生物催化制备磷酸吡哆醛的方法

1.本发明涉及一种生物催化制备磷酸吡哆醛的方法，尤其涉及一种全酶法催化制备磷酸吡哆醛的方法，属于生物制药和生物化工技术领域。


背景技术：

2.磷酸吡哆醛是维生素b6的活性形式。这种维生素主要包括三种天然有机化合物：吡哆醛、吡哆胺与吡哆醇。磷酸吡哆醛参与催化的几种反应有：转氨基作用、α
‑
脱羧作用、β
‑
脱羧作用、β
‑
消除作用、γ
‑
消除作用、消旋作用以及羟醛反应。
3.磷酸吡哆醛作为维生素b6的衍生物在医药上有多种用途，治疗原因不明的白细胞减少症，治疗破伤风抗血栓作用，治疗口腔溃疡，治疗贫血，治疗动脉粥样硬化，治疗痤疮等。研究还表明，磷酸吡哆醛不但可以用于预防治疗高血压、心血管疾病及糖尿病等，还可用于治疗迟发性运动障碍、难治性儿童期癫痫及帕金森综合征。
4.磷酸吡哆醛还是合成β
‑
羰基酰胺类化合物的辅酶，羰基酰胺类化合物在药物生物活性研究、液晶材料及涂料等领域有广泛应用，市场量大。
5.目前磷酸吡哆醛多采用化学法进行生产，是将吡哆胺二盐酸盐与无水磷酸反应成吡哆胺磷酸酯，后者再经二氧化锰氧化制得。在对磷酸吡哆醛进行精制时，一方面，溶液中磷酸吡哆醛的产品浓度较低，为提高其浓度，通常采用蒸发脱水进行浓缩，耗时长，能耗高，且浓缩时温度过高会影响所得磷酸吡哆醛的有效成分及质量；另一方面，工艺流程长，需消耗大量危险化学品，产生大量废水，产品收率低，生产成本高。
6.目前，磷酸吡哆醛的合成多是以化学合成法进行的，但此种方法存在步骤复杂、资源消耗多、不易制备等问题，故需要开发一种新工艺来降低生产成本。


技术实现要素：

7.本发明所要解决的技术问题是，本发明提供一种生物催化制备磷酸吡哆醛的方法，该方法采用两步法生物催化吡哆醇转化为磷酸吡哆醛，提供一种环保高效，选择性好，产量高，反应条件温和，操作方便，成本低廉，具有良好的工业化应用价值的生物全酶法催化合成磷酸吡哆醛的方法。
8.同时，本发明提供一种生物催化制备磷酸吡哆醛的方法，该方法采用一步法生物催化吡哆醇转化为磷酸吡哆醛，提供一种更加环保高效，选择性好，产量高，反应条件温和，操作方便，成本低廉，具有良好的工业化应用价值的生物全酶法催化合成磷酸吡哆醛的方法。
9.为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：
10.本发明公开了一种生物催化制备磷酸吡哆醛的方法(分步反应)，包括以下步骤：
11.步骤一，在玻璃反应瓶中，加入适量ddh2o，再加入1mol/l的磷酸盐缓冲液调节ph为7.3
‑
7.6，再加入0.1mol/l的atp钠盐溶液、1mol/l的无机盐溶液、0.5mol/l的吡哆醇溶液和磷酸转移酶；atp钠盐溶液的加入体积为ddh2o的1/192
‑
1/96，无机盐溶液的加入体积为
ddh2o的1/16000
‑
1/8000，吡哆醇溶液的加入体积为atp钠盐溶液的1/10
‑
1/5，所述磷酸转移酶的加入质量为ddh2o重量的1/6；然后控制反应液温度为37℃；搅拌反应1.5小时；
12.步骤二，上述反应完成后，离心取上清液适量，依次加入1mol/l的磷酸盐缓冲液，2mmol/l的fmn溶液和醇氧化酶，磷酸盐缓冲液的加入体积为调节上清液ph至7.3
‑
7.6时的体积，fmn溶液的加入体积为上清液的1/60，醇氧化酶的加入质量为磷酸转移酶的1/40～1/10，拌反应40～60分钟，获得磷酸吡哆醛溶液。
13.所述无机盐溶液包括无水硫酸镁或氯化锌。
14.所述磷酸盐缓冲液包括kh2po4‑
k2hpo4或kh2po4‑
na2hpo4缓冲液。
15.所述磷酸转移酶mg：醇氧化酶mg：0.1mol/l的atp钠盐μl＝8:0.8:500。
16.本发明还公开了一种生物催化制备磷酸吡哆醛的方法(一步反应)，包括以下步骤：
17.步骤一：在玻璃反应瓶中，加入适量ddh2o，再依次加入1mol/l的磷酸盐缓冲液、2mmol/l的fmn溶液、0.1mol/l的atp钠盐溶液、1mol/l的无机盐溶液、0.5mol/l的吡哆醇溶液、磷酸转移酶和醇氧化酶；磷酸盐缓冲液的加入体积为调节ddh2o的ph至7.3
‑
7.6时的体积，fmn溶液的加入体积为ddh2o的1/96，atp钠盐溶液的加入体积为fmn溶液的0.5～1倍，无机盐溶液的加入体积为fmn溶液的1/167～1/83，吡哆醇溶液的加入体积为fmn溶液的1/10，磷酸转移酶的加入质量为ddh2o重量的1/6，醇氧化酶的加入质量为磷酸转移酶的1/40～1/10，拌反应40～60分钟，获得磷酸吡哆醛溶液。
18.所述无机盐溶液包括无水硫酸镁或氯化锌。
19.所述磷酸盐缓冲液包括kh2po4‑
k2hpo4或kh2po4‑
na2hpo4缓冲液。
20.所述磷酸转移酶mg：醇氧化酶mg：0.1mol/l的atp钠盐μl：2mmol/l的fmnμl＝8:0.8:500:500。
21.本发明的具体反应式为：
[0022][0023]
本发明是以吡哆醇为原料，在无机盐和辅酶(atp钠盐+fmn)存在的条件下，通过酶催化反应(磷酸转移酶+醇氧化酶)制备磷酸吡哆醛；酶催化反应的ph为7.3
‑
7.6，反应温度为37℃；无机盐选自无水硫酸镁、氯化锌中的至少一种。本发明是一种环保高效，选择性好，反应条件温和，操作简单方便，具有良好的工业化应用价值的生物催化制备磷酸吡哆醛的方法。
[0024]
本发明具有如下有益效果：本发明相较于纯化学方法制备磷酸吡哆醛，条件更为温和，所消耗的时间较短；且环保高效，选择性好，产量高，操作方便，成本低廉，具有良好的工业化应用价值。
附图说明
[0025]
图1为吡哆醇的结构式；
[0026]
图2为磷酸吡哆醛的结构式；
[0027]
图3为本发明的方法制得的磷酸吡哆醛的高效液相色谱图；
[0028]
图4为本发明中不同酶比例对应的磷酸吡哆醛转化率图。
具体实施方式
[0029]
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清晰，以下结合附图及实施例对本发明进行进一步详细说明。此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0030]
实施例1：
[0031]
生物催化制备磷酸吡哆醛的方法(分步反应)，包括以下步骤：在100ml玻璃反应瓶中，依次加入48ml ddh2o，2ml磷酸盐缓冲液(ph＝7.3，1mol/l)，250μl atp钠盐(0.1mol/l)，3μl无水硫酸镁溶液(1mol/l)，50μl吡哆醇溶液(0.5mol/l)，8mg磷酸转移酶。控制反应液温度37℃，控制反应液ph在7.3
‑
7.6之间，搅拌反应1.5小时。上述反应完成后，离心取上清液3ml(0.5mmol/l)，依次加入750μl磷酸盐缓冲液(ph＝7.3，1mol/l)，50μlfmn(2mmol/l)，0.2mg醇氧化酶，搅拌反应40分钟。
[0032]
将反应后的溶液进行离心处理，过0.22μm的滤膜。取10μl上清液用高效液相色谱(液相条件∶色谱柱∶c18(4.6
×
250mm，5μm)；取3.4g磷酸二氢钾加水溶解并稀释至1000ml，用10％磷酸调ph至3.0，抽滤，配制成和甲醇比例为94:6的流动相；流速∶1.0ml/min；柱温∶25℃；进样量∶10μl；检测波长∶210nm)检测；检测磷酸吡哆醛产物转化率为37％。
[0033]
实施例2：
[0034]
生物催化制备磷酸吡哆醛的方法(分步反应)，包括以下步骤：在100ml玻璃反应瓶中，依次加入48ml ddh2o，2ml磷酸盐缓冲(ph＝7.3，1mol/l)，500μl atp钠盐(0.1mol/l)，6μl无水硫酸镁溶液(1mol/l)，50μl吡哆醇溶液(0.5mol/l)，8mg磷酸转移酶。控制反应液温度37℃，控制反应液ph在7.3
‑
7.6之间，搅拌反应1.5小时。上述反应完成后，离心取上清液3ml(0.5mmol/l)，依次加入750μl磷酸盐缓冲液(ph＝7.3，1mol/l)，50μlfmn(2mmol/l)，0.2mg醇氧化酶，搅拌反应40分钟。
[0035]
将反应后的溶液进行离心处理，过0.22μm的滤膜。取10μl上清液用高效液相色谱(液相条件∶色谱柱∶c18(4.6
×
250mm，5μm)；取3.4g磷酸二氢钾加水溶解并稀释至1000ml，用10％磷酸调ph至3.0，抽滤，配制成和甲醇比例为94:6的流动相；流速∶1.0ml/min；柱温∶25℃；进样量∶10μl；检测波长∶210nm)检测；检测磷酸吡哆醛产物转化率为72％。
[0036]
实施例3：
[0037]
生物催化制备磷酸吡哆醛的方法(分步反应)，包括以下步骤：在100ml玻璃反应瓶中，依次加入48ml ddh2o，2ml磷酸盐缓冲(ph＝7.3，1mol/l)，250μl atp钠盐(0.1mol/l)，3μl无水硫酸镁溶液(1mol/l)，50μl吡哆醇溶液(0.5mol/l)，8mg磷酸转移酶。控制反应液温度37℃，控制反应液ph在7.3
‑
7.6之间，搅拌反应1.5小时。上述反应完成后，离心取上清液3ml(0.5mmol/l)，依次加入750μl磷酸盐缓冲液(ph＝7.3，1mol/l)，50μlfmn(2mmol/l)，0.5mg醇氧化酶，搅拌反应1小时。
[0038]
将反应后的溶液进行离心处理，过0.22μm的滤膜。取10μl上清液用高效液相色谱(液相条件∶色谱柱∶c18(4.6
×
250mm，5μm)；取3.4g磷酸二氢钾加水溶解并稀释至1000ml，用10％磷酸调ph至3.0，抽滤，配制成和甲醇比例为94:6的流动相；流速∶1.0ml/min；柱温∶
25℃；进样量∶10μl；检测波长∶210nm)检测；检测磷酸吡哆醛产物转化率为45％。
[0039]
实施例4：
[0040]
生物催化制备磷酸吡哆醛的方法(分步反应)，包括以下步骤：在100ml玻璃反应瓶中，依次加入48ml ddh2o，2ml磷酸盐缓冲(ph＝7.3，1mol/l)，500μl atp钠盐(0.1mol/l)，6μl无水硫酸镁溶液(1mol/l)，50μl吡哆醇溶液(0.5mol/l)，8mg磷酸转移酶。控制反应液温度37℃，控制反应液ph在7.3
‑
7.6之间，搅拌反应1.5小时。上述反应完成后，离心取上清液3ml(0.5mmol/l)，依次加入750μl磷酸盐缓冲液(ph＝7.3，1mol/l)，50μlfmn(2mmol/l)，0.5mg醇氧化酶，搅拌反应1小时。
[0041]
将反应后的溶液进行离心处理，过0.22μm的滤膜。取10μl上清液用高效液相色谱(液相条件∶色谱柱∶c18(4.6
×
250mm，5μm)；取3.4g磷酸二氢钾加水溶解并稀释至1000ml，用10％磷酸调ph至3.0，抽滤，配制成和甲醇比例为94:6的流动相；流速∶1.0ml/min；柱温∶25℃；进样量∶10μl；检测波长∶210nm)检测；检测磷酸吡哆醛产物转化率为80％。
[0042]
实施例5：
[0043]
生物催化制备磷酸吡哆醛的方法(分步反应)，包括以下步骤：在100ml玻璃反应瓶中，依次加入48ml ddh2o，2ml磷酸盐缓冲液(ph＝7.3，1mol/l)，250μl atp钠盐(0.1mol/l)，3μl无水硫酸镁溶液(1mol/l)，50μl吡哆醇溶液(0.5mol/l)，8mg磷酸转移酶。控制反应液温度37℃，控制反应液ph在7.3
‑
7.6之间，搅拌反应1.5小时。上述反应完成后，离心取上清液3ml(0.5mmol/l)，依次加入750μl磷酸盐缓冲液(ph＝7.3，1mol/l)，50μl fmn(2mmol/l)，0.8mg醇氧化酶，调ph至8.0，搅拌反应1小时。
[0044]
将反应后的溶液进行离心处理，过0.22μm的滤膜。取10μl上清液用高效液相色谱(液相条件∶色谱柱∶c18(4.6
×
250mm，5μm)；取3.4g磷酸二氢钾加水溶解并稀释至1000ml，用10％磷酸调ph至3.0，抽滤，配制成和甲醇比例为94:6的流动相；流速∶1.0ml/min；柱温∶25℃；进样量∶10μl；检测波长∶210nm)检测；检测磷酸吡哆醛产物转化率为54％。
[0045]
实施例6：
[0046]
生物催化制备磷酸吡哆醛的方法(分步反应)，包括以下步骤：在100ml玻璃反应瓶中，依次加入48ml ddh2o，2ml磷酸盐缓冲(ph＝7.3，1mol/l)，500μl atp钠盐(0.1mol/l)，6μl无水硫酸镁溶液(1mol/l)，50μl吡哆醇溶液(0.5mol/l)，8mg磷酸转移酶。控制反应液温度37℃，控制反应液ph在7.3
‑
7.6之间，搅拌反应1.5小时。上述反应完成后，离心取上清液3ml(0.5mmol/l)，依次加入750μl磷酸盐缓冲液(ph＝7.3，1mol/l)，50μlfmn(2mmol/l)，0.8mg醇氧化酶，调ph至8.0，搅拌反应1小时。
[0047]
将反应后的溶液进行离心处理，过0.22μm的滤膜。取10μl上清液用高效液相色谱(液相条件∶色谱柱∶c18(4.6
×
250mm，5μm)；取3.4g磷酸二氢钾加水溶解并稀释至1000ml，用10％磷酸调ph至3.0，抽滤，配制成和甲醇比例为94:6的流动相；流速∶1.0ml/min；柱温∶25℃；进样量∶10μl；检测波长∶210nm)检测；检测磷酸吡哆醛产物转化率为89％。
[0048]
实施例7：
[0049]
生物催化制备磷酸吡哆醛的方法(一步反应)，包括以下步骤：在100ml玻璃反应瓶中，依次加入48ml ddh2o，12.5ml磷酸盐缓冲液(ph＝7.3，1mol/l)，500μl fmn(2mmol/l)，250μl atp钠盐(0.1mol/l)，3μl无水硫酸镁溶液(1mol/l)，50μl吡哆醇溶液(0.5mol/l)，8mg磷酸转移酶，0.2mg醇氧化酶。控制反应液温度37℃，控制反应液ph在7.3
‑
7.6之间，搅拌
反应40分钟。
[0050]
将反应后的溶液进行离心处理，过0.22μm的滤膜。取10μl上清液用高效液相色谱(液相条件∶色谱柱∶c18(4.6
×
250mm，5μm)；取3.4g磷酸二氢钾加水溶解并稀释至1000ml，用10％磷酸调ph至3.0，抽滤，配制成和甲醇比例为94:6的流动相；流速∶1.0ml/min；柱温∶25℃；进样量∶10μl；检测波长∶210nm)检测；检测磷酸吡哆醛产物转化率为38％。
[0051]
实施例8：
[0052]
生物催化制备磷酸吡哆醛的方法(一步反应)，包括以下步骤：在100ml玻璃反应瓶中，依次加入48ml ddh2o，12.5ml磷酸盐缓冲液(ph＝7.3，1mol/l)，500μl fmn(2mmol/l)，500μl atp钠盐(0.1mol/l)，6μl无水硫酸镁溶液(1mol/l)，50μl吡哆醇溶液(0.5mol/l)，8mg磷酸转移酶，0.2mg醇氧化酶。控制反应液温度37℃，控制反应液ph在7.3
‑
7.6之间，搅拌反应40分钟。
[0053]
将反应后的溶液进行离心处理，过0.22μm的滤膜。取10μl上清液用高效液相色谱(液相条件∶色谱柱∶c18(4.6
×
250mm，5μm)；取3.4g磷酸二氢钾加水溶解并稀释至1000ml，用10％磷酸调ph至3.0，抽滤，配制成和甲醇比例为94:6的流动相；流速∶1.0ml/min；柱温∶25℃；进样量∶10μl；检测波长∶210nm)检测；检测磷酸吡哆醛产物转化率为74％。
[0054]
实施例9：
[0055]
生物催化制备磷酸吡哆醛的方法(一步反应)，包括以下步骤：在100ml玻璃反应瓶中，依次加入48ml ddh2o，12.5ml磷酸盐缓冲液(ph＝7.3，1mol/l)，500μl fmn(2mmol/l)，250μl atp钠盐(0.1mol/l)，3μl无水硫酸镁溶液(1mol/l)，50μl吡哆醇溶液(0.5mol/l)，8mg磷酸转移酶，0.5mg醇氧化酶。控制反应液温度37℃，控制反应液ph在7.3
‑
7.6之间，搅拌反应1小时。
[0056]
将反应后的溶液进行离心处理，过0.22μm的滤膜。取10μl上清液用高效液相色谱(液相条件∶色谱柱∶c18(4.6
×
250mm，5μm)；取3.4g磷酸二氢钾加水溶解并稀释至1000ml，用10％磷酸调ph至3.0，抽滤，配制成和甲醇比例为94:6的流动相；流速∶1.0ml/min；柱温∶25℃；进样量∶10μl；检测波长∶210nm)检测；检测磷酸吡哆醛产物转化率为46％。
[0057]
实施例10：
[0058]
生物催化制备磷酸吡哆醛的方法(一步反应)，包括以下步骤：在100ml玻璃反应瓶中，依次加入48ml ddh2o，12.5ml磷酸盐缓冲液(ph＝7.3，1mol/l)，500μl fmn(2mmol/l)，500μl atp钠盐(0.1mol/l)，6μl无水硫酸镁溶液(1mol/l)，50μl吡哆醇溶液(0.5mol/l)，8mg磷酸转移酶，0.5mg醇氧化酶。控制反应液温度37℃，控制反应液ph在7.3
‑
7.6之间，搅拌反应1小时。
[0059]
将反应后的溶液进行离心处理，过0.22μm的滤膜。取10μl上清液用高效液相色谱(液相条件∶色谱柱∶c18(4.6
×
250mm，5μm)；取3.4g磷酸二氢钾加水溶解并稀释至1000ml，用10％磷酸调ph至3.0，抽滤，配制成和甲醇比例为94:6的流动相；流速∶1.0ml/min；柱温∶25℃；进样量∶10μl；检测波长∶210nm)检测；检测磷酸吡哆醛产物转化率为81％。
[0060]
实施例11：
[0061]
生物催化制备磷酸吡哆醛的方法(一步反应)，包括以下步骤：在100ml玻璃反应瓶中，依次加入48ml ddh2o，12.5ml磷酸盐缓冲液(ph＝7.3，1mol/l)，500μl fmn(2mmol/l)，250μl atp钠盐(0.1mol/l)，3μl无水硫酸镁溶液(1mol/l)，50μl吡哆醇溶液(0.5mol/l)，
8mg磷酸转移酶，0.8mg醇氧化酶。控制反应液温度37℃，控制反应液ph在7.3
‑
7.6之间，搅拌反应1小时。
[0062]
将反应后的溶液进行离心处理，过0.22μm的滤膜。取10μl上清液用高效液相色谱(液相条件∶色谱柱∶c18(4.6
×
250mm，5μm)；取3.4g磷酸二氢钾加水溶解并稀释至1000ml，用10％磷酸调ph至3.0，抽滤，配制成和甲醇比例为94:6的流动相；流速∶1.0ml/min；柱温∶25℃；进样量∶10μl；检测波长∶210nm)检测；检测磷酸吡哆醛产物转化率为57％。
[0063]
实施例12：
[0064]
生物催化制备磷酸吡哆醛的方法(一步反应)，包括以下步骤：在100ml玻璃反应瓶中，依次加入48ml ddh2o，12.5ml磷酸盐缓冲液(ph＝7.3，1mol/l)，500μl fmn(2mmol/l)，500μl atp钠盐(0.1mol/l)，6μl无水硫酸镁溶液(1mol/l)，50μl吡哆醇溶液(0.5mol/l)，8mg磷酸转移酶，0.8mg醇氧化酶。控制反应液温度37℃，控制反应液ph在7.3
‑
7.6之间，搅拌反应1小时。
[0065]
将反应后的溶液进行离心处理，过0.22μm的滤膜。取10μl上清液用高效液相色谱(液相条件∶色谱柱∶c18(4.6
×
250mm，5μm)；取3.4g磷酸二氢钾加水溶解并稀释至1000ml，用10％磷酸调ph至3.0，抽滤，配制成和甲醇比例为94:6的流动相；流速∶1.0ml/min；柱温∶25℃；进样量∶10μl；检测波长∶210nm)检测；检测磷酸吡哆醛产物转化率为93％。
[0066]
如图1所示，为吡哆醇的结构式；如图2所示，为磷酸吡哆醛的结构式；如图3所示，为本发明的方法制得的磷酸吡哆醛的高效液相色谱图；如图4所示，为本发明中实施例1～实施例12的酶的配比以及磷酸吡哆醛转化率图，从图4可以看到，当磷酸转移酶(mg)：醇氧化酶(mg)：0.1mol/l的atp钠盐(μl)＝8:0.8:500时，可以得到高产率的磷酸吡哆醛，其中一步反应的转化率高达93％，分步反应的转化率达89％。本发明以磷酸转移酶、醇氧化酶、atp钠盐和fmn作为生物催化制备磷酸吡哆醛的复合酶，本发明采用该复合酶后，相较于纯化学方法制备磷酸吡哆醛，条件更为温和，所消耗的时间较短；且环保高效，选择性好，产量高，操作方便，成本低廉，具有良好的工业化应用价值。
[0067]
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。