一种包装重组流感病毒的重组载体和重组流感病毒及其构建方法和应用与流程

本发明属于生物医药
技术领域：
，具体涉及一种包装重组流感病毒的重组载体和重组流感病毒及其构建方法和应用。
背景技术：
：流感病毒广泛流行于禽类，哺乳动物及人。宿主分布广，变异快，常给人类和动物养殖业如禽类和猪带来较大疾病负担。从病毒分类学讲，流感病毒属于有囊膜的rna病毒，其rna为负股，囊膜病毒基因组分节段。流感病毒基因组由八个分节段的线性基因片段构成（c型流感病毒只有七个基因片段），八个基因片共段编码十个蛋白，分别为：rna依赖性rna聚合酶（pb2，pb1，pa），形成核衣壳的核蛋白np，基质膜蛋白（m1和m2），两个表面膜蛋白（血凝素ha和神经氨酸酶na），非结构蛋白ns1和核出运蛋白nep。病毒基因的转录和复制发生于宿主细胞核内，病毒组装和出芽形成于宿主细胞膜。两个不同流感病毒同时感染一个细胞时会发生基因重配。流感病毒通过其表面糖蛋白ha吸附宿主细胞膜上的唾液酸寡聚糖。病毒粒子被内吞后，ha在内吞小体中发生构象变化，促使膜融合发生，进而使病毒脱掉衣壳。之后核衣壳蛋白移至核小体附近，病毒rna开始被转录。病毒rna转录时通过病毒内切酶将宿主细胞异源mrna的加帽5'-末端剪切掉，使之成为病毒rna模板被病毒逆转录酶转录的引物。转录子终止于模板末尾15-22个碱基，这些寡聚核苷（u）序列作为加上多聚polya信号。流感病毒为分节段rna病毒，其病毒基因组在宿主细胞核内被复制好后出核并与粗面内质网内翻译加工修饰好的结构蛋白相遇，此时八条病毒rna（vrna）会被包装到一个成熟病毒粒子里然后出芽形成新的具有感染性的子代病毒。目前较为清晰流感病毒包装机制仍不清楚，但已有的研究表明病毒vrna包装是选择性的，而非随机包装。八个基因片段中每个基因的3'和5'端基因序列作为不同片段的特异性包装信号可使病毒vrna有序高效的包装到一个病毒粒子，形成子代感染性病毒颗粒。也有研究表明存在少于八个基因片段的病毒粒子，但此类病毒粒子数量少，感染力不确定。流感病毒在遗传进化过程中产生很多天然基因缺失或插入，但主要以缺失最为普遍。这些缺失或插入对病毒的致病性，宿主范围扩大，新宿主适应都有重要作用。基因缺失主要集中在na基因和ns1基因，尤其是动物源性流感病毒在感染和适应新宿主的过程中会经常出现，且缺失的具体位置和数目在不同毒株之间会有所差异。插入主要出现在低致病性流感病毒变为高致病性流感病毒时，在ha基因的切割位点/glf基序前插入多个碱性氨基酸，如rkkr等。此类ha蛋白多个碱性氨基酸的插入只出现在h5和h7亚型流感病毒中。流感病毒这些缺失和插入表明病毒的基因组在这些位置可以容忍变异，因此人们尝试通过缺失的位置改造流感病毒，如ns1基因缺失病毒等。以往的研究表明利用流感病毒作为载体表达外源蛋白都集中在a型流感病毒基因组出现天然缺失的位置，如神经氨酸酶基因（na）和非结构蛋白1（ns1）。这些位置出现缺失即表明病毒可以容忍缺失变异，但可以插入的外源基因片段不宜过大，且无需改造3'和5'包装信号，即3'包装信号序列-病毒基因orf-（2a）外源蛋白基因序列-5'包装信号序列。这样的重组病毒多用于报告病毒系统，即病毒表达gfp或者luciferase等，但是并不适合报告基因以外的较大的外源基因片段。技术实现要素：有鉴于此，本发明的目的在于提供一种包装重组流感病毒的重组载体和重组流感病毒及其构建方法和应用，所述重组流感病毒可在复制过程中表达具有生物学活性和免疫原性的外源蛋白，可作为免疫原，从而应用于免疫治疗中。为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：本发明提供了一种包装重组流感病毒的重组载体，所述重组载体的结构包括：流感病毒pa序列、包装信号序列、2a序列、il2信号肽序列和外源序列；所述重组载体以携带poli和polii的载体为基础载体。优选的，所述流感病毒包括a型流感病毒毒株。优选的，所述流感病毒毒株包括a/puertorico/8/1934（h1n1亚型）。优选的，所述包装信号序列包括5'端包装信号序列。优选的，所述包装信号序列包括csps优化序列，所述csps的优化序列包括seqidno.4所示的序列。优选的，所述外源序列包括传染病病毒的基因片段或肿瘤细胞的基因片段。优选的，所述传染病病毒包括：流感病毒、乙肝病毒、艾滋病病毒、呼吸道合胞病毒、冠状病毒、ebv、hcmv、ev71、rsv、ebola和ndv。优选的，所述冠状病毒包括mers-cov和sars-cov-2。优选的，当所述冠状病毒为sars-cov-2时，所述重组载体的结构包括：流感病毒pa序列-包装信号序列-2a序列-il2信号肽序列-sars-cov-2rbd序列-cd80序列。本发明还提供了上述重组载体的构建方法，包括以下步骤：将所述流感病毒pa序列连接入线性化的基础载体上，得连接模板，利用in-fusion方法，依次将所述包装信号序列、2a序列、il2信号肽序列和外源序列与所述连接模板进行连接，得所述重组载体。本发明还提供了一种重组载体的构建方法，包括以下步骤：将bsmbi线性化的phw2000载体与源自a/puertorico/8/1934的pa基因进行in-fusion连接，得初级载体phw2000-pr8_pa；（2）利用in-fusion方法依次将csps优化序列、2a序列、il2信号肽序列、sars-cov-2rbd序列、cd80序列和pr8-pa基因包装信号序列连接到初级载体phw2000-pr8_pa上，得到重组载体phw2000-pr8_pa-rbd；所述sars-cov-2rbd序列包括seqidno.1所示的核苷酸序列；所述pr8-pa基因包装信号序列如seqidno.5所示。本发明还提供了一种重组流感病毒的构建方法，分别将流感病毒的ha基因、na基因、pb2基因、pb1基因、np基因、m基因和ns基因序列连接入线性化的基础载体，得7个初级载体，利用八质粒反向遗传系统，将所述初级载体和上述重组载体共同转染293t细胞的混合细胞，包装得重组流感病毒。优选的，在构建所述7个初级载体和所述重组载体时，利用相同的酶切位点线性化所述基础载体。优选的，所述酶切位点包括bsmbi。本发明还提供了利用上述构建方法构建得到的重组流感病毒。本发明还提供了上述重组流感病毒在制备病毒免疫治疗和/或抗体免疫治疗的药物或疫苗中的应用。本发明还提供了一种重组流感病毒rgh1n1（pr8）-pa-rbd的构建方法，包括以下步骤：（1）分别将bsmbi线性化的phw2000载体与源自a/puertorico/8/1934的ha基因、na基因、pb2基因、pb1基因、pa基因、np基因、m基因和ns基因进行in-fusion连接，得初级载体phw2000-pr8_ha、phw2000-pr8_na、phw2000-pr8_pb2、phw2000-pr8_pb1、phw2000-pr8_pa、phw2000-pr8_np、phw2000-pr8_m和phw2000-pr8_ns；（2）利用in-fusion方法依次将csps优化序列、2a序列、il2信号肽序列、sars-cov-2rbd序列、cd80序列和pr8-pa基因包装信号序列连接到初级载体phw2000-pr8_pa上，得到重组载体phw2000-pr8_pa-rbd；所述sars-cov-2rbd序列包括seqidno.1所示的核苷酸序列；所述pr8-pa基因包装信号序列如seqidno.5所示；（3）将重组载体phw2000-pr8_pa-rbd与初级载体phw2000-pr8_ha、phw2000-pr8_na、phw2000-pr8_pb2、phw2000-pr8_pb1、phw2000-pr8_np、phw2000-pr8_m和phw2000-pr8_ns等质量混合，转染293t细胞的混合细胞，收集转染上清为e0代病毒；（4）将所述e0代病毒接种至鸡胚尿囊腔，培养48~72小时，收获鸡胚尿囊液，血凝阳性即为包装得到的重组流感病毒rgh1n1（pr8）-pa-rbd，所述接种的量为0.2ml/鸡胚。优选的，步骤（3）所述293t细胞的混合细胞与混合载体的比值为5×104个细胞/4μg。优选的，步骤（4）所述培养的条件包括：33℃或37℃，5%co2浓度。本发明还提供了利用上述构建方法构建得到的重组流感病毒rgh1n1（pr8）-pa-rbd。本发明还提供了上述重组流感病毒rgh1n1（pr8）-pa-rbd在制备预防流感和covid-19的疫苗中的应用。本发明还提供了一种预防流感和covid-19的疫苗，所述疫苗包括上述重组流感病毒rgh1n1（pr8）-pa-rbd。优选的，所述疫苗的剂型包括滴鼻剂。优选的，所述疫苗的血凝滴度不低于128hau/50μl。本发明提供了一种包装重组流感病毒的重组载体，在实施例中利用a型流感病毒八个基因片段为骨架包装出带有新型冠状病毒sars-cov-2表面刺突蛋白受体结合域（sars-cov-2_rbd）片段的重组流感病毒，此重组流感病毒可在复制过程中表达具有生物学活性和免疫原性的刺突蛋白受体结合区域rbd。本发明所述重组流感病毒rgh1n1（pr8）-pa-rbd可作为重组病毒类药物或疫苗，用于2019新型冠状病毒肺炎（covid-19）的预防；也可作为体外sars-cov-2rbd等相关抗原表达和体内递呈系统。在本发明中，a型流感病毒聚合酶基因pa的包装信号肽（pr8-pa基因包装信号序列），使克隆到pa基因中的sars-cov-2_rbd基因片段在病毒传代过程中稳定遗传并在体内外复制过程中表达出具有生物学活性的免疫原。因此，带有rbd基因的重组流感病毒在体外感染细胞，体内感染动物以及人时可表达该抗原，作为免疫治疗的药物组分。与野生型病毒相比，本发明所述重组流感病毒对小鼠的致病性大幅降低；感染小鼠后可以刺激产生针对rbd的特异性保护抗体，并且所述重组流感病毒具有和野生a型流感病毒相似的生物学特性：体外复制滴度高；对小鼠致病力低。因此，本发明所述的重组流感病毒可用来表达外源蛋白，如rbd等，且该重组流感病毒可成为可预防covid-19的有效药物和疫苗。附图说明图1为pa基因改造模式图；图2为pcr鉴定重组流感病毒外源基因的表达，且图中重组流感病毒以pa-rba-cd80表示；图3为免疫荧光检测感染重组流感病毒的mdck中表达rbd；图4为wb检测重组流感病毒感染mdck后rbd表达，且图中重组流感病毒以pa-rba-cd80表示；图5为pr8野生型病毒和带有rbd基因的重组流感病毒mdck滴度；图6为rbd特异性抗体持续时间；图7为攻毒保护试验结果。具体实施方式本发明提供了一种包装重组流感病毒的重组载体，所述重组载体的结构包括：流感病毒pa序列、包装信号序列、2a序列、il2信号肽序列和外源序列；所述重组载体以携带poli和polii的载体为基础载体。本发明所述流感病毒优选包括a型流感病毒毒株，更优选a/puertorico/8/1934（h1n1，pr8）。本发明对所述a/puertorico/8/1934的来源并没有特殊限定，优选购自zoonogen。本发明所述包装信号序列优选包括5'端包装信号序列，更优选包括csps优化序列，所述csps的优化序列包括seqidno.4所示的序列。本发明对csps原始序列进行优化后，保证氨基酸序列不变而核苷酸序列第三位突变，使之失去包装信号被识别功能。本发明所述外源序列优选包括传染病病毒的基因片段或肿瘤细胞的基因片段，所述传染病病毒优选包括：流感病毒、乙肝病毒、艾滋病病毒、呼吸道合胞病毒、冠状病毒、ebv、hcmv、ev71、rsv、ebola和ndv，所述冠状病毒优选包括mers-cov和sars-cov-2。在本发明中，当所述冠状病毒为sars-cov-2时，所述重组载体的结构优选如图1所示，包括：流感病毒pa序列-包装信号序列-2a序列-il2信号肽序列-sars-cov-2rbd序列-cd80序列。在本发明实施例中，所述流感病毒pa序列优选如如mz310488所示，包装信号序列优选如seqidno.4所示；所述2a序列优选来源于猪捷申病毒1型病毒（porcineteschovirus-1，ptv-1，genbankaccessionaf296103），序列如seqidno.6所示；所述il2信号肽序列优选来自人，其序列优选如seqidno.7所示（genbankaccessionx00695）。在本发明中，使病毒pa的vrna带上了sars-cov-2_rbd基因后，优选再加入t细胞刺激序列cd80羧基端部分序列（cd80氨基酸位置237-306，seqidno.8：ppedppdskntlvlfgagfgavitvvvivviikcfckhrscfrrneasretnnsltfgpeealaeqtvfl）。本发明所述基础载体优选包括phw2000载体，所述载体优选购自zoonogen创新研发中心。本发明还提供了上述重组载体的构建方法，包括以下步骤：将所述流感病毒pa序列连接入线性化的基础载体上，得连接模板，利用in-fusion方法，依次将所述包装信号序列、2a序列、il2信号肽序列和外源序列与所述连接模板进行连接，得所述重组载体。本发明在构建所述重组载体时，优选利用bsmbi酶线性化所述基础载体phw2000载体，而后依次与上述包装信号序列、2a序列、il2信号肽序列和外源序列进行in-fusion连接。本发明对所述in-fusion连接的方法并没有特殊限定，优选使用clonetech公司的in-fusion试剂盒，根据说明书操作即可。本发明还提供了一种重组载体的构建方法，包括以下步骤：将bsmbi线性化的phw2000载体与源自a/puertorico/8/1934的pa基因进行in-fusion连接，得初级载体phw2000-pr8_pa；（2）利用in-fusion方法依次将csps优化序列、2a序列、il2信号肽序列、sars-cov-2rbd序列、cd80序列和pr8-pa基因包装信号序列连接到初级载体phw2000-pr8_pa上，得到重组载体phw2000-pr8_pa-rbd；所述sars-cov-2rbd序列包括seqidno.1所示的核苷酸序列；所述pr8-pa基因包装信号序列如seqidno.5所示。本发明还提供了一种重组流感病毒的构建方法，分别将流感病毒的ha基因、na基因、pb2基因、pb1基因、np基因、m基因和ns基因序列连接入线性化的基础载体，得7个初级载体，利用八质粒反向遗传系统，将所述初级载体和上述重组载体共同转染293t细胞的混合细胞，包装得重组流感病毒。本发明利用八质粒反向遗传系统构建重组流感病毒，因此在构建前还需要对流感病毒的ha基因（mz310489）、na基因（mz310491）、pb2基因（mz310486）、pb1基因（mz310487）、np基因（mz310490）、m基因（mz310492）和ns基因（mz310493）序列分别与相同酶切位点线性化的基础载体进行in-fusion连接，而后将得到的7个初级载体与上述重组载体进行等重量混合，如在本发明实施例中各取0.5µg进行混合，得到包装病毒所需混合载体。本发明对所述转染的方法并没有特殊限定，优选将所述混合载体与293t细胞的混合细胞按照4μg：5×104个细胞的比例进行。本发明还提供了利用上述构建方法构建得到的重组流感病毒。本发明所述重组流感病毒，利用a型流感病毒聚合酶基因pa的5’和3’端病毒颗粒包装信号序列，将编码外源蛋白的基因片段装在流感病毒pa基因3’末端，通过反向遗传技术拯救并包装出具有感染和复制活性的重组流感病毒，所述重组流感病毒在复制过程中能够表达有活性的外源蛋白。与野生型病毒相比，所述重组流感病毒对小鼠的致病性大幅降低；感染小鼠后可以刺激产生针对外源蛋白的特异性保护抗体。本发明还提供了上述重组流感病毒在制备病毒免疫治疗和/或抗体免疫治疗的药物或疫苗中的应用。本发明还提供了一种重组流感病毒rgh1n1（pr8）-pa-rbd的构建方法，包括以下步骤：（1）分别将bsmbi线性化的phw2000载体与源自a/puertorico/8/1934的ha基因、na基因、pb2基因、pb1基因、pa基因、np基因、m基因和ns基因进行in-fusion连接，得初级载体phw2000-pr8_ha、phw2000-pr8_na、phw2000-pr8_pb2、phw2000-pr8_pb1、phw2000-pr8_pa、phw2000-pr8_np、phw2000-pr8_m和phw2000-pr8_ns；（2）利用in-fusion方法依次将csps优化序列、2a序列、il2信号肽序列、sars-cov-2rbd序列、cd80序列和pr8-pa基因包装信号序列连接到初级载体phw2000-pr8_pa上，得到重组载体phw2000-pr8_pa-rbd；所述sars-cov-2rbd序列包括seqidno.1所示的核苷酸序列；所述pr8-pa基因包装信号序列如seqidno.5所示；（3）将重组载体phw2000-pr8_pa-rbd与初级载体phw2000-pr8_ha、phw2000-pr8_na、phw2000-pr8_pb2、phw2000-pr8_pb1、phw2000-pr8_np、phw2000-pr8_m和phw2000-pr8_ns等质量混合，转染293t细胞的混合细胞，收集转染上清为e0代病毒；（4）将所述e0代病毒接种至鸡胚尿囊腔，培养48~72小时，收获鸡胚尿囊液，血凝阳性即为包装得到的重组流感病毒rgh1n1（pr8）-pa-rbd，所述接种的量为0.2ml/鸡胚。本发明步骤（1）和步骤（2）中所述in-fusion连接或in-fusion方法相同，均为利用clonetech公司的in-fusion试剂盒，根据说明书操作即可。本发明所述重组载体phw2000-pr8_pa-rbd的核苷酸序列优选如seqidno.2所示，其编码表达的氨基酸序列如seqidno.3所示，其中pr8-pa基因包装信号序列不翻译表达。本发明步骤（3）中，所述293t细胞的混合细胞在进行转染前，优选还包括将生长良好的293t细胞（atcc-crl-3216）t75，用0.25%edta-胰酶（edta-trypsin）消化后，1000rpm离心10min；离心后打散，用10ml的opti-mem重悬；取重悬后的293t补足opti-mem至20ml，取一块六孔板，每孔加入3ml重悬的293t细胞悬液（5×104）后放入37℃孵箱培养过夜。本发明在进行转染时，优选将上述7个初级载体和重组载体进行等量混合，各取0.5μg。本发明优选向上述混合载体中加入脂质体10µl，室温放置20min后，补足opti-mem至1ml。吸出六孔板内废液，加入混有质粒的opti-mem，然后将混合物加入提前铺好的293t细胞，并将之放入33℃和37℃5%co2孵箱过夜。次日，每孔补1ml含有2µg/mltpck-trypsin的opti-mem，并放在二级生物安全实验室内37℃5%co2孵箱内培养48小时后收取细胞悬液。收集的转染上清为e0代病毒，用1%火鸡红细胞测定其血凝滴度在本发明步骤（4）中，优选9至11日龄spf鸡胚，照检以观察鸡胚活力状况。在胚胎面和气室交界边缘避开血管以及鸡胚头部做标记，即为接种注射点，以0.2ml/鸡胚的细胞转染悬液量进行鸡胚尿囊腔接种。在所述接种后，本发明优选还用蜡封口鸡胚后放至33℃和37℃孵箱培养，48~72小时收获鸡胚尿囊液，使用1%火鸡红细胞测定血凝滴度，血凝阳性即为包装得到的重组流感病毒rgh1n1（pr8）-pa-rbd（或简写为pa-rbd），病毒代次为鸡胚1代（e1）。所获得的重组病毒血凝滴度均在128hau/50µl（即27）以上。本发明还提供了利用上述构建方法构建得到的重组流感病毒rgh1n1（pr8）-pa-rbd。本发明所述重组流感病毒pa-rbd在拯救过程中所携带的rbd外源基因可以被复制、转录、表达和剪切，且包装进入子代病毒粒子；利用重组流感病毒感染细胞和小鼠，感染过程中rbd基因在人源细胞系（293t）中表达，滴鼻感染小鼠后可刺激小鼠产生针对sars-cov-2_rbd的特异性抗体，利用致死剂量sars-cov-2病毒对该重组流感病毒感染免疫后的小鼠进行攻毒，结果显示感染免疫pa-rbd后的小鼠都能存活，而感染pr8野生型病毒或滴鼻pbs的小鼠全部死亡。本发明还提供了上述重组流感病毒rgh1n1（pr8）-pa-rbd在制备预防流感和covid-19的疫苗中的应用。本发明还提供了一种预防流感和covid-19的疫苗，所述疫苗包括上述重组流感病毒rgh1n1（pr8）-pa-rbd。本发明所述疫苗的剂型优选包括滴鼻剂，所述疫苗的血凝滴度不低于128hau/50μl。下面结合实施例对本发明提供的一种包装重组流感病毒的重组载体和重组流感病毒及其构建方法和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。实施例11、流感质粒构建对phw2000载体（zoonogen创新研发中心）、酶切缓冲液3（neb3），bsmbi10u，总体积50µl，55℃酶切过夜。电泳胶回收3000bp左右大小的片段，即为线性化phw2000载体。使用clonetech公司的in-fusion试剂盒，根据说明书进行如下实验：用线性化后和源自a/puertorico/8/1934（h1n1，pr8）的ha基因进行in-fusion连接，得到重组载体phw2000-pr8_ha（经过测序，插入的ha片段序列与mz310489一致）；用线性化phw2000载体和源自a/puertorico/8/1934的na基因进行in-fusion连接，得到重组载体phw2000-pr8_na（经过测序，插入的na基因序列与mz310491一致）；用线性化phw2000载体和源自a/puertorico/8/1934的pb2基因进行in-fusion连接，得到重组载体phw2000-pr8_pb2（经过测序，插入的pb2的基因序列与mz310486一致）；用线性化phw2000载体和源自a/puertorico/8/1934的pb1基因进行in-fusion连接，得到重组载体phw2000-pr8_pb1（经过测序，插入的pb1的基因序列与mz310487一致）；用线性化phw2000载体和源自a/puertorico/8/1934的pa基因进行in-fusion连接，得到重组载体phw2000-pr8_pa（经过测序，插入的pa的基因序列与mz310488一致）；用线性化phw2000载体和源自a/puertorico/8/1934的np基因进行in-fusion连接，得到重组载体phw2000-pr8_np（经过测序，插入的np基因序列与mz310490一致）；用线性化phw2000载体和源自a/puertorico/8/1934的m基因进行in-fusion连接，得到重组载体phw2000-pr8_m（经过测序，插入的np基因序列与mz310492一致）；用线性化phw2000载体和源自a/puertorico/8/1934的ns基因进行in-fusion连接，得到重组载体phw2000-pr8_ns（经过测序，插入的np基因序列与mz310493一致）；以重组载体phw2000-pr8_pb1为模板，依次将突变的包装序列（csps，seqidno.4），ptv-1-2a序列（seqidno.6），il2信号肽序列（seqidno.7），sars-cov-2表面刺突蛋白受体结合域（spike-rbd，seqidno.1），cd80序列（seqidno.8）和pb8-pa基因包装信号序列（seqidno.5）通过in-fusion方法链接，得到重组载体phw2000-pr8_pb1-rbd（seqidno.2和seqidno.3）。2、转染拯救病毒1）混合载体：将phw2000-pr8_ha，phw2000-pr8_na，phw2000-pr8_pb2，phw2000-pr8_pa，phw2000-pr8_np，phw2000-pr8_m，phw2000-pr8_ns和phw2000-pr8_pa-rbd各0.5µg混合，得到包装病毒所需混合载体；2）取生长状态良好的293t细胞(atcc-crl-3216)t75一瓶，用0.25%edta-胰酶(edta-trypsin)消化后，1000rpm离心10min。离心后打散，用10ml的opti-mem重悬。取重悬后的293t补足opti-mem至20ml，取一块六孔板，每孔加入3ml重悬的293t细胞悬液(5×104)后放入37℃孵箱培养过夜。3)分别将上述混合载体体系中加入脂质体10µl，室温放置20min后，补足opti-mem至1ml。吸出提前培养好的细胞的六孔板内废液后，将上述1mlopti-mem加入六孔板并放入33℃和37℃5%co2孵箱过夜。次日，每孔补1ml含有2µg/mltpck-trypsin的opti-mem，并放在二级生物安全实验室内33℃和37℃5%co2孵箱内培养48小时后收取细胞悬液。收集的转染上清为e0代病毒，用1%火鸡红细胞测定其血凝滴度（worldhealthorganization，manualonanimalinfluenzadiagnosisandsurveillance,serologicdiagnosisofinfluenzavirusinfectionsbyhemagglutinationinhibition，edition4,78-79,2004）。4)选取9至11日龄spf鸡胚，照检以观察鸡胚活力状况。在胚胎面和气室交界边缘避开血管以及鸡胚头部做标记，即为接种注射点。用75%酒精消毒标记处及周围，用钻蛋器钻孔，勿伤壳膜。5)以0.2ml/鸡胚的细胞转染悬液量进行鸡胚尿囊腔接种，每个样品接种两枚鸡胚。6)用蜡封口鸡胚后放至33℃和37℃孵箱培养，48~72小时收获鸡胚尿囊液，使用1%火鸡红细胞测定血凝滴度。血凝阳性即为包装得到的重组病毒pb1-rbd，病毒代次为鸡胚1代(e1)。所获得的重组病毒血凝滴度均在128hau/50ml(即27)以上。通过鸡胚致病性评价，体外胰酶依赖性复制和体内小鼠试验证明本发明所制备的重组流感病毒具有可靠的安全性。具体表现在以下三个方面：1)重组流感病毒对鸡胚无致病性；2）重组病毒需要额外添加tpck-typsin才可以在mdck细胞上复制；3）以1x108tcid50的剂量滴鼻感染小鼠，观察14天无明显症状。裂解鸡胚连续传五代的重组病毒，核酸算扩增出抗体基因并测序验证抗体基因没有突变，同时进行遗传稳定性测定（表1）。表1重组流感病毒基因遗传稳定性测定代次血凝滴度ha基因序列检测抗原检测(elisa)e129正确阳性e2210正确阳性e3210正确阳性e4210正确阳性e5210正确阳性3、重组流感病毒外源基因检测检测甲型流感病毒(iav)rgh1n1(pr8)-pa-rbd中的转基因片段。提取病毒rna并进行rt-pcr以扩增未插入外源片段的pa末端300bp；rgh1n1(pr8)-pa-rbd的预期pcr产物分别为1365bp。pcr引物：pb1-f（seqidno.9）：ccatcttgaatacaagtcaaagagg；pb1-r（seqidno.10）：agtagaaacaaggcattttttcatg。pcr试剂选择takarataqdnapolymerase（hotstart，货号r007a），程序：95℃预变性2min；95℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸2min，35个循环。4、重组流感病毒rgh1n1（pr8）-pa-rbd表达sars-cov-2表面刺突蛋白受体结合域(spike-rbd)的鉴定用人sars-cov-2rbd定量试剂盒(zoonogen，cat.el20200013对鸡胚培养48~72小时后尿囊液进行rbd蛋白定量检测，结果表明平均一个鸡胚33℃和37℃培养73h后尿囊液中表达的重组rbd蛋白的量约为20μg5、用10个moi（multipleofinfection）剂量的重组流感病毒rgh1n1（pr8）-pa-rbd感染mdck单层细胞后，6小时后用免疫荧光方法检测rbd表达如图3所示；24小时后mdck细胞裂解后进行wb检测rbd结果如图4所示，以上两种检测结果表面重组流感病毒体外感染易感细胞系后可以表达生物学活性完整的重组rbd蛋白。6、利用小鼠半致死染量（mld50）测定重组流感病毒rgh1n1（pr8）-pb1-rbd和野生型pr8对小鼠的致病性，结果如表2所示，与野生型流感病毒相比，重组流感病毒对小鼠的致病性明显下降。表2野生型和重组病毒对小鼠的半数致死量病毒mld50pr8wt102tcid50重组流感病毒>106tcid507、利用空版试验测定重组流感病毒rgh1n1（pr8）-pa-rbd生长曲线，病毒体外复制滴度（mdck细胞）结果如图5所示，重组流感病毒与野生型流感病毒在鸡胚的复制能力无明显区别，而在mdck细胞上重组流感病毒比野生型流感病毒复制滴度降低0.5个log值，为后期疫苗制备提供依据。8、动物试验（与活病毒相关的试验均在生物安全防护三级实验室操作）8.1小鼠免疫（1）在异氟烷吸入麻醉下，用25μl含105pfu重组流感病毒滴鼻(i.n.)感染免疫8周龄雄性balb/c小鼠30只，感染后7天、14天、21天、28天和35天，每只小鼠分别眼眶采血获得血清约50μl；同时采集呼吸道灌洗液。（2）利用间接elisa测定所采集血清中sars-cov-2_rbd特异性结合抗体滴度，同时利用sars-cov-2假病毒体系测定血清中和抗体滴度。结果如图6所示，免疫小鼠产生了针对rbd的特异性中和抗体，且持续时间至少大于70天。除了血清中存在中和抗体外，呼吸道灌洗液中同时可以检测到特异性黏膜iga。此外，免疫小鼠滴鼻免疫后20天，采集小鼠脾脏组织，测定t细胞免疫反应。疫后小鼠可诱导产生针对rbd的特异性cd4+和cd8+t淋巴细胞。8.2攻毒保护试验根据免疫小鼠血清中rbd特异性抗体动态曲线（图6），将20只感染免疫后15天的小鼠作为攻毒对象，20只空白小鼠作为对照。用25μl含有5个ld50的sars-cov-2鼠肺适应株（s2_ma36）滴鼻感染小鼠。结果如图7所示，感染3周后，免疫组20只小鼠全部存活，整个感染过程小鼠无明显症状；而20只对照小鼠全部死亡，且肺部病变明显。8.3被动血清治疗采集免疫小鼠20天后血清（ms_20dpi），感染sars-cov-2的小鼠前一天腹腔注射免疫血清150μl/只，感染后观察14天，记录体重。结果免疫血清治疗组小鼠全部存活，而病毒对照组小鼠出现死亡，因此证实本发明提供的表面疫苗免疫产生的抗体可以给小鼠提供完全的免疫保护。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。序列表<110>北京溯本源和生物科技有限公司<120>一种包装重组流感病毒的重组载体和重组流感病毒及其构建方法和应用<160>10<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>717<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1ttcactgtagaaaaaggaatctatcaaacttctaactttagagtccaaccaacagaatct60attgttagatttcctaatattacaaacttgtgcccttttggtgaagtttttaacgccacc120agatttgcatctgtttatgcttggaacaggaagagaatcagcaactgtgttgctgattat180tctgtcctatataattccgcatcattttccacttttaagtgttatggagtgtctcctact240aaattaaatgatctctgctttactaatgtctatgcagattcatttgtaattagaggtgat300gaagtcagacaaatcgctccagggcaaactggaaagattgctgattataattataaatta360ccagatgattttacaggctgcgttatagcttggaattctaacaatcttgattctaaggtt420ggtggtaattataattacctgtatagattgtttaggaagtctaatctcaaaccttttgag480agagatatttcaactgaaatctatcaggccggtagcacaccttgtaatggtgttgaaggt540tttaattgttactttcctttacaatcatatggtttccaacccactaatggtgttggttac600caaccatacagagtagtagtactttcttttgaacttctacatgcaccagcaactgtttgt660ggacctaaaaagtctactaatttggttaaaaacaaatgtgtcaatttcaacttctaa717<210>2<211>3298<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2agcgaaagcaggtactgatccaaaatggaagattttgtgcgacaatgcttcaatccgatg60attgtcgagcttgcggaaaaaacaatgaaagagtatggggaggacctgaaaatcgaaaca120aacaaatttgcagcaatatgcactcacttggaagtatgcttcatgtattcagattttcac180ttcatcaatgagcaaggcgagtcaataatcgtagaacttggtgatccaaatgcacttttg240aagcacagatttgaaataatcgagggaagagatcgcacaatggcctggacagtagtaaac300agtatttgcaacactacaggggctgagaaaccaaagtttctaccagatttgtatgattac360aaggagaatagattcatcgaaattggagtaacaaggagagaagttcacatatactatctg420gaaaaggccaataaaattaaatctgagaaaacacacatccacattttctcgttcactggg480gaagaaatggccacaaaggcagactacactctcgatgaagaaagcagggctaggatcaaa540accagactattcaccataagacaagaaatggccagcagaggcctctgggattcctttcgt600cagtccgagagaggagaagagacaattgaagaaaggtttgaaatcacaggaacaatgcgt660aagcttgccgaccaaagtctcccgccgaacttctccagccttgaaaattttagagcctat720gtggatggattcgaaccgaacggctacattgagggcaagctgtctcaaatgtccaaagaa780gtaaatgctagaattgaaccttttttgaaaacaacaccacgaccacttagacttccgaat840gggcctccctgttctcagcggtccaaattcctgctgatggatgccttaaaattaagcatt900gaggacccaagtcatgaaggagagggaataccgctatatgatgcaatcaaatgcatgaga960acattctttggatggaaggaacccaatgttgttaaaccacacgaaaagggaataaatcca1020aattatcttctgtcatggaagcaagtactggcagaactgcaggacattgagaatgaggag1080aaaattccaaagactaaaaatatgaagaaaacaagtcagctaaagtgggcacttggtgag1140aacatggcaccagaaaaggtagactttgacgactgtaaagatgtaggtgatttgaagcaa1200tatgatagtgatgaaccagaattgaggtcgcttgcaagttggattcagaatgagtttaac1260aaggcatgcgaactgacagattcaagctggatagagctcgatgagattggagaagatgtg1320gctccaattgaacacattgcaagcatgagaaggaattatttcacatcagaggtgtctcac1380tgcagagccacagaatacataatgaagggagtgtacatcaatactgccttgcttaatgca1440tcttgtgcagcaatggatgatttccaattaattccaatgataagcaagtgtagaactaag1500gagggaaggcgaaagaccaacttgtatggtttcatcataaaaggaagatcccacttaagg1560aatgacaccgacgtggtaaactttgtgagcatggagttttctctcactgacccaagactt1620gaaccacataaatgggagaagtactgtgttcttgagataggagatatgcttataagaagt1680gccataggccaggtttcaaggcccatgttcttgtatgtgagaacaaatggaacctcaaaa1740attaaaatgaaatggggaatggagatgaggcgttgcctcctccagtcacttcaacaaatt1800gagagtatgattgaagctgagtcctctgtcaaagagaaagacatgaccaaagagttcttt1860gagaacaaatcagaaacatggcccattggagagtcccccaaaggagtggaggaaagttcc1920attgggaaggtctgcaggactttattagcaaagtcggtattcaacagcttgtatgcatct1980ccacaactagaaggattttcagctgaatcaagaaaactgcttcttatcgttcaggctctt2040agggacaacctcgagccaggaacgttcgacctaggaggactgtacgaggcgatcgaagaa2100tgtctcataaacgacccttgggtattactaaacgcatcatggtttaactcgttcctgact2160cacgctttaagcggatctggagccacgaacttctctctgttaaagcaagcaggagatgtt2220gaagaaaaccccgggcctatgtacaggatgcaactcctgtcttgcattgcactaagtctt2280gcacttgtcacgaattcgaatataacaaatctttgcccattcggagaagtgttcaatgca2340acaagattcgcatcagtgtatgcatggaatagaaaaagaatatcaaattgcgtggcagat2400tattcagtgctttataattcagcatcattctcaacattcaaatgctatggagtgtcacca2460acaaaacttaatgatctttgcttcacaaatgtgtatgcagattcattcgtgataagagga2520gatgaagtgagacaaatagcaccaggacaaacaggaaaaatagcagattataattataaa2580cttccagatgatttcacaggatgcgtgatagcatggaattcaaataatcttgattcaaaa2640gtgggaggaaattataattatctttatagacttttcagaaaatcaaatcttaaaccattc2700gaaagagatatatcaacagaaatatatcaagcaggatcaacaccatgcaatggagtggaa2760ggattcaattgctatttcccacttcaatcatatggattccaaccaacaaatggagtggga2820tatcaaccatatagagtggtggtgctttcattcgaacttcttcatgcaccagcaacagtg2880tgcggaccaaaaaaatcaacaccaccagaagatccaccagattcaaaaaatacacttgtg2940cttttcggagcaggattcggagcagtgataacagtggtggtgatagtggtgataataaaa3000tgcttctgcaaacatagatcatgcttcagaagaaatgaagcatcaagagaaacaaataat3060tcacttacattcggaccagaagaagcacttgcagaacaaacagtgttcctttaactggaa3120cctgggacctttgatcttggggggctatatgaagcaattgaggagtgcctgattaatgat3180ccctgggttttgcttaatgcttcttggttcaactccttccttacacatgcattgagttag3240ttgtggcagtgctactatttgctatccatactgtccaaaaaagtaccttgtttctact3298<210>3<211>1029<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>3metgluaspphevalargglncyspheasnprometilevalgluleu151015alaglulysthrmetlysglutyrglygluaspleulysilegluthr202530asnlysphealaalailecysthrhisleugluvalcysphemettyr354045seraspphehispheileasngluglnglygluserileilevalglu505560leuglyaspproasnalaleuleulyshisargphegluileileglu65707580glyargaspargthrmetalatrpthrvalvalasnserilecysasn859095thrthrglyalaglulysprolyspheleuproaspleutyrasptyr100105110lysgluasnargpheilegluileglyvalthrargargglu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