插入片段的主体结构如图2所示。
[0150]
1.1设计和构建质粒l
‑
s1、l
‑
g1和l
‑
ors1
[0151]
设计包含cag启动子和杂合内含子(hybrid intron)的基因片段，其中，cag启动子由巨细胞病毒早期增强子元件(cytomegalovirus early enhancer element，cmve)和鸡β
‑
肌动蛋白(chicken beta
‑
actin，cba)启动子组成，cmve元件和杂合内含子序列分别来自pspcas9(bb)
‑
2a
‑
gfp(px458)质粒；cba序列源自psnav2.0
‑
cag
‑
egfp质粒(图谱如图3所示)的启动子区域(249
‑
526bp)。其中，巨细胞病毒早期增强子元件(以下简称为cmve)的多核苷酸序列如seq id no:1所示；鸡β
‑
肌动蛋白启动子(以下简称为cba启动子)的多核苷酸序列如seq id no:2所示；杂合内含子(hybrid intron)的多核苷酸序列如seq id no:3所示。
[0152]
合成包含cag启动子
‑
杂合内含子区域(其多核苷酸序列如seq id no:4所示)、编码绿色荧光蛋白gfp的基因(其多核苷酸序列如seq id no:5所示)或编码区优化后的smn基因(其多核苷酸序列如seq id no:6所示)和牛生长激素(bovine growth horomone,bgh)基因的多聚腺苷酸(polya)区域(其多核苷酸序列如seq id no:7所示)顺次连接的基因片段，并在该基因片段的5'端添加avai酶切位点及3'端添加hindiii酶切位点。利用这两个酶切位点将该基因片段克隆至质粒psc
‑
cmv，构建而成的质粒分别命名为l
‑
s1(编码区优化后的smn基因)和l
‑
g1(绿色荧光蛋白gfp基因)；然后将直接合成的5'端含有bamhi酶切位点和3'端含有hindiii酶切位点的人smn cdna序列(genebank nm_000344.3)通过双酶切克隆至经过同样双酶切的l
‑
s1质粒，由野生型的smn基因(其多核苷酸序列如seq id no:8所示)代替优化的smn基因，该重组质粒命名为l
‑
ors1。其中，质粒l
‑
ors1含有的多核苷酸序列如seq id no:9所示；质粒l
‑
s1含有的多核苷酸序列如seq id no:10所示；质粒l
‑
g1的多核苷酸序列如seq id no:11所示。
[0153]
1.2设计及构建质粒l
‑
s2和l
‑
g2
[0154]
设计包含3xnrse
‑
cmve
‑
pgk
‑
杂合内含子的基因片段，其中，3xnrse为rattus norvegicus neural
‑
restrictive silencer element(scg
‑
10)gene(genebank m90489.1，629至649bp)序列的3个神经限制性沉默元件(nrse)的重复序列(m90489.1的多核苷酸序列如seq id no:12所示)，cmve为巨细胞病毒早期增强子元件，pgk为磷酸甘油激酶(phosphoglycerate kinase，pgk)的核心启动子(其多核苷酸序列如seq id no:13所示)，cmve元件(其多核苷酸序列如seq id no:1所示)和杂合内含子序列(其多核苷酸序列如seq id no:3所示)来自pspcas9(bb)
‑
2a
‑
gfp(px458)质粒，pgk序列源自小鼠磷酸甘油激酶1基因(genebank m18735，834
‑
1025bp)。
[0155]
合成包含3xnrse
‑
cmve
‑
pgk
‑
杂合内含子区域、绿色荧光蛋白gfp基因或编码区优化后的smn基因和bgh的polya区域顺次连接的基因片段，并在该基因片段的5'端添加avai酶切位点及3'端添加hindiii酶切位点。利用这两个酶切位点将该基因片段克隆至质粒psc
‑
cmv，构建而成的质粒分别命名为l
‑
s2(编码区优化后的smn基因)和l
‑
g2(绿色荧光蛋白gfp基因)。
[0156]
1.3构建质粒l
‑
s3和l
‑
g3
[0157]
通过pcr在l
‑
g1和l
‑
s1质粒的多克隆位点上引入kpn i/xho i酶切位点，通过kpn i/xho i双酶切质粒psnav2.0
‑
cag
‑
egfp，cag启动子
‑
chicken beta actin内含子(cag内含子)被切出、回收(其多核苷酸序列如seq id no:14所示)，并将其分别克隆入经过同样双酶切的l
‑
g1和l
‑
s1质粒以取代该质粒中的cag启动子
‑
杂合内含子区域(其多核苷酸序列如seq id no:4所示)，所得到的重组质粒分别称为l
‑
s3和l
‑
g3。
[0158]
1.4设计及构建质粒l
‑
s4、l
‑
ors4和l
‑
g4
[0159]
设计cag启动子
‑
sv40 mini内含子的基因片段，其中，cmve为巨细胞病毒早期增强子元件(其多核苷酸序列如seq id no:1所示)，来自pspcas9(bb)
‑
2a
‑
gfp(px458)质粒；cba序列源自psnav2.0
‑
cag
‑
egfp质粒的启动子区域(249
‑
526bp)，其多核苷酸序列如seq id no:2所示；sv40mini内含子源自simian virus 40strain 777基因组(genebank序列号af332562.1，430至489和1338至1425，af332562.1的多核苷酸序列如seq id no:15所示。
[0160]
合成cag启动子
‑
sv40 mini内含子区域片段，并在其5'端和3'端分别引入xho i和bamh i酶切位点。利用这两个酶切位点将cag启动子
‑
sv40 mini内含子区域克隆至质粒l
‑
s1以取代该质粒中cag启动子
‑
杂合内含子区域(其多核苷酸序列如seq id no:4所示)，该重组质粒命名为l
‑
s4。将合成的野生型的smn cdna基因(其多核苷酸序列如seq id no:8所示)通过其5’bamh i酶切位点和3’ecorv酶切位点克隆至质粒l
‑
s4，构建重组质粒命名l
‑
ors4。同理，利用酶切位点bamh i和hind iii将绿色荧光蛋白gfp基因(其多核苷酸序列如seq id no:5所示)克隆至质粒l
‑
s4以代替smn基因，构建的重组质粒命名为l
‑
g4。
[0161]
1.5设计及构建质粒l
‑
s5和l
‑
g5
[0162]
设计cag启动子
‑
cag内含子1+2+外显子1的基因片段，其中，cag内含子1+2+外显子1序列源自gallus cytoplasmic beta
‑
actin gene(genebank x00182,634
‑
1596bp，x00182的多核苷酸序列如seq id no:16所示)。
[0163]
合成cag启动子
‑
cag内含子1+2+外显子1的基因片段，并在其5'端和3'端分别引入xho i和bamh i酶切位点。利用酶切位点xho i和bamh i将该合成片段克隆至质粒l
‑
s1以替代cag启动子
‑
杂合内含子基因片段，构建的重组质粒命名为l
‑
s5。同理，利用bamh i和hind iii双酶切将gfp基因(其多核苷酸序列如seq id no:5所示)克隆至质粒l
‑
s5，构建的重组质粒命名为l
‑
g5。
[0164]
1.6构建l
‑
s7、l
‑
g7和l
‑
ors7
[0165]
在引物中引入xho i和bamh i酶切位点，pcr扩增cag启动子基因片段(其多核苷酸序列如seq id no:17所示，通过xho i和bamh i双酶切将该基因片段克隆至质粒l
‑
s1以替代cag启动子
‑
杂合内含子基因片段，构建的重组质粒命名为l
‑
s7。同理，将cag启动子基因片段克隆至质粒l
‑
g1以替代cag启动子
‑
杂合内含子基因片段，构建的重组质粒命名为l
‑
g7。通过酶切位点bamh i和ecor v双酶切l
‑
ors1重组质粒，将野生型smn基因(其多核苷酸序列如seq id no:8所示)克隆到l
‑
s7质粒中，构建的重组质粒命名为l
‑
ors7。
[0166]
实施例2病毒包装和基因组滴度检测
[0167]
本实施例采用hek293细胞(购于atcc，其编号为crl
‑
1573)作为生产细胞系，常规三质粒包装系统生产重组aav病毒载体。所使用实验方法均为本领域常规方法(参见xiao xiao,juan li,and richard jude samulski.production of high
‑
titer recombinant adeno
‑
associated virus vectors in the absence of helper adenovirus.j.virol.1998,72(3):2224)。
[0168]
取适量纯化aav样品，按下表(表1)配制dnase i消化反应混合液，37℃孵育30min，75℃孵育10min，失活dnase i。
[0169]
表1
[0170][0171][0172]
处理后的aav纯化样品稀释适当的倍数后，参照下表(表2)配置q
‑
pcr反应体系，并按照下列程序进行检测。
[0173]
表2
[0174][0175]
其中使用的引物参见下表(表3)：
[0176]
表3
[0177]
正向引物(5
’‑3’
)gtcaatgacggtaaatgg反向引物(5
’‑3’
)gtaatagcgatgactaatacg
[0178]
包装产量结果参见下表(表4)：
[0179]
表4
[0180][0181]
实施例3候选药物的选择
[0182]
3.1启动子的选择和感染效率
[0183]
为了确认cag启动子和组织特异性启动子3xnrse
‑
pgk中哪种的启动子适合目的基因的表达，将l
‑
g1和l
‑
g2分别在293细胞中表达，24小时后观察gfp的表达，发现l
‑
g1样品的gfp表达效率明显高于l
‑
g2，如图4a，说明cag启动子驱动目的基因表达的能力高于3xnrse
‑
pgk启动子。
[0184]
由于3xnrse表达元件在神经元细胞中的表达具有选择性，为了验证本发明中的
3xnrse
‑
pgk表达特异性，分别将l
‑
g1和l
‑
g2在pc12细胞中表达，24小时后，检测两个表达样品的细胞中，facs分析l
‑
g1的gfp表达细胞比例为35％，l
‑
g2的gfp表达细胞比例为24％(如图4b)，由此可见，gfp的比例没有明显差别。
[0185]
将scaav2/9
‑
l
‑
g1和scaav2/9
‑
l
‑
g2包装成病毒，上述两种病毒分别以相同的moi感染pc12细胞，检测gfp的表达，如图4c所示，l
‑
g1病毒的感染效率明显较l
‑
g2高，l
‑
g2的感染能力很低。该结果提示，在同样的病毒总量下，scaav2/9
‑
l
‑
g1感染细胞的效率较高。基于表达强度和表达特异性的选择，cag启动子是优选的启动子。
[0186]
3.2.不同内含子元件及smn编码基因的选择及其对活性的影响
[0187]
为了更优化地表达目的基因smn，选取不同的内含子元件及不同的目的基因smn，其中，目的基因smn做了以下两种选择：(1)密码子优化的smn基因的序列，命名为l
‑
s1；和(2)野生型smn基因的原始序列，命名为l
‑
ors1。
[0188]
按实施例2所示的方法，制备了以下5组重组质粒：(1)l
‑
s1、l
‑
ors1和l
‑
g1；(2)l
‑
s3和l
‑
g3；(3)l
‑
s4、l
‑
ors4和l
‑
g4；(4)l
‑
s5和l
‑
g5；以及(5)l
‑
s7、l
‑
ors7和l
‑
g7。5组不同mini intron元件的重组质粒结构图如图5所示。
[0189]
分别将这些重组质粒转染293细胞和pc12细胞，检测这些不同分子结构对smn分子的表达的影响。分别将这些重组质粒转染293细胞和成纤维细胞，检测这些不同分子结构对其增殖生物学活性的影响。根据上述检测结果来最终确定所要选择的药物结构。
[0190]
将以上各组质粒分别转染293细胞和pc12细胞，转染48小时后，提取cdna，检测rna表达水平，由图6a和图6b(图6a代表pc12细胞，图6b代表293细胞)来看，smn均得以表达，但所有l
‑
ors样品中表达的smn分子没有异构体，而l
‑
s1样品表达的smn目的分子包含两个片段，37kd和20kd，比预计的37kd多了一条带，推测可能是smn分子的异构体，l
‑
ors1样品表达的smn水平稍高。
[0191]
将以上各组质粒分别转染293细胞，检测其对293细胞增殖活性的影响。由图7a可知，含有杂合内含子表达框的重组质粒(l
‑
s1和l
‑
ors1)对293细胞增殖活性的影响明显高于其他含有不同内含子表达框的重组质粒(l
‑
s3、l
‑
s4、l
‑
ors4、l
‑
s5)及不含有内含子的表达框的重组质粒(l
‑
s7、l
‑
ors7)。
[0192]
这一结论也在将上述含有不同内含子表达框的重组质粒(l
‑
ors1、l
‑
ors4、l
‑
ors7)包装成重组病毒后感染原代成纤维细胞中得以验证，如图7b所示。
[0193]
通过上述研究，初步选择重组病毒l
‑
s1和l
‑
ors1做为候选药物。
[0194]
实施例4 smn分子表达水平及转录活性测定
[0195]
为了确定候选基因药物的表达，通过稳定的体外检测方法，包括内源性smn
△
7表达较低的病人成纤维细胞中感染候选药物以从rna水平和蛋白水平检测smn表达；通过gem body形成实验检测其转录活性。
[0196]
4.1候选药物增能强smn分子在rna水平上表达
[0197]
提取细胞总rna，逆转录为cdna，进行real
‑
time pcr反应。其中每对引物设3个复孔，内参为gapdh，每个反应体系20μl，cdna 10ng/反应，primer
‑
f(s
‑
full
‑
f/s
‑7‑
f)0.4μl，primer
‑
r 0.4μl，probe 0.3μl；引物序列具体见下表(表5)：
[0198]
表5
[0199][0200]
pcr产物电泳成像观察，pcr反应后的数据用2
‑△△
ct
法计算相对表达值，通过spss13.0统计分析。
[0201]
研究正常细胞对照组、l
‑
g1(含gfp)病毒感染组、l
‑
s1(含优化smn1基因)病毒感染组、l
‑
ors1(含smn1基因)病毒感染组对成纤维细胞的影响。候选药物的作用机制是在缺失smn的病人细胞中补充smn的表达，为了确定候选药物在细胞中表达后能促进smn rna的转录，进行实时定量pcr方法(qpcr)检测。如图8(a、b、c)所示，在内源性smn
△
7表达较低的病人成纤维细胞中感染候选药物后，能明显看到在l
‑
s1病毒感染组和l
‑
ors1病毒感染组中，smn
△
7的rna表达水平增加。
[0202]
4.2候选药物能增强smn分子在蛋白水平上表达
[0203]
为了进一步确定此结果，将候选药物感染病人成纤维细胞(内源smn较少)，用western
‑
blot方法检测细胞中smn蛋白的表达。如图9a和图9b所示，在感染候选药物的病人成纤维细胞中，能明显看到smn分子的蛋白表达增强2倍左右。
[0204]
4.3候选药物促进细胞核中gem body形成
[0205]
gem body(简称gb)是一种转录小体，最早于二十世纪80年代在细胞核中被发现，其直径不超过0.1μm。在gem body中，目前所发现的特异性分子为smn，因此细胞核中smn的转录小体即代表gem body。细胞中的gem body数量增加，说明该细胞由smn引起的转录活性增加。将候选药物质粒转染293细胞，用smn抗体对细胞进行免疫荧光染色，通过共聚焦显微镜检测细胞核内smn染色的gem body数量，如图10所示，候选药物l
‑
s1和l
‑
ors1引起细胞核中gem body数量增加，说明候选药物能促进细胞的转录活性。
[0206]
由于在细胞中通过转染表达特定分子容易造成分子的聚集，从而在细胞形态学上呈现出一种假阳性的效应。因此将候选药物病毒液进行不同浓度的稀释，感染293细胞，如图11a和图11b(图11a和图11b为同一结果的不同表现形式)所示，在不同剂量感染细胞后，细胞核中的gem body数量具有明显的剂量依赖效应，说明候选药物能特异性促进细胞的转录活性。
[0207]
综上，在以上体外活性检测中，通过不同的细胞和不同的实验方法，均可以检测候选药物l
‑
s1和l
‑
ors1能增加smn分子的表达，促进细胞转录活性。通过不同剂量的候选药物感染细胞，能看到明显的剂量依赖的活性效应，进一步说明候选药物的特异性。
[0208]
实施例5候选药物能促进细胞的活性
[0209]
为了检测候选药物在促进细胞增殖及抑制细胞凋亡方面的作用，本实施例建立了两个稳定的检测细胞活性的方法，分别通过cck8活性检测细胞增殖活性和流式细胞术检测细胞的凋亡情况。
[0210]
5.1候选药物促进sma病人成纤维细胞的增殖
[0211]
cck8活性检测细胞增殖活性
[0212]
cell counting kit
‑
8(简称cck
‑
8)方法的基本原理为：该试剂中含有wst
‑
8【化学名：2
‑
(2
‑
甲氧基
‑4‑
硝基苯基)
‑3‑
(4
‑
硝基苯基)
‑5‑
(2,4
‑
二磺酸苯)
‑
2h
‑
四唑单钠盐】，它在电子载体1
‑
甲氧基
‑5‑
甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯(1
‑
methoxy pms)的作用下被细胞中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲瓒产物(formazan dye)。生成的甲瓒物的数量与活细胞的数量成正比。因此可利用这一特性直接进行细胞增殖分析。
[0213]
将pc12细胞以1
×
104个/孔接种于96孔板中，每孔100μl 1640完全培养基(10％hs+5％fbs+1％ps+1640)。重组病毒感染后第五日，除正常对照组(未感染病毒样品，培养基含血清)及空白培养基组(未感染病毒样品，培养基不含血清)外，其余各组(l
‑
g1/l
‑
s1/l
‑
ors1)均为感染病毒样品，用无血清1640培养基替换原培养基(其中血清+指使用原含有血清培养基)。24h后每个实验孔用排移液器各加入10μl cck
‑
8试剂(dojindo，ck04)，放于37℃co2培养箱孵育3h。用酶标仪测量od值，吸收波长为450nm。用spss统计软件13.0对实验数据进行分析，结果表明候选药物能促进pc12细胞的增殖(数据未显示)。
[0214]
将候选药物l
‑
s1和l
‑
ors1感染病人成纤维细胞，同样能检测到cck8的活性增加(如图12)，并具有剂量依赖的效应。因此，用cck8活性的检测方法验证了候选药物能促进细胞的增殖。
[0215]
5.2候选药物抑制细胞的早期凋亡
[0216]
在正常的活细胞中，磷脂酰丝氨酸(phosphotidylserine，ps)位于细胞膜的内侧，但在早期凋亡的细胞中，ps从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中。annexin
‑ⅴ
(膜联蛋白
‑
v)是一种分子量为35
‑
36kda的ca
2+
依赖性磷脂结合蛋白，能与ps高亲和力结合，可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合；碘化丙啶(propidium iodide，pi)则与中晚期凋亡的细胞相互结合。
[0217]
将候选药物感染pc12细胞，用流式细胞术检测细胞中annexin v
‑
fitc和pi的比例，其中，annexin v
+
表示早期凋亡细胞；pi
+
表示中晚期凋亡细胞；annexin v
+
+annexin v
+
pi
+
+pi
+
表示annexin v
+
、annexin v
+
pi
+
与pi
+
均含有，表示早中晚期所有凋亡细胞。
[0218]
如图13，候选药物表达的细胞中凋亡细胞(annexin v
+
+annexin v
+
pi
+
+pi
+
)的比例降低，早期凋亡细胞(annexin v
+
)的比例降低，说明细胞的早中期凋亡被抑制，而且这种抑制作用具有剂量依赖性效应。
[0219]
为了进一步确认此结果，将候选药物感染病人成纤维细胞，候选药物表达的细胞中凋亡细胞(annexin v
+
+annexin v
+
pi
+
+pi
+
)的比例降低，早期凋亡细胞(annexin v
+
)的比例降低，说明细胞的早中期凋亡被抑制，而且这种抑制作用也具有剂量依赖性效应(如图14)。
[0220]
综合以上两种细胞的实验结果，说明细胞感染候选药物后，在早期凋亡阶段即被抑制，细胞存活能力得以提高。
[0221]
实施例6体内检测重组病毒在脊髓前角运动神经元的感染情况
[0222]
通过立体定位脑室注射方法向p2新生乳鼠脑室注射病毒，使其通过脑脊液循环感染乳鼠脊神经，观察表达情况。具体操作：将新出生的乳鼠在冰上冷冻麻醉5
‑
10分钟，使其充分麻醉；将磨制的显微注射用电极安装到立体定位仪上；将小鼠放置在手工制作的模具上，在小鼠bregma线上方1mm处，中线偏左或右侧0.5mm处进针，注射深度1.5mm，向内注射病毒1.5μl；注射病毒后将显微注射电极在脑内保留4
‑
10分钟，然后缓慢取出显微注射用电
极；将乳鼠重新放回笼中饲养，第二天观察小鼠存活情况。
[0223]
静脉注射的实验方法：2
‑
8日龄乳鼠，放置于冰上镇静2分钟，抓取乳鼠，保定好头部，漏出一侧脸颊。用酒精棉球轻擦表面皮肤，使血管局部扩张后，用胰岛素注射器向颞浅静脉注射样品，注意注射速度应尽量放慢，且注射完成后拔针时动物缓慢，以防样品流出。注射体积为50μl/只。
[0224]
为检测候选药物在体内能否到达脊髓前角运动神经元，取刚出生2天小鼠分成两组，分别通过颞浅静脉和脑室注射l
‑
g1病毒液，10天后收集小鼠的脊髓，进行石蜡切片，并用gfp抗体和运动神经元特异的chat抗体做免疫组化染色。如图15所示，通过共聚焦显微镜观察，能明显看到运动神经元表达gfp分子。因此，此实验表明两种方式注射的l
‑
g1病毒液均能进入到小鼠脊髓的前角运动神经元。
[0225]
实施例7体内药效学试验
[0226]
7.1候选药提高小鼠存活率(短期内观察)
[0227]
经研究发现，sma模型鼠注射药物的时间窗口不同可能会产生不一致的治疗效果，选择模型鼠出生后第7天给药时间以比较候选药物l
‑
ors1与内含子为sv40的l
‑
ors4对小鼠存活率的影响。繁育tg(smn2*delta7)4299ahmb小鼠，获取纯合子新生小鼠，在出生后第7天给药。设置3组小鼠实验，每组各10只，分别为模型对照组、l
‑
ors1给药组、l
‑
ors4给药组，给药剂量为1
×
10
13
vg/kg，颞静脉注射，观察周期为30天，检测结果如图16所示，模型对照组小鼠在第15天已全部死亡，而l
‑
ors1给药组小鼠在第30天存活率仍高达60％，l
‑
ors4给药组小鼠在第30天存活率约为40％，l
‑
ors1给药组比l
‑
ors4给药组小鼠存活率高，并且一直伴随着整个观察周期(30天)。可见候选药物能更有效地、更快速地提高小鼠存活率。
[0228]
7.2候选药物提高小鼠运动能力
[0229]
繁育tg(smn2*delta7)4299ahmb小鼠，获取纯合子新生小鼠，在出生后2天内给药。设置5组小鼠实验，每组各6只，分别为正常对照组、模型对照组、供试品低剂量给药组(病毒剂量10
12
vg/kg)、供试品中剂量给药组(病毒剂量10
13
vg/kg)和供试品高剂量给药组(病毒剂量10
14
vg/kg)，颞静脉注射。在动物行为学检测方面，主要对小鼠进行了转棒实验和肌力测试。
[0230]
其中转棒实验具体步骤如下：对所有存活小鼠在给药后12天(d12)开始每天进行1次5min的适应性训练，调整转棒疲劳仪转速为20r/min，若小鼠中途掉落，则将小鼠放回转棒上继续适应。给药第14天(d14)将训练过的小鼠依次放在转棒上，记录5min内小鼠从实验开始到掉棒的时间(若5min动物未从转棒上掉落，停留时间记为5min)。转棒实验结果如图17所示，通过转棒实验可知，相对于模型对照组，低、中、高剂量施药小鼠的在棒时间都明显延长，并且在棒时间与施药剂量呈明显剂量依赖关系，且高剂量组接近正常对照组小鼠。
[0231]
肌力测试具体步骤如下：在给药第14天(d14)抓住小鼠尾部，放置在测试支架上，等小鼠抓住支架时，沿水平方向，轻快的向后拉小鼠，小鼠松爪时仪器显示数字即为此次小鼠的最大抓力，每只小鼠测试2次，取平均值(若两次结果相差较大可再检测1次，取2次相近的结果计算均值)。实验结果如图18所示，通过肌力测试结果可知，相对于模型对照组，低、中、高剂量施药小鼠的肌力值都明显延长，并且肌力值与施药剂量呈明显量效关系，且高剂量组已接近正常小鼠。
[0232]
通过以上转棒实验和肌力测试实验，可知，给药后小鼠可以达到运动功能的完全
矫正。
[0233]
7.3其它体内药效试验
[0234]
繁育tg(smn2*delta7)4299ahmb小鼠，获取纯合子新生小鼠，在出生后2天内给药。设置5组小鼠实验，每组各6只，分别为正常对照组、模型对照组、供试品低剂量组(病毒剂量10
12
vg/kg)、供试品中剂量组(病毒剂量10
13
vg/kg)和供试品高剂量组(病毒剂量10
14
vg/kg)，颞静脉注射。给药后通过elisa方法和免疫组化方法测定动物脊髓中的smn含量，观察动物存活时间及体重。
[0235]
给药后取部分小鼠的脊髓组织，用elisa和免疫组化方法检测脊髓中运动神经元中smn含量，中剂量和高剂量给药组小鼠的smn蛋白表达量明显高于对照组(具体数据如下)。模型对照组小鼠的存活时间为15天左右，中、高剂量给药后小鼠可存活达到360天以上。显著提高小鼠存活率。给药组小鼠体重接近正常小鼠(具体数据未显示)。
[0236]
关于smn蛋白表达量：候选药物(l
‑
ors1)提高小鼠组织中smn含量。
[0237]
相对于模型对照组，给药组在左脑、脊髓和左后肌中的smn含量都有明显提升，并且呈剂量依赖性关系。其中，在脑组织中，供试品高剂量给药组使smn含量提高到模型对照组的3倍，恢复到正常对照组的60％；在脊髓中，供试品高剂量给药组使smn含量提高到模型对照组的2倍，恢复到正常剂量组的75％；在肌肉中，供试品高剂量给药组使smn含量提高到模型对照组的5.3倍，恢复到正常剂量组的85％。通过以上结果可知，候选药物(l
‑
ors1)可有效递送并在疾病相关组织中高效表达smn蛋白。
[0238]
7.4候选药物改善小鼠组织萎缩
[0239]
繁育tg(smn2*delta7)4299ahmb小鼠，获取纯合子新生小鼠，在出生后2天内给药。设置4组小鼠实验，每组各6只，分别为正常对照组、模型对照组、供试品(l
‑
ors1)中剂量给药组(病毒剂量10
13
vg/kg)和供试品(l
‑
ors1)高剂量给药组(病毒剂量10
14
vg/kg)，颞静脉注射。
[0240]
给药后第14天取每只动物右脑组织、脊髓及右后肌，用10％中性福尔马林固定，常规石蜡切片，he染色后通过光学显微镜进行病理组织学检查，采用标准术语对病变进行诊断和分级；并进行右后肌肌纤维横截面积大小测量，测量方法为切片经光学显微镜拍照取图，放大倍数为200
×
，使用image j对肌肉横截面积进行分析，每只鼠选取20个肌肉纤维横截面积进行测量。
[0241]
在对骨骼肌的观察结果中(图19
‑
图21)，正常对照组骨骼肌组织结构正常(图19)，模型对照组骨骼肌重度萎缩(图20)，供试品高剂量组骨骼肌轻度萎缩(图21)；在脊髓中(图22
‑
图24)，正常对照组脊髓组织结构正常(图22)，模型对照组脊髓中度萎缩(图23)，供试品高剂量组脊髓轻度萎缩(图24)；在脑组织中(图25
‑
图27)，正常对照组脑组织结构正常(图25)，模型对照组脑组织中度萎缩(图26)，供试品高剂量组脑组织轻度萎缩(图27)，由此可见，候选药物(l
‑
ors1)使模型小鼠骨骼肌、脊髓和脑组织中的萎缩情况得以缓解。
[0242]
右后肌中肌纤维横截面大小测量结果显示，除正常对照组外，其余组别动物的右后肌基本均观察到了肌肉萎缩，肌肉横断面的面积减小，但供试品可剂量依赖性增大肌纤维横截面积，其中供试品高剂量给药组可使肌纤维横截面积增加到模型对照组的2.5倍，恢复到正常对照组的60％。以上结果表明供试品(l
‑
ors1)能够明显改善小鼠肌肉萎缩症状。