1.本发明属于生物医学技术领域，具体涉及一种结核分枝杆菌潜伏感染及发病的新型组合检测方法。
背景技术：
2.结核分枝杆菌，俗称结核杆菌，是引起结核病的病原体，该菌可侵犯全身各器官，但以引起肺结核最多见，结核病是一种古老的疾病，全球广泛分布，是细菌感染性疾病致死的首位原因，结核分枝杆菌，是人类结核病的病原体，是专性需氧的一类细菌，抗酸染色阳性，无鞭毛，有菌毛，有微荚膜但不形成芽孢，其细菌壁既没有革兰阳性菌的磷壁酸，也没有革兰阴性菌的脂多糖。
3.现有对结核分枝杆菌在检测中，是没有对检测样品的活性进行检测的，一旦检测的样品活性较低，会影响后期检测的精准度，容易出现漏查的现象，且在对样品的检测中，无法对结核分枝杆菌的传播性以及发病率进行相对应的检测。
技术实现要素：
4.本发明的目的在于提供一种结核分枝杆菌潜伏感染及发病的新型组合检测方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
5.为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种结核分枝杆菌潜伏感染及发病的新型组合检测方法，包括以下步骤：
6.步骤一：准备待测样品，并对待测样品进行活性检测，合格后进入下一步骤；
7.步骤二：将检测合格的待测样品利用罗氏培养基进行培养，收集全部培养物分别通过乙醇溶液浸泡；
8.步骤三：将步骤二中浸泡后的溶液等分多份，取其中任意一份进入步骤四内操作；
9.步骤四：取步骤三中一份侵泡溶液，并在室温风干，收集固形物干燥，对固形物干燥进行，并加入提取液混合，随后检测提取液中是否含有氨基酸序列为nsgyieccr的结核分枝杆菌；
10.步骤五：将步骤四中检测的结核分枝杆菌的生物膜分离；
11.步骤六：通过酶标仪检测生物膜是否具有传染性。
12.作为本发明的一种优选的技术方案，在所述步骤一中的活性检测方法如下：
13.s1：将待测样品放置在玻璃培养皿中，并在培养皿中添加培养基，并培养10～15min；
14.s2：添加alamarblue氧化还原指示剂，并观察氧化状态下，样品增殖情况；
15.s3：观察添加alamarblue氧化还原指示剂后，样品颜色，摄入菌体内的alamarblue氧化还原指示剂被代谢中间体还原后释放到体外并溶于培养基中,使培养基从无荧光的靛青蓝变成有荧光的粉红色；
16.s4：使用普通分光光度计或荧光光度计进行检测，当吸光度和荧光强度与活性细
菌数成正比时，说明样品合格，反之不合格。
17.作为本发明的一种优选的技术方案，还包括取步骤二中其中一份溶液，采用高保真dna聚合酶和非高保真dna聚合酶混合酶作为聚合酶,对结核分枝杆菌的dna样品进行pcr扩增，并检测pcr扩增产物的形成与否，其中，如果形成扩增产物,则表示所述的结核分枝杆菌含有利福平耐药突变。
18.作为本发明的一种优选的技术方案，所述s1中加入的培养基为察氏培养基。
19.作为本发明的一种优选的技术方案，在所述s2中，观察样品增殖的时间为20～30min。
20.作为本发明的一种优选的技术方案，所述s4中，荧光基团选择fam、rox、hex、cy5、tet、cal
‑
fluor中的任意一种。
21.作为本发明的一种优选的技术方案，所述s1中的玻璃培养皿直径为10～15cm。
22.与现有技术相比，本发明的有益效果是：
23.通过本发明的设计，在前期能够对检测样品的活性度进行检测，保证后期检测的精准度，同时避免出现漏查的现象，同时在不影响样品中的结核分枝杆菌的前提下，对其增殖，将单一的检测样品等分多份，便于对结核分枝杆菌的潜伏特性以及发病率进行多重检测，完善现有的不足。
具体实施方式
24.下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
25.实施例1
26.本发明提供一种技术方案：一种结核分枝杆菌潜伏感染及发病的新型组合检测方法，包括以下步骤：
27.步骤一：准备待测样品，并对待测样品进行活性检测，通过在前期能够对检测样品的活性度进行检测，保证后期检测的精准度，同时避免出现漏查的现象，合格后进入下一步骤；
28.步骤二：将检测合格的待测样品利用罗氏培养基进行培养，收集全部培养物分别通过乙醇溶液浸泡；
29.步骤三：将步骤二中浸泡后的溶液等分多份，取其中任意一份进入步骤四内操作；
30.步骤四：取步骤三中一份侵泡溶液，并在室温风干，收集固形物干燥，对固形物干燥进行，并加入提取液混合，随后检测提取液中是否含有氨基酸序列为nsgyieccr的结核分枝杆菌；
31.步骤五：将步骤四中检测的结核分枝杆菌的生物膜分离；
32.步骤六：通过酶标仪检测生物膜是否具有传染性。
33.本实施例中，在步骤一中的活性检测方法如下：
34.s1：将待测样品放置在玻璃培养皿中，并在培养皿中添加培养基，并培养12min；
35.s2：添加alamarblue氧化还原指示剂，并观察氧化状态下，样品增殖情况；
36.s3：观察添加alamarblue氧化还原指示剂后，样品颜色，摄入菌体内的alamarblue氧化还原指示剂被代谢中间体还原后释放到体外并溶于培养基中,使培养基从无荧光的靛青蓝变成有荧光的粉红色，在不影响样品中的结核分枝杆菌的前提下，对其增殖，将单一的检测样品等分多份，便于对结核分枝杆菌的潜伏特性以及发病率进行多重检测，完善现有的不足；
37.s4：使用普通分光光度计或荧光光度计进行检测，当吸光度和荧光强度与活性细菌数成正比时，说明样品合格，反之不合格。
38.本实施例中，还包括取步骤二中其中一份溶液，采用高保真dna聚合酶和非高保真dna聚合酶混合酶作为聚合酶,对结核分枝杆菌的dna样品进行pcr扩增，并检测pcr扩增产物的形成与否，其中，如果形成扩增产物,则表示所述的结核分枝杆菌含有利福平耐药突变。
39.本实施例中，s1中加入的培养基为察氏培养基。
40.本实施例中，在s2中，观察样品增殖的时间为25min。
41.本实施例中，s4中，荧光基团选择fam、rox、hex、cy5、tet、cal
‑
fluor中的任意一种。
42.本实施例中，s1中的玻璃培养皿直径为12cm。
43.实施例2
44.与本实施例1中的不同之处在于：本实施例中，在步骤一中的活性检测方法如下：
45.s1：将待测样品放置在玻璃培养皿中，并在培养皿中添加培养基，并培养15min；
46.s2：添加alamarblue氧化还原指示剂，并观察氧化状态下，样品增殖情况；
47.s3：观察添加alamarblue氧化还原指示剂后，样品颜色，摄入菌体内的alamarblue氧化还原指示剂被代谢中间体还原后释放到体外并溶于培养基中,使培养基从无荧光的靛青蓝变成有荧光的粉红色，在不影响样品中的结核分枝杆菌的前提下，对其增殖，将单一的检测样品等分多份，便于对结核分枝杆菌的潜伏特性以及发病率进行多重检测，完善现有的不足；
48.s4：使用普通分光光度计或荧光光度计进行检测，当吸光度和荧光强度与活性细菌数成正比时，说明样品合格，反之不合格。
49.本实施例中，还包括取步骤二中其中一份溶液，采用高保真dna聚合酶和非高保真dna聚合酶混合酶作为聚合酶,对结核分枝杆菌的dna样品进行pcr扩增，并检测pcr扩增产物的形成与否，其中，如果形成扩增产物,则表示所述的结核分枝杆菌含有利福平耐药突变。
50.本实施例中，s1中加入的培养基为察氏培养基。
51.本实施例中，在s2中，观察样品增殖的时间为30min。
52.本实施例中，s1中的玻璃培养皿直径为10cm。
53.实施例3
54.与上述实施例中的不同之处在于：本实施例中，在步骤一中的活性检测方法如下：
55.s1：将待测样品放置在玻璃培养皿中，并在培养皿中添加培养基，并培养10min；
56.s2：添加alamarblue氧化还原指示剂，并观察氧化状态下，样品增殖情况；
57.s3：观察添加alamarblue氧化还原指示剂后，样品颜色，摄入菌体内的alamarblue
氧化还原指示剂被代谢中间体还原后释放到体外并溶于培养基中,使培养基从无荧光的靛青蓝变成有荧光的粉红色，在不影响样品中的结核分枝杆菌的前提下，对其增殖，将单一的检测样品等分多份，便于对结核分枝杆菌的潜伏特性以及发病率进行多重检测，完善现有的不足；
58.s4：使用普通分光光度计或荧光光度计进行检测，当吸光度和荧光强度与活性细菌数成正比时，说明样品合格，反之不合格。
59.本实施例中，还包括取步骤二中其中一份溶液，采用高保真dna聚合酶和非高保真dna聚合酶混合酶作为聚合酶,对结核分枝杆菌的dna样品进行pcr扩增，并检测pcr扩增产物的形成与否，其中，如果形成扩增产物,则表示所述的结核分枝杆菌含有利福平耐药突变。
60.本实施例中，s1中加入的培养基为察氏培养基。
61.本实施例中，在s2中，观察样品增殖的时间为20min。
62.本实施例中，s1中的玻璃培养皿直径为10cm。
63.尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。