一种快速鉴别老年黄斑病变风险的方法及应用与流程

本发明涉及生物医药
技术领域：
，具体涉及一种快速鉴别老年黄斑病变风险的方法及应用。
背景技术：
：年龄相关性黄斑变性(age-relatedmaculardegeneration,amd)是眼科常见的神经退行性疾病,也是欧美等发达国家老年人群致盲的主要原因。据统计,发达国家amd发病人数将达300万,50岁以上人群眼病患病率中,amd占3.5％。当前,amd已成为世界公共卫生组织重点关注的疾病。amd发病过程主要是光感受器、视网膜色素上皮(retinalpigmentepithelial,rpe)细胞及血液供应改变,造成视神经退行性萎缩,病情进展至末期形成中心视力不可逆性丧失。amd发病机制尚未明确,年龄、饮食、环境、遗传以及种族等因素与发病过程密切相关。目前老年性黄斑病变的常规检测手段只能在黄斑病变有明显症状后作出诊断，可能会延误最佳治疗时机。基因多态性检测是指以含有遗传信息的物质(如血液)为起始材料，通过核酸提取、扩增和对扩增产物进行表征等过程检测基因序列的差异，目前报道的单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism,snp)检测方法主要有：直接测序法、高分辨率熔解曲线法(hrm)、pcr-rflp法、taqman探针法、突变扩增系统(amplificationrefractorymutationsystem,arms)pcr法等。直接测序法虽是snp分析的金标准，可发现已知和未知的snp位点，但每个位点均需经pcr扩增，然后测序，成本较高，工作量大，周期长、不适合大样本做疾病关联分析，且易发生交叉污染。taqman探针法适合少量位点大量样本的分型项目，但其探针合成价格昂贵，不适合少量样本多位点分型，特别是频率偏低的位点。pcr-rflp法优点是分型技术简单，结果判定容易，避免测量误差，结果稳；其缺点是序列多态性座位中大约只有1/3的碱基涉及限制酶识别序列，遗传标记系统的个人识别能力有限，限制酶消化条件较高。hrm法可高通量检测基因的突变情况，但其所需检测仪器比普通的荧光pcr仪更为精密，对温度敏感性要求高，受仪器影响大很难普及。arms-pcr法，又称等位基因特异性扩增法，其基本原理是因为taqdna聚合酶缺少3’-5’外切酶活性，如果引物的3’端碱基与模板碱基不互补，则用一般耐热dna聚合酶无法延伸。因此根据已知点突变设计3条引物，其3’端碱基分别与突变和正常的模板碱基互补，从而将有某种点突变的模板与正常模板区分开来。arms-pcr可检测dna分子上任何点突变和小的缺失，其方法可靠、不依赖于任何特殊标记，但往往反应结束后还需进行凝胶电泳，增加了pcr污染的机会，且耗时费力。因此，迫切需要开发一直高灵敏度，经济实惠、快速且结果判读准确可靠的检测方法。技术实现要素：为解决上述技术问题，本发明提供了一种快速鉴别老年黄斑病变风险的方法，能够快速准确的鉴别风险人群，大大提高了检测基因的特异性，低污染，检测时间短。本发明提供了一种快速鉴别老年黄斑病变风险的方法，具体包括如下步骤：s1，样本dna提取；s2，arms-qpcr法扩增样本dna：以s1中提取的样本dna为模板，设置野生型引物扩增组，记为a组，设置突变型引物扩增组，记为b组，a组和b组的正向引物均为cfh-f，其核苷酸序列如如seqidno.1所示；a组反向引物记为cfh-r(t)，其序列如seqidno.2所示；b组的反向引物记为cfh-r(c)，其序列如seqidno.3所示；同时对a、b两组进行荧光定量pcr检测，最后对检测结果进行判读；所述检测结果进行判读计算方式为：δct＝ctb组-cta组，当δct≥7，其患老年黄斑病变风险较低，当δct≤-7，其患老年黄斑病变风险较高。进一步地，所述检测结果判读过程中根据溶解曲线确定扩增反应效果，溶解曲线只有单峰且出峰位置是目的产物退火温度tm＝90℃(tm相差范围为±2℃)，那么实验结果有效，可对数据进行判读。进一步地，所述检测结果判定标准为：当δct≥7，则基因型为野生型，当δct≤-7，则基因型为突变型，当-2≤δct≤2，则基因型为杂合型。进一步地，所述野生型即cfh(t>c)位点为tt型，相比较于tc或cc型，其患老年黄斑病变风险较低。进一步地，所述突变型即cfh(t>c)位点为cc型，相比较于tt型，其患老年黄斑病变风险较高。进一步地，所述杂合型即cfh(t>c)位点为tc型，其患老年黄斑病变风险介于野生型和突变型之间，相比较于tt型，其患老年黄斑病变风险较高。本发明还提供了所述cfh基因在制备防御老年黄斑病变药物中的用途。本发明还提供了所述cfh基因的表达产物在制备防御老年黄斑病变药物中的用途。与现有技术相比，本发明的有益效果在于：1、本发明提供了一种快速鉴别老年黄斑病变风险的检测方法，主要是在arms-qpcr法的基础上鉴定cfh的基因多态性，以此为依据为老年性黄斑变性风险检测提供指导，能够检测发现个人是否携带有致病基因缺陷，来评估个体的患病风险，快速准确的鉴别风险人群，对于老年性黄斑病变早期预警的筛查具有重大的指导意义。2、本发明提供的方法特异性高，联合real-timepcr技术，根据扩增曲线的ct值进行分析，大大提高了检测基因的特异性。3、本发明的检测方法检测时间短，从样本接收到检测完成只需3个小时左右。4、本发明提供的检测方法操作简单，一次加样，从pcr反应开始到结束，一直在封闭的反应体系中进行，可有效降低污染。5、本发明的检测方法结果判读准确直观，一份样本的检测只需要2个pcr管反应就可以完成，根据各反应的ct差值直接确定其基因型，结果准确可靠，与一代测序结果检测对比，一致率达100％，有望在临床快速基因分型中得到广泛的应用，解决现有其它检测技术价格昂贵、操作复杂、周期长、特异性不高、通量低等问题。附图说明为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1表示本发明实施例1中对样本1的扩增曲线图,其中样本1为野生型tt；图2表示本发明实施例1中对样本2的扩增曲线图,其中样本2为杂合型tc。图3表示本发明实施例1中对样本3的扩增曲线图，其中样本3为野生型tt。图4表示本发明实施例1中对样本4的扩增曲线图,其中样本4为野生型tt。图5表示本发明实施例1中对样本5的扩增曲线图,其中样本5为野生型tt。图6表示本发明实施例1中对样本6的扩增曲线图,其中样本6为杂合型tc。图7表示本发明实施例1中对样本7的扩增曲线图,其中样本7为杂合型tc。图8表示本发明实施例1中对样本8的扩增曲线图,其中样本8为杂合型tc。具体实施方式下面对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。本发明各实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1本实施例提供了一种快速鉴别老年黄斑病变风险的检测方法，具体过程如下：1、临床样本dna提取本实施例是从多个健康受检者的血液中提取dna，选择其中已经基因型的8个样本，分别记为样本1(基因型为tt)，样本2(基因型为tc)，样本3(基因型为tt)，样本4(基因型为tt)，样本5(基因型为tt)，样本6(基因型为tc)，样本7(基因型为tc)，样本8(基因型为tc)，并对其进行定量，以此作为arms-qpcr检测用模板，dna提取试剂盒为天根血液基因组dna提取试剂盒，将所得的dna样品用紫外分光光度计进行定量，并将其稀释到40ng/μl，用于后续实验；2、arms-qpcr法扩增临床样本dna检测仪器可选用abi7500实时荧光定量pcr仪。每个样本检测过程中均需设a组(野生型引物扩增组)及b组(突变型引物扩增组)，除反向引物不同外，a、b两组的反应体系均一致，并且必须在同一台仪器上同时对a、b两组进行检测，具体操作步骤如下：(1)将检测所需试剂及样本置于冰上融化并轻弹混匀，按照表1所示反应体系将样本及试剂加入8联管(需使用与仪器配套8联管)，并且应按照体积由高到低依次加入反应孔中，所用酶为天根公司的superrealpremixplus(sybrgreen)预混液；表1arms-qpcr反应体系(限abi7500使用)a组和b组的正向引物相同，记为cfh-f，如seqidno.1所示，a组的反向引物记为cfh-r(t)，其序列如seqidno.2所示，b组的反向引物记为cfh-r(c)，其序列如seqidno.3所示；seqidno.1：gtgcaaacctttgttagtaactttagttcgtcseqidno.2：tagatttaccctgtacaaactttcttcgataseqidno.3：tagatttaccctgtacaaactttcttcgatg(2)加样完毕后扣紧管盖，应注意避免磨损或弄脏管盖，用手轻轻震荡混匀反应体系，同时避免产生气泡，离心机离心30s；(3)小心取出离心后的样品，放入荧光定量pcr仪中，操作过程中应垂直拿放8联管，避免部分样品溅到管壁或管盖上，影响反应体系及荧光信号的采集；(4)设定pcr反应程序，具体如表2所示表2arms-qpcr反应程序(5)对检测结果进行判读：根据溶解曲线确定扩增反应效果，溶解曲线只有单峰且出峰位置是目的产物退火温度tm＝90℃(tm相差范围为±2℃)，那么实验结果有效，可对数据进行判读，δct＝ctb组-cta组，当δct≥7为野生型，δct≤-7为突变型，-2≤δct≤2为杂合型。表3.本发明实施例样本1-8中的cfh(t>c)位点检测结果样本编号ctb组cta组δct判定结果样本134268野生型tt样本232302杂合型tc样本328.2521.157.1野生型tt样本422.5534.0311.48野生型tt样本521.6435.0313.39野生型tt样本625.3423.61.74杂合型tc样本723.924.84-0.94杂合型tc样本822.7123.44-0.73杂合型tc如图1所示，样本1检测结果显示cfh(t>c)位点为野生型。根据公式δct＝ctb组-cta组，可得δct＝34-26，结果为8，所以δct≥7，样本1为野生型(tt)。如图2所示，样本2检测结果显示cfh(t>c)位点为杂合型。根据公式δct＝ctb组-cta组，得δct＝32-30，结果为2，所以-2≤δct≤2，样本2为杂合型(tc)。如图3所示，样本3检测结果显示cfh(t>c)位点为野生型。根据公式δct＝ctb组-cta组，得δct＝28.25-21.15，结果为7.1，所以δct≥7，样本3为野生型(tt)。如图4所示，样本4检测结果显示cfh(t>c)位点为野生型。根据公式δct＝ctb组-cta组，得δct＝22.55-34.03，结果为11.48，所以δct≥7，样本4为野生型(tt)。如图5所示，样本5检测结果显示cfh(t>c)位点为野生型。根据公式δct＝ctb组-cta组，得δct＝21.64-35.03，结果为13.39，所以δct≥7，样本5为野生型(tt)。如图6所示，样本6检测结果显示cfh(t>c)位点为杂合型。根据公式δct＝ctb组-cta组，得δct＝25.34-23.6，结果为1.74，所以-2≤δct≤2，样本6为杂合型(tc)。如图7所示，样本7检测结果显示cfh(t>c)位点为杂合型。根据公式δct＝ctb组-cta组，得δct＝23.9-24.84，结果为-0.94，所以-2≤δct≤2，样本7为杂合型(tc)。如图8所示，样本8检测结果显示cfh(t>c)位点为杂合型。根据公式δct＝ctb组-cta组，得δct＝22.71-23.44，结果为-0.73，所以-2≤δct≤2，样本8为杂合型(tc)。本发明在arms-pcr基础上，针对snp序列设计的特异性引物及共用上游引物，特异性引物于3’末端第二位引入错配碱基，以此扩大特异性引物3’末端碱基与dna模版上snp位点碱基互补和不互补情况下扩增效率间的差距，从而大幅度提高检测的特异性和准确性。其次，引入了real-timepcr技术，可根据△ct值进行判读，即△ct＝突变ct-野生ct，一般情况下△ct≥7为野生型，△ct≤-7为突变型，-2≤△ct≤2为杂合型，该法相比较于其他方法，其操作简单、结果直观，检测时间短，成本低且特异性高。尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。序列表<110>西安医臻生物医药科技有限公司<><120>一种快速鉴别老年黄斑病变风险的方法及应用<><160>3<><170>siposequencelisting1.0<><210>1<211>32<212>dna<213>人工合成<><400>1gtgcaaacctttgttagtaactttagttcgtc32<><><210>2<211>31<212>dna<213>人工合成<><400>2tagatttaccctgtacaaactttcttcgata31<><><210>3<211>31<212>dna<213>人工合成<><400>3tagatttaccctgtacaaactttcttcgatg31<><><><>当前第1页12