CHI3L1在椎间盘退变性疾病中的应用的制作方法

本发明涉及医学生物检测技术领域，具体地说，是一种适用于椎间盘退变早期筛查及诊断的分子标志物chi3l1及其诊疗应用。

背景技术：

下腰痛是临床上常见的门诊主诉之一，而椎间盘退变是lbp最主要的病因。随着椎间盘的退变，髓核突出压迫神经根，引起患者相应部位的感觉运动功能障碍，如不能及时解除压迫，严重者最终导致四肢瘫痪乃至死亡，是严重危害人类健康的疾病之一。根据相关文献报导，人类的椎间盘在11-16时开始出现退变，目前临床上患者呈现明显的年轻化趋势。目前针对idd的治疗缺乏有效的非手术治疗方案，仅能通过手术治疗，手术治疗主要是通过摘除减压，但并不能从根源上缓解idd，此外手术显著增加了临近节段的退变风险。在诊断方面，idd早期无明显症状，随着疾病的发生发展，逐渐出现了神经根压迫症状，因为缺乏特异性的诊断标志物，一般仅通过mri进行诊断，与其他脊柱脊髓疾患易混淆，造成漏诊误诊。因此，寻找高敏感性或强特异性的早期诊断椎间盘退变的生物标志物是目前一个急需解决的问题。

chi3l1基因由10个外显子组成，位于染色体1q31-q32上，其产物由383个氨基酸组成，因为三个n端氨基酸分别为酪氨酸(y)-赖氨酸(k)-亮氨酸(l)也被称为ykl-40。由于其蛋白结构可变，在不同组织中其发挥的具体功能仍不清楚。当前研究发现chi3l1可以通过软骨细胞，平滑肌细胞和骨肉瘤细胞等多种细胞表达，并且其功能通常与炎症作用和组织重塑有关。idd的最主要两大病生变化就是炎症的发生发展以及细胞外基质代谢紊乱。然而，目前还没有chi3l1对椎间盘退变进行早期筛查以及诊疗的研究报道，若能将椎间盘髓核组织特异性表达的chi3l1作为生物标志物，并研制相应的筛选试剂盒以及药物，必将对我国椎间盘退变的早期诊断及治疗具有重要意义。

技术实现要素：

(一)解决的技术问题

本发明的首要目的是针对上述技术问题，提出一种与椎间盘退变相关的用于早期诊断的分子标志物chi3l1，本发明的另一目的在于提供利用chi3l1来维持和/或改善椎间盘退变的应用。

(二)技术方案

为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：chi3l1在椎间盘退变性疾病中的应用，本发明的第一方面，提供适用于椎间盘退变早期筛查及诊断的分子标志物：chi3l1。

chi3l1在髓核细胞中的表达水平与椎间盘退变程度成正相关，因此，通过检测血清中chi3l1的表达水平，可以评估待检人群中椎间盘退变的风险及程度。

本发明的第二方面，提供上述分子标志物chi3l1在制备椎间盘退变的诊断试剂或试剂盒中的应用。

优选的，所述的诊断试剂或试剂盒为髓核组织检测试剂或检测试剂盒。

所述的诊断试剂或试剂盒检测生物样品中chi3l1的表达量，所述的生物样品选自：获自对象的新鲜组织或细胞、福尔马林固定或石蜡包埋组织或细胞、血液或体液。

优选的，所述的生物样品为椎间盘髓核组织。

所述的诊断试剂或试剂盒包括：对chi3l1具有检测特异性的探针、基因芯片，或pcr引物。

优选的，所述的诊断试剂或试剂盒为采用real-timert-pcr(qpcr)方法检测chi3l1表达量的试剂或试剂盒。

优选的，所述的对chi3l1具有检测特异性的物质为pcr引物的核苷酸序列。

本发明的第三方面，提供一种诊断椎间盘退变的试剂盒，所述的试剂盒中包括用于检测chi3l1表达量的试剂。

优选的，所述的用于检测chi3l1表达量的试剂为采用real-timert-pcr方法检测chi3l1表达量的试剂。

优选的，所述的试剂盒中包括：对chi3l1具有检测特异性的pcr引物的核苷酸序列，如seqidno:1和seqidno:2所示。

本发明的第四方面，提供检测chi3l1表达水平的试剂在制备椎间盘退变诊断或筛查用试剂盒中的用途。

本发明的第五方面，提供了利用chi3l1来维持和/或改善椎间盘退变的方法，包含两种方法：

a、将chi3l1的重组质粒转染髓核细胞，获得chi3l高表达的髓核细胞；

b、利用chi3l1(ykl-40)重组蛋白处理髓核细胞，使得髓核细胞处于高chi3l1蛋白产物的环境中；

所述步骤a中转染步骤如下：超净台内，将97uldmem加入到1mlod管中，并将3μg过表达chi3l1质粒加入至dmem中，用移液器轻柔充分混匀后，室温下静置5分钟。同时将4μlfugene6加入至预混的dmem中，轻轻混匀后静置15分钟。完成后用100ul枪吸出反应液，均匀的滴加至6孔板中，轻轻拍打后放入培养箱。24小时后观察细胞状态，弃去细胞上清，更换为新鲜培养基，获得oechi3l1-npcs。

所述步骤b中干预处理：超净台内，将至少100ug的chi3l1重组蛋白加入至2ml含有10％fbs(gibco)、1％l-谷氨酰胺和双抗的dmem/f12培养基中，充分混匀。弃去细胞上清后，加入预混有chi3l1重组蛋白的培养基，放入培养箱培养；

培养48小时后，检测oechi3l1-npcs的炎症基因和基质合成基因表达水平，并检测chi3l1重组蛋白组髓核细胞的凋亡情况。实验重复3次，均可发现oechi3l1-npcs同对照组相比，明显抑制炎症水平并且促进基质合成，重组蛋白干预后，髓核细胞的凋亡率明显好转。

(三)有益效果

本发明提供了chi3l1在椎间盘退变性疾病中的应用。具备以下有益效果：

本发明可早期筛查椎间盘退变的患者，以期及早进行干预或预防，最大限度的延缓患者病情进展，降低致残率，本发明首次发现了对椎间盘退变具有较高诊断和治疗价值的分子标记物chi3l1；通过标志物chi3l1诊断试剂盒和相关药物的研制和应用，可以使椎间盘退变的早期诊疗更加方便易行，为临床医生快速并准确掌握患者病情，为提高临床治疗效果奠定基础。

附图说明

图1为非标记蛋白组学研究后通过将对照组(非椎间盘退变患者组织)与退变组(椎间盘退变患者组织)的基因蛋白进行go分析，对其中3个明显异常表达的基因通过real-timepcr验证；

图2为选取3例无椎间盘退变患者髓核细胞，通过促炎因子构建体外退变模型，通过real-timepcr法和westernblot法，对髓核中的chi3l1水平进行统计分析后我们可以看到退变髓核细胞chi3l1的表达量明显高于对照组，提示chi3l1可能具有诊断价值，值得进一步研究，p<0.01；

图3为通过质粒和sirnas调控髓核中的chi3l1水平，通过real-timepcr检侧不同分组内基质合成相关基因(acan、chsy1及col2)和炎症相关基因(mmp1、mmp3、mmp13、adamts4和adamts5)的mrna水平，将gapdh设为内参，并通过2-δδct值比较各基因mrna的相对含量，结果显示利用质粒后髓核细胞的炎症相关基因水平明显下降，基质合成相关基因水平明显升高，转染sirnas则出现明显相反的结果，p<0.05；p<0.01；

图4为对chi3l1过表达处理构建的体外退变模型的髓核细胞进行高通量测序检测分析，并进行生物信息学分析(kegg)，并通过real-timepcr对潜在的下游基因进行筛选，结果显示调控chi3l1后akt3水平变化明显，p<0.05；p<0.01；

图5为通过流式细胞术检测不同处理组的髓核细胞的凋亡情况，结果显示使用重组蛋白后髓核细胞凋亡率明显降低，而使用多克隆抗体后髓核细胞的凋亡率明显上升，结果提示chi3l1蛋白能够显著减少髓核细胞的凋亡。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1：

如图1-5所示，本发明实施例提供chi3l1在椎间盘退变性疾病中的应用，包括检测chi3l1基因表达的产品在制备诊断椎间盘退行性病变的工具中的应用。

一、研究对象

选取椎间盘退变患者的椎间盘组织(n＝3)以及外伤手术中正常椎间盘组织(n＝3)进行高通量非标记蛋白组学研究及生物信息学分析。退变组与对照组的年龄、吸烟、饮酒等因素的分部差异无统计学意义(p>0.05)。

二、研究方法

1.手术中摘取患者的椎间盘组织，立即浸泡在无菌pbs中并立即转运至实验室。

2.将其转移至1.5-ml螺旋盖管中，并在10000×g下于4℃离心30分钟。

3.接着，向每个样品中添加100μl裂解缓冲液(7m尿素、2m硫脲)，然后超声粉碎以提取总蛋白。

4.根据制造商的说明，使用量子位荧光蛋白定量试剂盒(invitrogen)测定蛋白质浓度。

5.进一步的非标记蛋白质组学研究由上海烈冰生物医药科技有限公司(上海，中国)执行。

6.对异常表达的蛋白进行go分析，并从go分析的生物过程、细胞成分和分子功能三个方面对前三个高富集go基团进行了venn分析筛选。

7.将筛选出的基因在额外的6个退变的椎间盘髓核组织以及正常椎间盘髓核组织中进行表达量的验证。

三、实验结果

通过非标记蛋白组学及生物信息学分析对椎间盘退变患者的椎间盘组织以及外伤手术中正常椎间盘中的异常表达的基因进行筛选，如图1所示。最后筛选出3个明显异常表达的基因：lyz,chi3l1和aebp1，在体外细胞层面分别检测退变的髓核细胞和正常的髓核细胞中以上候选基因的mrna表达情况。如图1所示，在椎间盘退变患者的髓核细胞中chi3l1相较于正常人髓核细胞中表达量明显升高。

实施例2：检测髓核细胞体外退变模型中的chi3l1表达水平

一、研究对象

取外伤手术中正常椎间盘组织(n＝3)进行体外细胞实验。

二、研究方法

1.手术中摘取患者的椎间盘组织，立即浸泡在无菌pbs中并立即转运至实验室，无菌环境下提取np细胞进行原代培养；

2.将生长良好的髓核细胞接种至6孔板中(正常培养，37度，5％co2培养箱)，待细胞密度达到60-80％进行退变模型构建。

3.重组人tnf-α(50ng/ml)(peprotech公司提供)或重组人il-1β(25ng/ml)(peprotech公司提供)处理np细胞48小时以建立髓核细胞退变模型。

4.pbs轻柔洗涤后，将takararnaiso(takara公司提供)或trizolreagent(lifetechnology提供)1ml加入每孔中，并于室温(25℃左右)下放置5min，确保完全裂解；加入氯仿0.2ml(rna抽提试剂：氯仿＝5:1)后迅速剧烈上下震荡，冰上下静置10min后可见分层，低温离心15分钟(12000r/min)后上层水相即为所需rna；将上层无色水相用无酶枪头小心吸出(约500-600ml)，加入至等量异丙醇中，充分颠倒混匀于-20℃下静置30min。以15000r/min，低温离心25min(4℃)。小心弃去上清，加入1ml75％乙醇溶液(depc和无水乙醇配置)，混匀样本；7500r/min低温离心5min(4℃)。小心弃去上清，干燥5min后加入适量rnasefreedh2o溶解并按照takaraprimescript^tmrtreagentkitwithgdnaeraser试剂盒说明书进行逆转录。

5.real-timert-pcr(qpcr)方法

1.引物序列如下；

chi3l1：

正向引物：5’tgttccgaggtcaggaggat3’(seqidno:1)

反向引物：5’tgcccatcaccagcttactg3’(seqidno:2)

gapdh：

正向引物：5’agttgcgttacaccctttcttg3’(seqidno:3)

反向引物：5’gctgtcaccttcaccgttcc3’(seqidno:4)

2.根据premixextaq^tm试剂盒说明书进行实时定量pcr技术进行检测分析，每孔内qpcr的体系体积为20ul，包括：10ul的2×sybrmastermix、上下游引物各0.4μl(10μm)以及8.8ul的去离子水。体系中尽量避免和减少气泡的产生，充分混合后离心1min(700r/min)。按照下列扩增条件进行扩增：

60℃-99℃0.3℃/s溶解曲线

4℃无限

每个实验至少独立重复三次。

3.结果根据比较δct值计算2-δδct值比较各基因mrna的相对含量，并利用t检验，p<0.05认为有统计学意义，p<0.01认为差异显著。

4.将步骤3中的细胞通过裂解液(ripa：pmsf：蛋白酶抑制剂cocktail＝100：1:1)收集总蛋白，留取3-5ul以进行浓度测定，其余高温变性后保存。

5.通过bca法测定蛋白浓度。

6.通过westernblot电泳检测各组中chi3l1的蛋白水平，chi3l1一抗购于abcam公司。

三、研究结果

退变的髓核细胞中chi3l1的mrna和蛋白表达水平较对照组均显著上调，具体如图2所示。

上述结果进一步提示chi3l1的上调对椎间盘退变具有提示意义。

实施例3：在椎间盘退变中chi3l1具有抑制炎症促进基质合成的作用

一、研究对象

同实施例2

二、研究方法

同实施例2。

通过转染质粒和sirnas以调控chi3l1的水平，质粒由和元生物技术(上海)有限公司提供，sirnas由上海吉玛制药技术有限公司合成。

sichi3l1序列：

sichi3l1-1：5’ccacccuaaucaaggaaauuu3’(seqidno:5)

sichi3l1-2：5’gagccacaguccauagaauuu3’(seqidno:6)

为了明确调控chi3l1后退变的椎间盘髓核细胞内基质合成及炎症变化情况，我们利用real-timepcr对基质合成相关基因(acan、chsy1及col2)和炎症相关基因(mmp1、mmp3、mmp13、adamts4和adamts5)上进行分析。

三、研究结果

无论是在il-1β还是tnf-α构建的体外退变模型中，sichi3l1干预后退变髓核细胞的炎症相关基因水平明显升高，基质合成相关基因水平明显降低，转染质粒则出现明显相反的结果，具体如图3所示。结果提示在椎间盘退变中chi3l1升高后能够抑制炎症促进基质合成。

实施例4：chi3l1通过下游akt3发挥作用

一、研究对象

同实施例2

二、研究方法

同实施例2。

对chi3l1过表达处理构建的体外退变模型的髓核细胞进行高通量测序检测分析，并进行生物信息学分析，并通过real-timepcr对潜在的下游基因进行筛选。

三、研究结果

无论是在il-1β还是tnf-α构建的体外退变模型中，通过转录组高通量测序结合生物信息学分析发现三个潜在的下游靶基因：akt3，crk和rps6ka6，见图4。筛选后发现akt3水平明显被chi3l1调控。结果提示在椎间盘退变中akt3是chi3l1潜在的下游靶基因。

实施例5：chi3l1重组蛋白减少髓核细胞凋亡

一、研究对象

同实施例2

二、研究方法

通过使用不同浓度的chi3l1重组蛋白(购自北京义翘神州科技有限公司)和chi3l1多克隆抗体(购自abclonal公司)以调控chi3l1蛋白产物，干预48h后通过流式细胞术检测髓核细胞凋亡水平。

三、研究结果

使用chi3l1重组蛋白后髓核细胞凋亡率明显降低，而使用chi3l1多克隆抗体后髓核细胞的凋亡率明显上升，见图5。结果进一步提示chi3l1发挥着保护椎间盘的作用。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。