一种桃蛀螟活性抗菌肽及其基因、重组载体和应用

本发明属于基因工程领域，涉及一种抗菌肽，特别是指一种桃蛀螟活性抗菌肽及其基因、重组载体和应用。

背景技术：

抗菌肽（antimicrobialpeptides,amps）是动物体为抵制外来病原物入侵而产生的免疫产物，主要是一类具有抗菌活性的多肽或小分子蛋白质，广泛存在于自然界中的多种生物体内。最早的抗菌肽是从昆虫的淋巴液和青蛙的表皮中分离得到的，现今已从包括人类在内的哺乳动物、昆虫、两栖类动物、植物、细菌及真菌等多种物种中分离出了抗菌肽。其来源途径广阔，根据本身结构和功能的差异，可将抗菌肽分为4类，分别为天蚕素类、防御素类、富含脯氨酸类和富含甘氨酸类。其作用机制也相当复杂，国内外有很多相关研究，目前认为抗菌肽的作用机制主要有3种：作用于细胞壁、作用于细胞膜和作用于细胞内靶点。抗菌肽的合成速度非常快，当生物体受到不明物入侵时能迅速合成抗菌肽第一时间杀伤入侵者，是许多生物先天非特异性防御系统的重要组成部分，因此抗菌肽是生物体的第一道天然免疫防线。

抗菌肽一般由20-60个氨基酸组成，其相对分子质量为2-7kda，通常以阳离子形式存在，不仅对多种微生物具有抑制和杀伤作用，而且在生物体的免疫反应调节方面也具有一定的作用。具有抗菌谱广、强碱性、热稳定性、作用机制独特、不易产生耐药性等特点。因此，抗菌肽在农业、医疗、畜牧、食品及保健品等领域的开发研究与应用方面均有广泛的前景和价值。

昆虫作为动物界种类最多、数量最广的类群，其体内蕴含了大量宝贵的抗菌肽资源亟待开发。本专利以目前农林生产上的重要害虫桃蛀螟为对象，研究了其体内具有活性的抗菌肽资源及其对玉米重要真菌病害的抑菌潜力，不仅变害为宝，更明确了昆虫抗菌肽在植物病害防治中的应用潜力。

技术实现要素：

本发明提出一种桃蛀螟活性抗菌肽及其基因、重组载体和应用，以目前农林生产上的重要害虫桃蛀螟为对象，研究了其体内具有活性的抗菌肽资源及其对玉米重要真菌病害的抑菌潜力，不仅变害为宝，更明确了昆虫抗菌肽在植物病害防治中的应用潜力。

本发明的技术方案是这样实现的：

一种桃蛀螟活性抗菌肽，所述桃蛀螟活性抗菌肽的氨基酸序列如seqidno.1所示。

编码上述的桃蛀螟活性抗菌肽的基因。

所述基因的序列如seqidno.2所示。

含有所述的基因的重组载体。

所述重组载体的连接载体为pet32a（+）、宿主为大肠杆菌rosetta-gamib（de3）。

上述的重组载体的制备方法，步骤如下：

（1）根据权利要求2所述的基因涉及引物对cpalo-13768-f和cpalo-13768-r；

（2）以桃蛀螟的cdna为模板、以步骤（1）的引物对为引物进行pcr扩增；

（3）回收步骤（2）的扩增产物，转化至大肠杆菌感受态细胞，制得重组载体。

所述引物对cpalo-13768-f和cpalo-13768-r的序列分别如seqidno.3、seqidno.4所示。

利用上述的重组载体制备的抗菌肽。

上述的抗菌肽在制备抑制玉米真菌病害的生物农药中的应用。

所述真菌为病原物禾谷镰孢-s、禾谷镰孢-j、玉蜀黍平脐蠕孢、炭色长蠕孢、弯孢霉、拟轮枝镰孢或嘴突脐孢中的一种或多种。

本发明具有以下有益效果：

1、本申请发明人发现了一种新的抗菌肽，抗菌肽cpalo-13768的序列中具有信号肽序列，理论分子量为6.37kda，等电点为8.29，为疏水性稳定蛋白，二级结构中存在3个β转角和由6个保守的半胱氨酸残基形成的3个分子内二硫键构成。表达该抗菌肽的基因cpalo-13768在genbank中未发现相似序列，说明cpalo-13768是，为此基因的改造并在各种外源基因表达系统中高效表达提供优良的基因材料。

2、本发明的抗菌肽对玉米上重要真菌病害的病原物禾谷镰孢-s、禾谷镰孢-j、玉蜀黍平脐蠕孢、炭色长蠕孢、弯孢霉、拟轮枝镰孢和嘴突脐孢均具有抑制作用，平均抑制率为11.12%-25.65%，其中对炭色长蠕孢和嘴突脐孢的抑制作用最强，抑制率分别为24.12%和25.65%；人工合成多肽对7种真菌的抑制率为4.59%-45.13%，其中13768-1和13768-3对炭色长蠕孢的抑制效果较好，抑制率分别为43.44%和45.13%，13768-2对弯孢霉和炭色长蠕孢抑制效果较好，抑制率分别为39.62%和38.55%。做为一种新型的抗菌肽，在农业病害防治方面具有广阔应用价值。

3、本专利以目前农林生产上的重要害虫桃蛀螟为对象，研究了其体内具有活性的抗菌肽资源及其对玉米重要真菌病害的抑菌潜力，不仅变害为宝，更明确了昆虫抗菌肽在植物病害防治中的应用潜力。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为cpalo-13768基因的核苷酸与氨基酸对照图。

图2为cpalo-13768氨基酸序列多重比对。

图3为cpalo-13768氨基酸序列系统进化树。

图4为cpalo-13768蛋白亲疏水性。

图5为cpalo-13768蛋白信号肽预测。

图6为cpalo-13768蛋白跨膜结构。

图7为cpalo-13768蛋白的二级结构。

图8为cpalo-13768和抗真菌肽alo-3氨基酸序列比对结果。

图9为cpalo-13768蛋白的三级结构。

图10本发明抗菌肽cpalo-13768对玉米穗腐病菌（禾谷镰孢-s）的活性检测，对照组（a），处理组（b）。

图11本发明抗菌肽cpalo-13768对玉米茎腐病菌（禾谷镰孢-j）的活性检测，对照组（a），处理组（b）。

图12本发明抗菌肽cpalo-13768对玉米小斑病菌（玉蜀黍平脐蠕孢）的活性检测，对照组（a），处理组（b）。

图13本发明抗菌肽cpalo-13768对玉米圆斑病菌（炭色长蠕孢）的活性检测，对照组（a），处理组（b）。

图14本发明抗菌肽cpalo-13768对玉米弯孢霉叶斑病菌（弯孢霉）的活性检测，对照组（a），处理组（b）。

图15本发明抗菌肽cpalo-13768对玉米穗腐病菌（拟轮枝镰孢）的活性检测，对照组（a），处理组（b）。

图16本发明抗菌肽cpalo-13768对玉米叶斑病菌（嘴突脐孢）的活性检测，对照组（a），处理组（b）。

具体实施方式

实验试剂和材料

1、载体及宿主细胞：载体pet32a（+）购自于北京华越洋生物科技有限公司，rosetta-gamib（de3）感受态细胞购自上海sangonbiotech公司。

2、酶类及必要生化试剂：ecori和hindiii内切酶购自takara公司，t4连接酶购自promega公司，反转录试剂盒购自北京tiangen公司，sanprep柱式质粒dna小量抽提试剂盒和sanprep柱式pcr产物纯化试剂盒购自上海sangonbiotech公司，细胞培养相关试剂购自北京solarbio公司。

3、供试病原菌有玉米穗腐病菌fusariumgminearum（禾谷镰孢-s）、玉米茎腐病菌fusariummoniliforme（禾谷镰孢-j）、玉米小斑病菌bipolarismaydis（玉蜀黍平脐蠕孢）、玉米圆斑病菌helminthosporiumcarbonum（炭色长蠕孢）、玉米弯孢霉叶斑病菌curvularialunata（弯孢霉）、玉米穗腐病菌fusariumverticillioides（拟轮枝镰孢）、玉米叶斑病菌exserohilumrostratum（嘴突脐孢），所用菌种由河南农业大学植物保护学院植物病理系袁红霞老师和张猛老师提供。

4、培养基：大肠杆菌lb培养基（1%蛋白胨、0.5%酵母提取物、1%nacl)；真菌pda培养基（去皮马铃薯200g，切成小块加蒸馏水煮沸至变软，用4层纱布过滤，加入20g葡萄糖、18g琼脂，搅拌混匀，蒸馏水定容至1l，121℃灭菌20min备用）。

说明：以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第四版)m.r.格林和j.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或按照试剂盒和产品说明书进行。

下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1：抗菌肽编码基因的克隆及序列分析

提取桃蛀螟幼虫的总rna，反转录成cdna。根据转录组测序筛选得到的桃蛀螟抗菌肽cpalo-13768的cdna序列，设计合成pcr引物cpalo-13768-f如seqidno.3所示：tgaaattcaacctgatcatcct和cpalo-13768-r如seqidno.4所示：ttaacgacagtaaccggcga，以桃蛀螟的cdna为模板进行pcr扩增。

pcr反应参数为：98℃2min；98℃10sec，58℃10sec，72℃10s，30个循环；72℃5min。琼脂糖电泳检测，得到介于100-250bp之间的片段，纯化回收后与pclone007克隆载体相连并转入大肠杆菌dh5α感受态细胞，经检测为阳性后送去测序得克隆到的cpalo-13768基因序列。

根据测序结果在ncbi中利用blast（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi）进行序列比对，通过ncbi的orffinder在线工具分析查找其可能存在的开放阅读框序列。初步判断该基因片段是抗菌肽片段，并进行该片段的相似性研究。该基因片段长180bp，其核苷酸与氨基酸对照图见图1，氨基酸序列与acrocinuslongimanus来源的抗菌肽alo-2的序列一致性最高为91.18%。

将查找得到的cpalo-13768核苷酸序列和其所编码蛋白的氨基酸序列分别于ncbi中进行相应的blast分析。cpalo-13768核苷酸序列的blastn查找结果，未发现相似序列。blastp分析结果表明（表1），在蛋白水平上，共有来自13个物种的29条相似序列，其中cpalo-13768的氨基酸序列与长臂天牛（acrocinuslongimanus）抗菌肽alo-2（p83652.1）的氨基酸序列相似性最高，相似性为91.18%。

表19cpalo-13768氨基酸序列ncbiblastp结果汇总

利用bioedit软件，将桃蛀螟的cpalo-13768序列与表19中其他昆虫的29条基因的氨基酸序列进行氨基酸序列多重比对，并利用mega7.0软件的近邻法构建系统进化树。由氨基酸序列多重比对的结果（图2）可以看出，桃蛀螟抗菌肽cpalo-13768的氨基酸序列与其他物种源的抗菌肽序列有很高的相似性，且其氨基酸序列中含有昆虫防御素类抗菌肽的典型特征，即具有6个保守的半胱氨酸（cys），形成3个分子内二硫键；由氨基酸序列系统进化树可以发现（图3），cpalo-13768的氨基酸序列与长臂天牛抗菌肽alo-1（p83651.1）的氨基酸序列的亲缘关系最近。结合前面的blastp分析和序列比对，将该基因命名为cpalo-13768，并将其上传至ncbi的genbank数据库，获得登录号为mw133083。

通过expasy-protparamtool和protscale在线工具对cpalo-13768氨基酸序列进行理化性质和亲疏水性分析，其基础性质和氨基酸组成见表2和表3，亲疏水性分析见图4。结果表明，桃蛀螟cpalo-13768蛋白预测分子量约为6.37kda；理论等电点pi=8.29，为碱性蛋白；不稳定指数为36.13，低于阈值40，说明其为稳定蛋白；其氨基酸组成中半胱氨酸（cys）和甘氨酸（gly）的含量相同且最丰富，均占总量的10.2%。亲疏水性分析中，最大值为第10位的丙氨酸（ala），其值为3.756，最小值为第32位的甘氨酸（gly），其值为-2.433，总平均亲水性值gravy=0.320，表明该蛋白为疏水性蛋白（gravy值正值为疏水，负值为亲水）。

表2cpalo-13678蛋白基础性质汇总表

表3cpalo-13678蛋白氨基酸组成归纳表

信号肽分析：信号肽序列一般指位于起始密码子后的一段编码疏水性氨基酸序列的rna区域，它的作用是负责把新合成的蛋白质引导到细胞中含不同膜结构的亚细胞器内（韦雪芳等，2006）。利用signaip5.0对cpalo-13768氨基酸序列进行信号肽分析可知，桃蛀螟cpalo-13768蛋白在第25氨基酸处有峰值，表明其序列中含有信号肽序列，且其剪切位点在25-26氨基酸之间；因此判定其前25个氨基酸为信号肽序列，可推测该抗菌肽蛋白为分泌蛋白（图5）。

跨膜结构域及亚细胞定位分析：利用在线工具tmhmmseversv2.0和predictprotein对cpalo-13768氨基酸序列进行跨膜结构及亚细胞定位的分析，结果（图6）显示，cpalo-13768氨基酸序列中存在跨膜结构，其中红线表示跨膜区；亚细胞定位预测该蛋白在真核生物中定位到细胞外。结合前面的信号肽分析，可以进一步确定该蛋白为分泌蛋白，在虫体细胞外起作用。

二级结构预测：利用线上工具sopma对cpalo-13768蛋白的二级结构分析结果表明，在cpalo-13768蛋白二级结构中，无规则卷曲（c）占42.37%，α螺旋（h）占40.68%且全部为信号肽序列区域，β转角（t）和延伸链（e）分别占10.17%和6.78%（图7）。

三级结构建模：蛋白质的三级结构是建立在蛋白二级结构、超二级结构或者结构域基础上，进一步盘绕、折叠，依靠次级键的维系固定所形成的特定空间结构。利用swiss-model的同源建模法，从现有模型中选择最为相近的模型，即一种从长臂天牛（acrocinuslongimanus）得到的新型抗真菌肽alo-3的结构为模板生成同源三级结构。从图8中可以看出cpalo-13768和抗真菌肽alo-3（p83653.1）三级结构的序列一致性为85.29%，通过在线软件swiss-model对cpalo-13768蛋白进行建模（图9），结果可以看出，cpalo-13768蛋白为单体结构。

实施例2：抗菌肽基因cpalo-13768的表达

根据测序及序列分析的结果，去除序列中信号肽部分并以ecorⅰ和hindⅲ作为酶切位点设计引物cpalo-13768-f1如seqidno.5所示：ccggaattctgcatcaagaaccg和cpalo-13768-r1如seqidno.6所示：cccaagcttttaacgacagtaaccgg，以桃蛀螟cdna为模板进行pcr扩增。纯化回收后，对质粒pet32a（+）和基因片断进行双酶切（ecorⅰ和hindⅲ），之后连接形成重组载体pet32a-cpalo-13768，将重组载体pet32a-cpalo-13768转入大肠杆菌dh5α感受态细胞。鉴定阳性重组子后送去测序，对测序正确的菌株提取其重组质粒转入大肠杆菌rosetta-gamib（de3）感受态细胞。培养菌液诱导蛋白表达并进行蛋白纯化和浓度测定。

实施例3：抗菌肽的抑菌活性检测

抗菌活性检测：抗菌活性检测的目标菌种为禾谷镰孢-s、禾谷镰孢-j、玉蜀黍平脐蠕孢、炭色长蠕孢、弯孢霉、拟轮枝镰孢和嘴突脐孢，结果如图10-图16，

具体检测方法为：（1）挑取活化后的病原菌菌丝，分别单独接种到pda平板上，26℃倒置培养10d左右，待其长满整个平板。

（2）将纯化后的cpalo-13768重组蛋白溶液和人工合成的多肽用无菌水统一配制成0.5mg/ml的溶液。

（3）于超净工作台中取100μl步骤（2）中配制好的溶液均匀涂布在事先准备好的pda平板上，对照组涂布等量的无菌水，静置30min左右待其完全吸收。

（4）将步骤（1）培养好的病原菌平板用直径为6mm的无菌打孔器打一个菌饼接种在步骤（3）的pda平板上，26℃倒置培养数天后（期间间断观察菌落生长情况），测量记录菌圈直径，按下式计算抑菌率。

抑菌率=（对照组菌丝生长半径-处理组菌丝生长半径）/对照组菌丝生长半径×100％。

从试验结果可以看出（表4）：cpalo-13768重组蛋白对这7种真菌均有很好的抑制效果。

表4cpalo-13768重组蛋白对玉米7种病原真菌的抑制率

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

<110>河南农业大学

<120>一种桃蛀螟活性抗菌肽及其基因、重组载体和应用

<141>2021-06-08

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