7种苹果品种特异性分子标记及其筛选方法和应用

本发明涉及7种苹果品种特异性分子标记及其筛选方法和应用，属于生物
技术领域：
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背景技术：
：苹果为蔷薇科(rosaceae)苹果亚科(maloideae)苹果属(malusmill.)植物。我国苹果种植面积和产量均占全世界40％以上，栽培模式以传统的乔化或矮化中间砧为主。目前国外引进矮化自根砧经过十几年的试验示范推广，已在新建果园广泛采用，且产生极为明显的生产优势。我国一些国外引进、种植时间较长的品种，也开始适应新的种植模式。国光苹果是一种原产于美国的苹果栽培种，培育于1700年代末期，1600年发现的偶然实生苗，1872年传入日本。大约1905年传入中国，1980年时，北京的国光苹果的栽培已经占苹果总栽培面积的50--60％，引进的百年间，国光苹果一直是我国最重要的苹果品种之一。金冠又称金帅，也称黄香蕉或黄元帅。美国引时品种，是1914年andersonh.mullins在美国西维几尼亚州clay县自家的果园内发现的偶然实生树。曾是我国栽培面积较广的传统优良品种之一，也是世界苹果栽培面积较大的品种。蜜脆是西北农林科技大学于2001年从美国引进的品种，该品种由macoun(果肉芳香)为母本，honeygold(味甜、肉脆)为父本杂交而来，树势中庸偏强，一年生枝条略显褐色，成花容易，较丰产，稳产性好。金粉苹果由意大利引进，是新红星苹果(红蛇果)与金冠的杂交品种，意大利桑西公司独家产权。枝条紧凑，生长力强，产量高而稳定，无大小年现象。根据2007年isafruit欧洲口味小组的评估，它是欧盟12个最普通品种中最好的一个。甜石头1号和甜石头2号品种由意大利引进，产量高而且稳定，无大小年。果肉结实，酸度低，含糖量高，有芳香味，口感宜人。华红是中国农科院果树研究所选育的大型、优质、晚熟、耐贮、抗性强的红色苹果新品种，于1998年通过辽宁省品种审定委员会审定。较红富士、乔纳金、新红星抗寒性强，抗旱、抗褐斑能力强，表现高产稳产。本发明涉及的上述7个品种，是我国近100年来引进和自主培育种植的主要苹果品种，曾在我国苹果种植产业中占据重要地位，也在我国近年来新品种培育和引进中发挥重要作用。7种苹果品种的鉴定方法对于我国传统苹果品种栽培模式继承和研究、新品种培育研究、资源保护、种苗繁育，以及我国老旧果园更新换代具有重要的应用价值。技术实现要素：本发明提供一种7种苹果品种的特异性分子标记的筛选方法，并应用该方法筛选到10个品种特异的snp标记，基于这些标记开发出一种简便、快速、可靠鉴定7种苹果品种的pcr方法，为从源头上准确控制苹果品种奠定技术基础。本发明所述的7种苹果品种包括华红、国光、金粉、金冠、蜜脆、甜石头1号和甜石头2号。为解决上述技术问题，本发明采用下述技术方案予以实现：首先，本发明提供一种利用简化基因组测序技术super-gbs筛选7种苹果品种的特异性分子标记的方法，包括如下步骤：(1)利用品种已知且品种准确的华红、国光、金粉、金冠、蜜脆、甜石头1号和甜石头2号苹果品种为样品，取叶片提取基因组dna；(2)按照简化基因组测序技术super-gbs方法构建文库，文库质检合格后上机测序；(3)对测序数据进行过滤后，使用gatk获得snp位点；(4)对snp进行过滤，过滤条件为：snp测序深度不低于4；剔除maf小于0.01的位点；剔除snp分型缺失率高于20％的位点；剔除所有样品中分型一致的位点；(5)根据每个品种的分型结果，筛选每个品种内所有个体分型完全一致、分型一致位点没有个体缺失，且与其他品种不同的位点；最终筛选到10个snp位点，具体见表1。表17种苹果品种的snp位点chrompos华红国光金粉金冠蜜脆甜石头1号甜石头2号chr13394447ttccctttttttctchr13892687ggagggggggggggchr131097850ttttttttttctttchr132013013ttttttctttctctchr132445156ccccccccccacccchr132657812aaacaaaaaaaaaachr139771208gggggtgggggtggchr139959202ataaatatataaaachr1310896391gtttgtgtttttgtchr1312043966aaaaagaaaaaaaa利用表1中的snp位点，针对性的设计出snp位点鉴定引物，具体引物序列如下：表2表1中snp位点鉴定引物信息其次，本发明提供一种利用pcr方法鉴定7种苹果品种的方法，包括如下步骤：(1)根据表1位点所在的基因组位置设计特异性的pcr扩增引物，见表2；(2)提取苹果品种标准样和盲样叶片基因组dna；(3)利用能够扩增出snp位点的引物进行pcr扩增，见表2；(4)将获得的pcr产物进行一代测序；(5)序列信息对照表snp位点进行分析和品种鉴定。本发明的有益效果：对7种苹果品种的的组培苗、嫁接苗、成品苗能够准确的区分，确保育种企业对品种的把控，减少繁育过程中误差造成的经济损失。附图说明下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。图1附图为利用筛选到的华红、国光、金粉、金冠、蜜脆、甜石头1号和甜石头2号共7种苹果品种的10个特异snp标记构建进化树，能够准确的区分7种苹果品种。具体实施方式实施例1本实施例提供一种利用简化基因组测序技术super-gbs筛选华红、国光、金粉、金冠、蜜脆、甜石头1号和甜石头2号共7种苹果品种特异性snp分子标记的方法，包括如下步骤：(1)利用品种已知的4株华红、4株国光、4株金粉、12株金冠、4株蜜脆、3株甜石头1号和5株甜石头2号苹果品种样品，取叶片提取基因组dna；(2)按照简化基因组测序技术super-gbs方法构建文库，文库质检合格后上机测序；(3)对测序数据进行过滤后，使用gatk获得snp位点；(4)对snp进行过滤，过滤条件为：snp测序深度不低于4；剔除maf小于0.01的位点；剔除snp分型缺失率高于20％的位点；剔除所有样品中分型一致的位点；(5)根据每个品种的分型结果，筛选每个品种内所有个体分型完全一致、分型一致位点没有个体缺失，且与其他6个苹果品种中至少一个品种位点不同，最终筛选到13号染色体10个snp位点。具体的操作步骤如下：本实施例主要包含以下步骤，即酶切、连接、纯化、扩增、混库和分析。1.酶切：对本公司购买的标准机构提供的品种准确的4株华红、4株国光、4株金粉、12株金冠、4株蜜脆、3株甜石头1号和5株甜石头2号苹果品种样品进行super-gbs建库，具体过程如下(以下为每个样品酶切试剂使用量)：所有成分混匀后37℃酶切2h，然后75℃保温20min使酶灭活。2.连接：在40μl体系中连接adapter，barcode及酶切片段。所有成分混匀后22℃酶切2h，然后65℃保温20min使酶灭活。3.纯化取连接产物35μl加入0.7倍体积的sera-magbeads(gehealthcarelifesciences)，室温静置5min，以去除300bp以下小片段。从上清中回收磁珠，并用200μl70％酒精洗脱3遍。最后用40μl10mmtris.hcl(ph8.0)从磁珠中回收dna。4.扩增所有成分混匀后置于pcr仪中，反应条件为95℃预变性30s，扩增16个循环，每个循环95℃变性30s，62℃退火20s，68℃延伸15s，最后在68℃延伸5min，4℃保存。5.混库使用qubit测定每个样品的文库浓度，浓度大于5ng/μl的样品用于混库测序。通过加入0.7倍体积的sera-magbeads去除文库中的引物和小片段，然后根据测序量需求进行混样测序，测序平台为illuminanovape150。建库过程所用的接头和引物序列详见下表3。表3super-gbs测序文库构建接头及引物序列名称序列(5’-3’)commonadaptortopgatcggtctcggcattcctgctgaaccgctcttccgatctcommonadaptorbotcgagatcggaagagcggggactttaagcpstiadaptortopcacgacgctcttccgatctaacxxxxxxtgcapstiadaptorbotyyyyyyagatcggaagagcgtcgtgprimer1aatgatacggcgaccaccgagatctacactctttccctacacgacgctcttccgatctprimer2caagcagaagacggcatacgagatcggtctcggcattcctgctgaa6.分析对7种苹果品种，共36个样品进行super-gbs测序，一共得到99m高质量reads。将高质量reads比对到参考基因组上，比对率为76.45％～84.28％，所有样品的平均测序深度为38.1×。利用gatk(v3.8-1)软件得到snp位点，然后筛选7个品种间至少有一个品种与其它品种不同的snp位点，最终获得13号染色体10个snp位点，通过treebest(ruanet.al2008)软件(v1.9.2)计算距离矩阵构建进化树，进化树的可靠性通过bootstrap法进行检验(重复1000次)，结果显示这些位点可用于7种苹果品种的准确鉴定，鉴定结果见图1。实施例2本实施例提供按照本发明的snp位点设计相对应的pcr检测引物，对山东大丰园农业有限公司品种圃随机采集多份苹果品种树苗基因组dna进行pcr扩增，并通过测序的方法进行7种苹果品种鉴定，同时加入已知品种的7种苹果品种作为阳性对照进行试验和验证。包括如下步骤：(1)对本公司购买的标准机构提供的品种准确的华红、国光、金粉、金冠、蜜脆、甜石头1号和甜石头2号树苗叶片各取2株，提取基因组dna；(2)从山东大丰园农业有限公司品种圃随机采集7种苹果品种样品各1株，提取基因组dna；(3)根据筛选的的snp位点(表1)所在的基因组位置设计pcr扩增的上下游引物，见表2；(4)利用表2中7种苹果品种的通用引物进行pcr扩增；(5)对扩增的序列进行一代测序；(6)根据测序结果，并参照表1中的snp位点对测序结果中对应的位点的序列进行判读，确定苹果样品品种。具体的操作步骤如下：本实施例主要包含以下步骤，即pcr、测序、比对和分析。1、snp位点确认(表1)。2、pcr扩增根据表1中的位点所在位置设计pcr扩增引物，引物序列见表2。扩增条件为94℃3min,94℃30sec,55℃45sec,72℃45sec,37个循环，72℃7min,12℃30min。3.测序将获得的pcr扩增产物利用1％琼脂糖凝胶电泳进行检测，在预计位置获得特异扩增条带的样品寄送上海生工生物有限公司进行测序。4.序列比对测序获得的结果利用dnaman软件或者snapgene进行序列比对，利用本发明10个snp位点标记群(见表1)进行7种苹果品种的分型。5.分析序列比对鉴定结果发现，7种苹果品种华红、国光、金粉、金冠、蜜脆、甜石头1号和甜石头2号标准株14株，盲样7株，鉴定结果与实际品种情况相符。以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。序列表<110>山东大丰园农业有限公司潍坊科技学院<120>7种苹果品种特异性分子标记及其筛选方法和应用<160>20<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1gcgtgtcagccggtagatta20<210>2<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2gtgaacgccattggaaaccc20<210>3<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3cgaattccggctccaatcct20<210>4<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>4cagagttccctacaccgtcg20<210>5<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>5gcggacgttattcatgccac20<210>6<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>6ctgagcgctagacggtgaat20<210>7<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>7accgcaaggtaggcttgttt20<210>8<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>8tagagctggggcacaagaga20<210>9<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>9tgccctttgcgatcaaatgc20<210>10<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>10tccgttctaccgtttcgtgg20<210>11<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>11atccgacgtcacgatgatcc20<210>12<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>12gtggcttgtagcccttgact20<210>13<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>13ggtgatgagccaagtgagca20<210>14<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>14ggccctccaaaaacgacttg20<210>15<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>15atcacgagcattagtcgggc20<210>16<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>16ggtttcagccaacgaggtct20<210>17<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>17gtgaacccactgctgatgaga21<210>18<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>18gtggcccatttggtcagtcta21<210>19<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>19aattttggttgccgacgctc20<210>20<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>20agcgccgtttctaactttgc20当前第1页12