一种利用震动薄切及筛分旋转粉碎的粉态薄切细胞外间质微载体及其制备方法与流程

1.本发明涉及生物医学纳米材料领域，特别涉及一种利用震动薄切及筛分旋转粉碎的粉态薄切细胞外间质微载体及其制备方法。


背景技术：

2.脱细胞基质(acellular dermal matrix,adm)是用物理、化学等方法将人尸体皮或动物皮肤中的表皮层，皮下组织及真皮中的细胞成分彻底去除仅保留真皮中含胶原网架的细胞外基质。脱细胞真皮基质来源于天然皮肤，经一定的理化方法处理后，去除了皮肤中表皮层和含抗原成分的细胞仅保留了真皮的胶原成分，三维空间结构以及基底膜结构，具有低免疫原性、良好的生物兼容性和力学性能，是一种理想的皮肤修复和填充材料。脱细胞基质的组织修复作用建立在引导性组织再生(gtr)理论基础上。在发生组织损伤时，受创局部纤维结缔组织会发生病理性增生，形成组织粘连，造成局部相对解剖关系的紊乱，从而产生功能障碍。脱细胞基质植入组织后，在局部形成一层物理屏障，可以预防创伤局部的组织粘连和病理性增生组织在创伤愈合过程中。脱细胞基质在局部的作用是通过其物理阻隔作用将不同组织隔开，使不同组织各自完成其愈合过程，最终重建局部组织的正常解剖结构。脱细胞基质在临床上已被广泛用于耳鼻喉科 (鼓膜修补、矫正鼻畸形、咽部成形术)，颜而部整容(隆唇术、眼部整容、面部组织填充)，神经外科，普外科等。脱细胞基质具快速血管化和较高的稳定性。脱细胞基质中胶原纤维及小血管中的基质成分有助于引导受体细胞和新生血管的长入，形成新的细胞外基质，起到取代植入的脱细胞基质；此外，植入的脱细胞基质可以赋予组织以韧性、弹性、保水性及对机械力的缓冲性，并为细胞提供生存及从事各种活动的微环境。基于脱细胞基质诸多特性，脱细胞基质可用于医学美容中的面部填充和修复、生物医学及组织工程领域。
3.目前脱细胞真皮基质的制备方法主要有一下几种：1、dispase ii
‑
triton法：将真皮首先采用dispaseⅱ进行处理，再使用tritonx
‑
100进行处理。该方法细胞脱除彻底，但是对基底膜破坏大，不利于上皮细胞的粘附与生长；2、高渗盐
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sds法：将真皮首先采用高渗盐进行处理，然后再用破膜剂十二烷基苯磺酸钠 (sds)将真皮中的细胞成分彻底脱除。该方法基底膜保留完整，但真皮中纤维结合素、弹力素等含量较高，可能会有较高的免疫原性；3、高渗盐
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氢氧化钠销蚀法：首先利用高渗盐将表皮去除，然后再通过氢氧化钠中强碱离子的吸水作用，使细胞发生脱水死亡而将真皮中的细胞成分彻底去除。该方法胶原纤维结构完整，排列较正常疏松，但对于细胞的去除效果仍有待提高；4、反复冻融法，通过对新鲜皮肤进行3次以上反复冻融，该方法的操作时间久、周期长，效率低。因此，现有对脱细胞基质的制备技术多样，但在其制备、应用和批量生产上还存在着很多不足，比如：细胞成分去除不彻底，抗原性高，组织兼容性差，对胶原结构及基底膜成分破坏性较大，不利于上皮细胞的粘附与生长；制备过程复杂，制备周期过长；制备成本高问题等。此外，很多脱细胞基质制备过程中使用到各种异源性酶，比如胰蛋白酶，胃蛋白酶，dispase ii等，这些异源性蛋白
不易去除，当使用酶处理得到的脱细胞基质用于人体时，容易产生免疫源性等问题。
4.因此，针对现有脱细胞基质制备技术中存在的不足，本发明提供了一种利用震动薄切及筛分旋转粉碎的粉态薄切细胞外间质微载体(scdm)技术及其制备方法，该方法均使用无毒化学试剂，既能有效降低真皮基质的免疫源性，又可充分保留了真皮基质正常的胶原结构，处理周期短，经济环保，可进行放大生产。


技术实现要素：

5.鉴以此，本发明提出一种利用震动薄切及筛分旋转粉碎的粉态薄切细胞外间质微载体及其制备方法，该粉态薄切细胞外间质微载体具有适合作为可供组织修复生长之三维支撑体。
6.本发明的技术方案是这样实现的：
7.一种利用结构分段纯化的粉态薄切细胞外间质微载体的制备方法，该粉态薄切细胞外间质微载体的制备依次包括取皮粗处理、减压结构松弛、震动薄切、切面纯化、结构纯化、旋转筛分纯化、超临界二氧化碳水溶液萃洗纯化和旋转筛分粉碎处理，得到高均匀性、高纯度的粉态薄切细胞外间质微载体。
8.进一步说明，该制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
9.步骤(1)：取皮粗处理：选取动物皮层，对取皮区，进行脱毛，取皮，消毒得到第一皮膜，该第一皮膜不含皮下脂肪组织；
10.步骤(2)：减压结构松弛：采用减压条件，将该第一皮膜于低于常压作用力瓦解，得到具有松弛组织结构的第二皮膜；
11.步骤(3)：震动薄切：将具有松弛的组织结构的第二皮膜，进行震动薄切，得到具有均匀切面的第一薄切皮膜；
12.步骤(4)：切面纯化：将具有均匀切面的第一薄切皮膜，采用无菌水进行切面纯化，得到第二薄切皮膜；
13.步骤(5)：结构纯化：将第二薄切皮膜裁剪后，采用结构纯化洗液在4～35℃的反应温度下进行结构纯化反应0.5～24小时，酸碱值控制在7～12之间，得到第三薄切皮膜；
14.步骤(6)：旋转筛分纯化：将第三薄切皮膜采用具有10～100目的第一筛网的旋转筛分设备进行旋转筛分纯化，得到保留在该第一筛网中的第一筛分薄切皮膜和第一筛网外部的第一粉态薄切皮膜；
15.步骤(7)：超临界二氧化碳水溶液萃洗纯化：将第一筛分薄切皮膜与第一粉态薄切皮膜采用隔离地超临界二氧化碳水溶液，在4～35℃的温度下进行萃洗纯化，得到高纯度的第一筛分薄切细胞外间质皮膜与第一粉态薄切细胞外间质皮膜；
16.步骤(8)：旋转筛分粉碎处理：将第一粉态薄切细胞外间质皮膜，采用具有第二筛网的筛分旋转粉碎设备，同时进行旋转筛分及旋转粉碎，得到高均匀性的粉态薄切细胞外间质微载体。
17.优选地，所述筛分旋转粉碎设备为动物组织粉碎筛分机，其包括：粉碎模块，粉碎筛分舱，筛分收集模块和气体出入控制阀；
18.其中该粉碎模块包含粉碎马达，粉碎轴承和粉碎刀片；
19.该粉碎筛分舱包含粉碎筛分舱上盖，粉碎筛分圆柱舱体，粉碎筛分舱下盖，并且依
序组合形成容置空间，以及设置于该粉碎筛分舱的可密闭动物组织进料口；
20.该筛分收集模块，包含筛网及筛分收集盘，该筛网和该筛分收集盘之中心位置各设有筛网中心穿孔和筛分收集盘中心穿孔，该筛网中心穿孔和该筛分收集盘中心穿孔用于支撑该粉碎轴承底部，且该筛分收集模块可拆卸地固定于该粉碎筛分圆柱舱体内；在该粉碎筛分圆柱舱体内该容置空间中，该粉碎马达转动该粉碎轴承连动该粉碎刀片，用于将动物组织粉碎，并透过该筛分收集模块被设置于该粉碎刀片下方，该筛网筛分粉碎后动物组织，落入该筛分收集盘；及该气体出入控制阀被用来灌入调节气体调节该动物组织表面特性及温度。
21.优选地，该调节气体是选自由液态氮，干冰，臭氧，高温蒸汽中的任意一种。
22.优选地，步骤(6)的旋转筛分纯化采用一般旋转筛分设备，亦可利用本發明所設計筛分旋转粉碎设备，将粉碎刀片置换成分散棒。
23.进一步说明，步骤(1)中，所述消毒是采用质量浓度为0.5％～5％的苯扎溴铵或过氧乙酸进行消毒。
24.进一步说明，步骤(2)中，将该第一皮膜于低于大气压的50～500托作用力瓦解2～8小时。
25.进一步说明，所述震动薄切是利用具有薄切厚度参数控制的震动薄切设备，调整取皮厚度参数为0.1毫米～5毫米的厚度，利用震动薄切刀刃模块进行薄切，得到具有均匀切面的第一薄切皮膜。
26.优选地，所述震动薄切包括输送载台和设于输送载体上方的震动薄切刀刃模块，将第二皮膜由输送载台通过震动薄切刀刃模块的薄切刀刃，得到第一薄切皮膜。
27.进一步说明，所述切面纯化采用的无菌水用量为1～20倍的薄切皮膜重量。
28.进一步说明，所述结构纯化中，将第二薄切皮膜裁剪成1厘米
×
1厘米～10 厘米
×
10厘米大小薄片状，所述结构纯化洗液的用量为10～50倍的第二薄切皮膜重量。
29.进一步说明，所述结构纯化洗液为碱试剂水溶液，酸试剂水溶液，超临界水溶液，界面活性剂试剂水溶液中的一种或多种组合。
30.更优选的，所述碱试剂水溶液为氢氧化钠水溶液，氢氧化钾水溶液，氢氧化钙水溶液，硫化钠水溶液，硫代乙酸钙水溶液，氢氧化铵水溶液，氨水水溶液中的一种或多种组合。
31.所述酸试剂水溶液为醋酸试剂水溶液，氢氯酸试剂水溶液，果酸，氢氧酸，次氯酸试剂水溶液中的一种或多种组合。
32.所述超临界水溶液为超临界二氧化碳纯水溶液，超临界二氧化碳/甲醇水溶液，超临界二氧化碳/乙醇水溶液，超临界二氧化碳/丙醇水溶液，超临界二氧化碳/丁醇水溶液中的一种或多种组合，其控制在4～35℃温度与30
‑
300bar的压力下使用。
33.所述界面活性剂试剂水溶液为辛基酚聚氧乙烯醚，去水山梨醇单硬脂酸酯，聚山梨醇酯，波洛莎姆，壬苯醇醚，十六醇，烷基聚葡糖苷，月桂基磺酸，十二烷基磺酸，十二烷基磺酸钠，十二烷基苯磺酸，十三烷基苯磺酸，烷基苯氧基苯二磺酸，萘磺酸，烷基萘磺酸，烯基萘中的一种或多种组合的水溶液。
34.进一步说明，所述旋转筛分纯化的转速为1500转/分钟～5000转/分钟。
35.进一步说明，所述第一筛网是选自介于3～9号的第一网孔，该第一网孔具有介于3毫米～9毫米的网孔直径。
36.进一步说明，所述超临界二氧化碳水溶液萃洗纯化为：将第一筛分薄切皮膜与第一粉态薄切皮膜置入分离腔中，萃洗纯化0.5～24小时。
37.进一步说明，所述旋转筛分粉碎处理的转速为1500转/分钟～5000转/分钟。
38.进一步说明，所述第二筛网是选自介于0.1～3号的第二网孔，该第二网孔具有介于0.1毫米～3毫米的网孔直径。
39.进一步说明，所述粉态薄切细胞外间质微载体具有50～500微米范围的粒径分布。
40.一种如上述利用结构分段纯化的粉态薄切细胞外间质微载体的制备方法制得的粉态薄切细胞外间质微载体。
41.与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明通过采用减压松弛处理、震动薄切、以及依据结构特性进行不同分段的纯化处理与旋转筛分粉碎的有效组合用于制备粉态薄切细胞外间质微载体，该粉态薄切细胞外间质微载体具有良好的适合作为可供组织修复生长的三维支撑体。
42.其中，该减压松弛处理、震动薄切与依据结构特性进行不同分段的纯化处理的有效组合，利用减压松弛作用将皮膜结构充分拉开，既有利于提高振动薄切的效果，具有更加均匀的切面，又有利于结合不同分段的切面纯化、结构纯化、旋转筛分纯化以及超临界二氧化碳水溶液萃洗纯化处理作用，使皮膜结构表层的疏水油脂和内部亲水物质的充分去除纯化作用，去细胞及去除抗原彻底，且不会引入异源蛋白(酶)，保持组织微结构、机械性能和免疫原性，同时，利用筛分旋转粉碎步骤，进行同时筛分与粉碎，使均匀性更为提高，并且进行同步的旋转粉碎，大大提升筛分与粉碎效率，不仅更有效地去除残留细胞与杂质，而且提高了所制备粉态薄切细胞外间质微载体的尺寸均一性及纯化效率，有利于微小化的达成，大大提升所制备粉态薄切细胞外间质微载体的纯度，本发明整个处理过程均使用无毒化学试剂，既能有效降低真皮基质的免疫源性，又可充分保留了真皮基质正常的胶原结构，处理周期短，经济环保，可进行放大生产，实现了高效能制备粉态薄切细胞外间质微载体的方法，所获得粉态薄切细胞外间质微载体具有更好的尺寸均一性，微小化与高纯度。
附图说明
43.图1为本发明第二实施例的利用震动薄切及筛分旋转粉碎的粉态薄切细胞外间质微载体的震动薄切设备50的结构示意图；其中，103第二皮膜， 104第一薄切皮膜，510震动薄切刀刃模块，515薄切刀刃，530输送载台；
44.图2为本发明扫描式电子显微镜图：(a)实施例五猪真皮脱细胞基质前制备的第一薄切皮膜与(b)实施例五制备的粉态薄切细胞外间质微载体；
45.图3为本发明细胞核dapi试剂染色图：(a)实施例五猪真皮脱细胞基质前制备的第一薄切皮膜与(b)实施例五制备的粉态薄切细胞外间质微载体；
46.图4为本发明he染色图：(a)实施例五猪真皮脱细胞基质前制备的第一薄切皮膜与(b)实施例五制备的粉态薄切细胞外间质微载体；
47.图5为本发明狼星红试剂染色图:(a)实施例五猪真皮脱细胞基质前制备的第一薄切皮膜与(b)实施例五制备的粉态薄切细胞外间质微载体；
48.图6为本发明爱先蓝试剂糖胺聚糖染色图:(a)实施例五猪真皮脱细胞基质前制备第一薄切皮膜与(b)实施例五制备的粉态薄切细胞外间质微载体；
49.图7为本发明细胞毒性实验比较图:(a)实施例五猪真皮脱细胞基质前制备第一薄切皮膜与(b)实施例五制备的粉态薄切细胞外间质微载体；
50.图8为本发明l929细胞贴附行为的扫描式电子显微镜图:(a)实施例五猪真皮脱细胞基质前制备第一薄切皮膜与(b)实施例五制备的粉态薄切细胞外间质微载体；
51.图9为本发明核酸残留量检测结果比较图:(a)实施例五猪真皮脱细胞基质前制备第一薄切皮膜与(b)实施例五制备的粉态薄切细胞外间质微载体；
52.图10为本发明溶血实验结果比较图:(a)实施例五猪真皮脱细胞基质前制备第一薄切皮膜与(b)实施例五制备的粉态薄切细胞外间质微载体；
53.图11为本发明实施例五制备的粉态薄切细胞外间质微载体的形貌图:(a) 光学显像图与(b)一百倍的扫描式电子显微镜图。
54.图12为本发明的动物组织粉碎筛分机10的结构示意图；其中，100粉碎模块，110粉碎马达，120粉碎轴承，130粉碎刀片，200粉碎筛分舱，210粉碎筛分舱上盖，220粉碎筛分元圆柱舱体，230粉碎筛分舱下盖，240可密闭动物组织进料口，250容置空间，260粉碎筛分舱下盖固定锁，270粉碎筛分舱上盖固定锁，280弹性固定模块，300筛分收集模块，310筛网，330筛分收集盘，400控制模块，500气体出入控制阀。
55.图13为本发明的动物组织粉碎筛分机10(a)筛网及(b)筛网/筛分收集盘结合态的结构示意图。
具体实施方式
56.为了更好理解本发明技术内容，下面提供具体实施例，对本发明做进一步的说明。
57.本发明实施例所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
58.本发明实施例所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
59.第一实施例
60.本发明第一实施例揭示一种利用震动薄切及筛分旋转粉碎的粉态薄切细胞外间质微载体及其制备方法，其中，该粉态薄切细胞外间质微载体的制备依次包括取皮粗处理、减压结构松弛、震动薄切、切面纯化、结构纯化、旋转筛分纯化、超临界二氧化碳水溶液萃洗纯化和旋转筛分粉碎处理，得到高均匀性、高纯度的粉态薄切细胞外间质微载体。
61.第二实施例
62.本发明第二实施例揭示一种利用震动薄切及筛分旋转粉碎的粉态薄切细胞外间质微载体，该粉态薄切细胞外间质微载体的制备方法，包括如下步骤：
63.步骤(1)：取皮粗处理：选取新鲜的动物皮层，对取皮区，进行脱毛，取皮，消毒得到第一皮膜，该第一皮膜不含皮下脂肪组织；
64.步骤(2)：减压结构松弛：采用减压条件，将该第一皮膜于低于大气压的 50～500托作用力瓦解2～8小时而使组织结构松弛，得到具有松弛组织结构的第二皮膜；
65.步骤(3)：震动薄切：将具有松弛的组织结构的第二皮膜，利用具有薄切厚度参数控制的震动薄切设备进行震动薄切，调整取皮厚度参数为0.1毫米～5 毫米的厚度，并且因为组织结构松弛而使得到的第一薄切皮膜具有均匀切面，其中，该震动薄切设备50如图1所示，第二皮膜103由输送载台530通过震动薄切刀刃模块510的薄切刀刃515，得到第一薄切皮膜104；；
66.步骤(4)：切面纯化：将具有均匀切面的第一薄切皮膜，采用1～20倍薄切皮膜重量的无菌水进行切面纯化，去除切面附着物，得到第二薄切皮膜；
67.步骤(5)：结构纯化：将第二薄切皮膜裁剪成1厘米
×
1厘米～10厘米
×
10 厘米大小薄片状后，采用10～50倍第二薄切皮膜重量的结构纯化洗液在4～35℃的反应温度下进行结构纯化反应0.5～24小时，酸碱值控制在7～12之间，去除因为组织结构松弛所产生的剥离物，得到第三薄切皮膜；
68.其中，结构纯化洗液为碱试剂水溶液，酸试剂水溶液，超临界水溶液，界面活性剂试剂水溶液中的一种或多种组合；
69.所述碱试剂水溶液为氢氧化钠水溶液，氢氧化钾水溶液，氢氧化钙水溶液，硫化钠水溶液，硫代乙酸钙水溶液，氢氧化铵水溶液，氨水水溶液中的一种或多种组合。
70.所述酸试剂水溶液为醋酸试剂水溶液，氢氯酸试剂水溶液，果酸，氢氧酸，次氯酸试剂水溶液中的一种或多种组合。
71.所述超临界水溶液为超临界二氧化碳纯水溶液，超临界二氧化碳/甲醇水溶液，超临界二氧化碳/乙醇水溶液，超临界二氧化碳/丙醇水溶液，超临界二氧化碳/丁醇水溶液中的一种或多种组合，其控制在4～35℃温度与30
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300bar的压力下使用。
72.所述界面活性剂试剂水溶液为辛基酚聚氧乙烯醚，去水山梨醇单硬脂酸酯，聚山梨醇酯，波洛莎姆，壬苯醇醚，十六醇，烷基聚葡糖苷，月桂基磺酸，十二烷基磺酸，十二烷基磺酸钠，十二烷基苯磺酸，十三烷基苯磺酸，烷基苯氧基苯二磺酸，萘磺酸，烷基萘磺酸，烯基萘中的一种或多种组合的水溶液。
73.步骤(6)：旋转筛分纯化：将第三薄切皮膜采用具有10～100目的第一筛网的旋转筛分设备进行旋转筛分纯化，通过该筛分纯化处理，可同时得到高均匀性的纯化后的保留在该第一筛网中的第一筛分薄切皮膜和第一筛网外部的第一粉态薄切皮膜，旋转使筛分效率提高；
74.步骤(7)：超临界二氧化碳水溶液萃洗纯化：将第一筛分薄切皮膜与第一粉态薄切皮膜置入分离腔中，采用隔离地超临界二氧化碳水溶液，在4～35℃的温度下进行高透性的萃洗纯化，彻底去除残留小分子，得到高纯度的第一筛分薄切细胞外间质皮膜与第一粉态薄切细胞外间质皮膜；
75.步骤(8)：旋转筛分粉碎处理：第一粉态薄切细胞外间质皮膜，采用具有第二筛网的筛分旋转粉碎设备，同时进行旋转筛分及旋转粉碎，通过该旋转筛分与旋转粉碎，高效率地得到高均匀性的粉态薄切细胞外间质微载体。
76.其中，所述筛分旋转粉碎设备可利用本发明所设计的动物组织粉碎筛分机 10，如图12所示，其包括粉碎模块，粉碎筛分舱200，筛分收集模块300，及气体出入控制阀500，其中该粉碎模块100，包含粉碎马达110，粉碎轴承120，粉碎刀片130；该粉碎筛分舱200，包含粉碎筛分舱上盖210，粉碎筛分圆柱舱体220，粉碎筛分舱下盖230，并且依序组合形成容置空间250，以及设置于该粉碎筛分舱200的可密闭动物组织进料口240；该筛分收集模块300，包含筛网 310及筛分收集盘330，该筛网310和该筛分收集盘330之中心位置各设有筛网中心穿孔311和筛分收集盘中心穿孔331，该筛网中心穿孔311和该筛分收集盘中心穿孔331用于支撑该粉碎轴承120底部，且该筛分收集模块300可拆卸地固定于该粉碎筛分圆柱舱体220内；在该粉碎筛分圆柱舱体220内该容置空间 250中，该粉碎模块100的粉碎马达110转
动该粉碎轴承120连动该粉碎刀片 130，用于将动物组织粉碎，并透过该筛分收集模300组被设置于该粉碎刀片130 下方，该筛网310筛分粉碎后动物组织，落入该筛分收集盘330；及该气体出入控制阀500被用来灌入调节气体调节该动物组织表面特性及温度。该调节气体系选自由液态氮，干冰，臭氧，高温蒸汽中的任意一种。
77.选择拆解更换适合的筛网310和筛分收集盘330结合成筛分收集模块300，该筛网310和筛分收集盘330的中心位置各设有筛网中心穿孔311和筛分收集盘中心穿孔331，该筛网中心穿孔311和筛分收集盘中心穿孔331的位置在筛分收集模块300中彼此相对应；将筛分收集模块固定设置于粉碎筛分元圆柱舱体 220内，并利用弹性固定模块28进行，该筛分收集模块300的固定，使筛分收集模块300不因操作动物组织粉碎筛分机10时，粉碎模块110粉轴承120与粉碎刀片130的运动而连动；该粉碎筛分舱200透过该粉碎筛分舱上盖210，粉碎筛分元圆柱舱体220，及粉碎筛分舱下盖230依次结合，形成容置空间250，并利用粉碎筛分舱下盖固定锁260与粉碎筛分舱上盖固定锁270固定；进一步可透过可密闭动物组织进料口240，将欲处理的动物组织置入该粉碎筛分舱200；在特定的操作下，可透过一气体出入控制阀500灌入气体调节样品条件或温度，例如液态氮，干冰，高温蒸汽等。整个系统可以透过控制模块400进行转速调控或温湿度调控。粉碎后样品将落入收集盘内，取出。该筛分收集模块300可以结合多层复数个筛网，可得到不同大小之微粒。此外，步骤(6)的旋转筛分纯化采用一般旋转筛分设备，亦可利用本发明所设计筛分旋转粉碎设备10，将粉碎刀片130置换成分散棒。
78.通过震动薄切、旋转筛分粉碎及依据结构特性分段纯化的有效组合，提高该第一粉态薄切细胞外间质微载体之尺寸均一性，微小化与高纯度。
79.第三实施例
80.本发明第三实施例揭示一种利用震动薄切及筛分旋转粉碎的粉态薄切细胞外间质微载体，该粉态薄切细胞外间质微载体的制备方法，包括如下步骤：
81.步骤(1)：取皮粗处理：选取新鲜的猪皮皮层，对取皮区，进行脱毛，取皮，采用质量浓度为0.5％的苯扎溴铵进行消毒浸泡三十分钟，取出后经无菌水冲洗干净，沥干并用干净的毛巾擦拭干，得到第一皮膜，该第一皮膜不含皮下脂肪组织；
82.步骤(2)：减压结构松弛：采用减压条件，将该第一皮膜于低于大气压的 50托作用力瓦解2小时而使组织结构松弛，得到具有松弛组织结构的第二皮膜；
83.步骤(3)：震动薄切：将具有松弛的组织结构的第二皮膜，利用具有薄切厚度参数控制的震动薄切设备，调整取皮厚度参数为0.1毫米的厚度，利用震动薄切刀刃模块进行震动薄切，并且因为组织结构松弛而使得到的第一薄切皮膜具有均匀切面；
84.步骤(4)：切面纯化：将具有均匀切面的第一薄切皮膜，采用1倍薄切皮膜重量的无菌水进行切面纯化，去除切面附着物，得到第二薄切皮膜；
85.步骤(5)：结构纯化：将第二薄切皮膜裁剪成1厘米
×
1厘米～10厘米
×
10 厘米大小薄片状后，采用10倍第二薄切皮膜重量的结构纯化洗液在4℃的反应温度下进行结构纯化反应0.5小时，酸碱值控制在7～12之间，去除因为组织结构松弛所产生的剥离物，得到第三薄切皮膜；
86.其中，结构纯化洗液为碱试剂水溶液，该碱试剂水溶液由1％(w/v)氢氧化铵水溶液与1％(w/v)氢氧化钾水溶液混合而成。
87.步骤(6)：旋转筛分纯化：将第三薄切皮膜采用具有10目的第一筛网的旋转筛分设备进行旋转筛分纯化，转速为1500转/分钟，所述第一筛网是选自介于 3～9号的第一网孔，该第一网孔具有介于3毫米～9毫米的网孔直径；通过该筛分纯化处理，可同时得到高均匀性的纯化后的保留在该第一筛网中的第一筛分薄切皮膜和第一筛网外部的第一粉态薄切皮膜，旋转使筛分效率提高；
88.步骤(7)：超临界二氧化碳水溶液萃洗纯化：将第一筛分薄切皮膜与第一粉态薄切皮膜置入分离腔中，采用隔离地超临界二氧化碳水溶液，在4℃的温度下进行高透性的萃洗纯化0.5小时，彻底去除残留小分子，得到高纯度的第一筛分薄切细胞外间质皮膜与第一粉态薄切细胞外间质皮膜；
89.步骤(8)：旋转筛分粉碎处理：第一粉态薄切细胞外间质皮膜，采用具有第二筛网的筛分旋转粉碎设备
‑
具有旋涡分离腔的切割式研磨仪，同时进行旋转筛分及旋转粉碎，转速为1500转/分钟，如图12、13所示，所述第二筛网是选自介于0.1～3号的第二网孔，该第二网孔具有介于0.1毫米～3毫米的网孔直径，通过该旋转筛分与旋转粉碎，高效率地得到高均匀性的粉态薄切细胞外间质微载体，该粉态薄切细胞外间质微载体具有300～500微米范围的粒径分布。
90.通过震动薄切、旋转筛分粉碎及依据结构特性分段纯化的有效组合，提高该第一粉态薄切细胞外间质微载体之尺寸均一性，微小化与高纯度。
91.第四实施例
92.本发明第四实施例揭示一种利用震动薄切及筛分旋转粉碎的粉态薄切细胞外间质微载体，该粉态薄切细胞外间质微载体的制备方法，包括如下步骤：
93.步骤(1)：取皮粗处理：选取新鲜的猪皮皮层，对取皮区，进行脱毛，取皮，采用质量浓度为3％的苯扎溴铵进行消毒浸泡三十分钟，取出后经无菌水冲洗干净，沥干并用干净的毛巾擦拭干，得到第一皮膜，该第一皮膜不含皮下脂肪组织；
94.步骤(2)：减压结构松弛：采用减压条件，将该第一皮膜于低于大气压的 500托作用力瓦解8小时而使组织结构松弛，得到具有松弛组织结构的第二皮膜；
95.步骤(3)：震动薄切：将具有松弛的组织结构的第二皮膜，利用具有薄切厚度参数控制的震动薄切设备进行震动薄切，调整取皮厚度参数为3毫米的厚度，利用震动薄切刀刃模块进行震动薄切，并且因为组织结构松弛而使得到的第一薄切皮膜具有均匀切面；
96.步骤(4)：切面纯化：将具有均匀切面的第一薄切皮膜，采用10倍薄切皮膜重量的无菌水进行切面纯化，去除切面附着物，得到第二薄切皮膜；
97.步骤(5)：结构纯化：将第二薄切皮膜裁剪成1厘米
×
1厘米～10厘米
×
10 厘米大小薄片状后，采用30倍第二薄切皮膜重量的结构纯化洗液在25℃的反应温度下进行结构纯化反应10小时，酸碱值控制在7～12之间，去除因为组织结构松弛所产生的剥离物，得到第三薄切皮膜；
98.其中，结构纯化洗液为酸试剂水溶液，其酸试剂水溶液由1％(w/v)醋酸试剂水溶液和0.5％(w/v)氢氯酸试剂水溶液混合而成；
99.步骤(6)：旋转筛分纯化：将第三薄切皮膜采用具有50目的第一筛网的旋转筛分设备进行旋转筛分纯化，转速为3000转/分钟，所述第一筛网是选自介于 3～9号的第一网孔，该第一网孔具有介于3毫米～9毫米的网孔直径；通过该筛分纯化处理，可同时得到高均匀
性的纯化后的保留在该第一筛网中的第一筛分薄切皮膜和第一筛网外部的第一粉态薄切皮膜，旋转使筛分效率提高；
100.步骤(7)：超临界二氧化碳水溶液萃洗纯化：将第一筛分薄切皮膜与第一粉态薄切皮膜置入分离腔中，采用隔离地超临界二氧化碳水溶液，在25℃的温度下进行高透性的萃洗纯化10小时，彻底去除残留小分子，得到高纯度的第一筛分薄切细胞外间质皮膜与第一粉态薄切细胞外间质皮膜；
101.步骤(8)：旋转筛分粉碎处理：第一粉态薄切细胞外间质皮膜，采用具有第二筛网的筛分旋转粉碎设备
‑
具有旋涡分离腔的切割式研磨仪，同时进行旋转筛分及旋转粉碎，转速为3000转/分钟，如图12、13所示，所述第二筛网是选自介于0.1～3号的第二网孔，该第二网孔具有介于0.1毫米～3毫米的网孔直径，通过该旋转筛分与旋转粉碎，高效率地得到高均匀性的粉态薄切细胞外间质微载体，该粉态薄切细胞外间质微载体具有100～200微米范围的粒径分布。
102.通过震动薄切、旋转筛分粉碎及依据结构特性分段纯化的有效组合，提高该第一粉态薄切细胞外间质微载体之尺寸均一性，微小化与高纯度。
103.第五实施例
104.本发明第五实施例揭示一种利用震动薄切及筛分旋转粉碎的粉态薄切细胞外间质微载体，该粉态薄切细胞外间质微载体的制备方法，包括如下步骤：
105.步骤(1)：取皮粗处理：选取新鲜的猪皮皮层，对取皮区，进行脱毛，取皮，采用质量浓度为5％的过氧乙酸进行消毒浸泡三十分钟，取出后经无菌水冲洗干净，沥干并用干净的毛巾擦拭干，得到第一皮膜，该第一皮膜不含皮下脂肪组织；
106.步骤(2)：减压结构松弛：采用减压条件，将该第一皮膜于低于大气压的 200托作用力瓦解5小时而使组织结构松弛，得到具有松弛组织结构的第二皮膜；
107.步骤(3)：震动薄切：将具有松弛的组织结构的第二皮膜，利用具有薄切厚度参数控制的震动薄切设备进行震动薄切，调整取皮厚度参数为5毫米的厚度，利用震动薄切刀刃模块进行震动薄切，并且因为组织结构松弛而使得到的第一薄切皮膜具有均匀切面；
108.步骤(4)：切面纯化：将具有均匀切面的第一薄切皮膜，采用20倍薄切皮膜重量的无菌水进行切面纯化，去除切面附着物，得到第二薄切皮膜；
109.步骤(5)：结构纯化：将第二薄切皮膜裁剪成1厘米
×
1厘米～10厘米
×
10 厘米大小薄片状后，采用50倍第二薄切皮膜重量的结构纯化洗液在35℃的反应温度下进行结构纯化反应24小时，酸碱值控制在7～12之间，去除因为组织结构松弛所产生的剥离物，得到第三薄切皮膜；
110.其中，结构纯化洗液为超临界水溶液，其超临界水溶液为浓度10(v/v)％的乙醇/二氧化碳超临界流体，在150bar的压力下使用；
111.步骤(6)：旋转筛分纯化：将第三薄切皮膜采用具有100目的第一筛网的旋转筛分设备进行旋转筛分纯化，转速为5000转/分钟，所述第一筛网是选自介于3～9号的第一网孔，该第一网孔具有介于3毫米～9毫米的网孔直径；通过该筛分纯化处理，可同时得到高均匀性的纯化后的保留在该第一筛网中的第一筛分薄切皮膜和第一筛网外部的第一粉态薄切皮膜，旋转使筛分效率提高；
112.步骤(7)：超临界二氧化碳水溶液萃洗纯化：将第一筛分薄切皮膜与第一粉态薄切
皮膜置入分离腔中，采用隔离地超临界二氧化碳水溶液，在35℃的温度下进行高透性的萃洗纯化24小时，彻底去除残留小分子，得到高纯度的第一筛分薄切细胞外间质皮膜与第一粉态薄切细胞外间质皮膜；
113.步骤(8)：旋转筛分粉碎处理：第一粉态薄切细胞外间质皮膜，采用具有第二筛网的筛分旋转粉碎设备
‑
具有旋涡分离腔的切割式研磨仪，同时进行旋转筛分及旋转粉碎，转速为5000转/分钟，，如图12、13所示，所述第二筛网是选自介于0.1～3号的第二网孔，该第二网孔具有介于0.1毫米～3毫米的网孔直径，通过该旋转筛分与旋转粉碎，高效率地得到高均匀性的粉态薄切细胞外间质微载体，该粉态薄切细胞外间质微载体具有50～100微米范围的粒径分布。
114.通过震动薄切、旋转筛分粉碎及依据结构特性分段纯化的有效组合，提高该第一粉态薄切细胞外间质微载体之尺寸均一性，微小化与高纯度。
115.第六实施例
116.脱细胞方法决定细胞脱除的效率，制备方法不同，所保留的细胞外基质和细胞决定簇(免疫原)的量也不同，从而直接影响到材料的组成、组织微结构、材料的机械性能及其免疫原性。为验证本发明脱细胞方法的有效性，利用实施例五的方法制备得到的粉态薄切细胞外间质微载体进行了包括细胞残留，胶原结构，细胞毒性，细胞兼容性，dna残留和溶血等指标的检测，检测结果如图2～5。
117.(1)检测结果显示了本发明脱细胞方法具有去细胞彻底的优点。图2为实施例五猪真皮脱细胞基质前制备的第一薄切皮膜的扫描式电子显微镜图(sem 图)和实施例五制备的粉态薄切细胞外间质微载体的扫描式电子显微镜图(sem 图)，从图2中可以看出猪真皮基质脱细胞基质前的第一薄切皮膜表面致密[图 2(a)]，覆盖了一层较厚的基质成分，而脱细胞后的真皮基质结构疏松[图2(b)]，并且，可见基质纤维呈网状结构分布；图3为对实施例五猪真皮脱细胞基质前制备的第一薄切皮膜的细胞核染(dapi染色)[图3(a)]与实施例五制备的粉态薄切细胞外间质微载体的细胞核染(dapi染色)[图3(b)]，以检测本发明处理后的核酸残留情况。从图3(a)和5(b)中可见，脱细胞基质前的第一薄切皮膜表面出现核酸的特异染色—亮蓝色的星状分布的点，而粉态薄切细胞外间质微载体中未见核酸特异染色的两蓝色的点出现。
[0118]
(2)检测结果显示了本发明脱细胞方法具有胶原三螺旋结构保持完整的优点。从图2(b)的扫描式电子显微镜图(sem图)中可见，脱细胞后真皮基质中胶原三螺旋结构保存完好，表现出实质的螺旋结构，且胶原纤维聚集成束。图4为实施例五猪真皮脱细胞基质前制备的第一薄切皮膜的he染色图[图4(a)]与实施例五制备的粉态薄切细胞外间质微载体的的he染色图[图4(b)]。从图4(a)中可见颜色较深的基质染色，及黄色点状分布的颗粒，该黄色点状颗粒为脂肪颗粒；从图4(b)he染色中可见呈纤维状和点状样分布的着色，该结构为胶原纤维的着色，图4(b)中可以见真皮基质中胶原成横纵排列的网状分布。图5为(a)实施例五猪真皮脱细胞基质前制备的第一薄切皮膜的猪真皮脱细胞基质前后基质中胶原的天狼星红染色图，与图5(b)实施例五制备的粉态薄切细胞外间质微载体的天狼星红染色图，从图4(b)结果中可看出实施例五制备的粉态薄切细胞外间质微载体的胶原成纵横交错排列，很好的保持了皮肤组织中胶原固有的形态结构，在图5(a) 实施例五猪真皮脱细胞基质前制备的第一薄切皮膜的天狼星红染色图中未在观测到。
[0119]
(3)检测结果显示了本发明脱细胞方法具有多糖去除彻底的优点。图6为实施例五猪真皮脱细胞基质前制备第一薄切皮膜的爱先蓝染色与实施例五制备的粉态薄切细胞外间质微载体的爱先蓝染色，从图6(a)中蓝色部分为真皮层中糖胺聚糖染色。从图6(b)中可以看出，本发明提供的方法制备得到的粉态薄切细胞外间质微载体中糖胺聚糖基本被去除。
[0120]
(4)检测结果显示了本发明脱细胞方法具有良好细胞兼容性检测的优点。图7为对实施例五制备的粉态薄切细胞外间质微载体进行的细胞毒性实验。图示为成纤维细胞(l929)在材料浸提液中培养24小时的生长情况，从结果可以看出细胞在材料浸提液中存活率大于100，表明实施例五制备的粉态薄切细胞外间质微载体的毒性为0级。图8为将l929细胞接种在实施例五猪真皮脱细胞基质前制备第一薄切皮膜材料与实施例五制备的粉态薄切细胞外间质微载体上的细胞贴附行为的扫描式电子显微镜图(sem图)。图8(a)中可以看出，在实施例五猪真皮脱细胞基质前制备第一薄切皮膜的材料上未发现细黏附现象，而在实施例五制备的粉态薄切细胞外间质微载体上观察到黏附并表现出聚集生长，如图 8(b)所示，从图中可以看出细胞通过伪足与实施例五制备的粉态薄切细胞外间质微载体材料紧密相连，表现出良好的细胞兼容性。
[0121]
(5)检测结果显示了本发明脱细胞方法具有核酸残留量低的优点。图9为实施例五猪真皮脱细胞基质前制备第一薄切皮膜与实施例五制备的粉态薄切细胞外间质微载体上的核酸残留量检测结果比较图。从图9检测结果中可以看出，猪真皮经过脱细胞处理后的核酸残留量远低于标准要求的最高浓度(50ng/mg)。
[0122]
(6)检测结果显示了本发明脱细胞方法具有低溶血性的优点。图10为实施例五猪真皮脱细胞基质前制备第一薄切皮膜与实施例五制备的粉态薄切细胞外间质微载体采用兔血进行的溶血实验结果比较图。从结果可以看出实施例五制备的粉态薄切细胞外间质微载体的溶血率为0.29％远小于实施例五猪真皮脱细胞基质前制备第一薄切皮膜的溶血率—8.19％，且小于医疗器材溶血率小于5％的标准要求。
[0123]
(7)检测结果显示了本发明脱细胞方法经研磨粉碎过0.5毫米筛网后得到的粉态薄切细胞外间质微载体的形貌，如图11(a)所示；图11(b)为实施例五制备的粉态薄切细胞外间质微载体在100倍的扫描式电子显微镜图(sem图)，粉态薄切细胞外间质微载体具有明显支架结构。
[0124]
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。