对非人动物基因改造的方法及构建的免疫缺陷动物模型与流程

1.本技术涉及一种对非人动物进行基因改造的方法及利用该方法构建若干免疫缺陷动物模型。


背景技术：

2.小鼠免疫系统人源化通常是指在免疫缺陷型小鼠体内植入人外周血白细胞(hpbmc)或人造血干细胞(cd34+hsc)以后，在小鼠体内重建一种或几种人免疫细胞。一方面，小鼠免疫系统人源化过程可以用于检测人类造血干细胞及基于人类造血干细胞的治疗细胞的分化和定植功能，另一方面人源化的小鼠还能够更好地模拟人类免疫系统及肿瘤免疫微环境，在传染性疾病、抗体药物开发，自身免疫病以及肿瘤学研究等多领域的有不可替代的作用。
3.免疫系统人源化通常需要使用重度免疫缺陷小鼠。在重度免疫缺陷小鼠表达某些人源化的细胞因子，有助于在小鼠重建完善的人免疫系统。重度免疫缺陷小鼠通常是指nod scid il2rγko小鼠(scid突变及il2rγ敲除的nod小鼠)，balb/c rag1ko.il2rγko(il2rγ及rag1敲除的balb/c小鼠)或balb/c rag2ko.il2rγko小鼠(il2rγ及rag2敲除的balb/c小鼠。相较于仅有scid、rag1或rag2敲除的普通的免疫缺陷小鼠，重度免疫缺陷小鼠进一步敲除了il2rγ，不仅缺少t细胞，b细胞，而且缺少nk细胞功能，并且巨噬细胞、树突状细胞的数量也大量减少，进一步降低了免疫功能的小鼠，更加有利于人源化免疫系统的构建。
4.二十年前，日本的实验动物中央研究所(clea)发展了以nod为遗传背景的重度免疫缺陷型小鼠(nod scid il2rγko，)。随后，美国的jackson lab也开发了类似的小鼠，命名为很多中国公司也开发了以nod为背景的重度免疫缺陷型小鼠，分别命名为npg，ncg，nsi，b-ndg，m-nsg等。除了以nod为遗传背景的重度免疫缺陷小鼠，还有以balb/c为遗传背景的balb/c rag1/2ko il2rγko小鼠。目前，广泛用于重建人免疫系统的重度免疫缺陷小鼠是nod scid il2rγko小鼠，而balb/c rag1/2ko il2rγko小鼠天然免疫活性比nod scid il2rγko小鼠要高，重建人免疫系统能力也比nod scid il2rγko小鼠要弱，如果要提高balb/c rag1or2ko il2rγko小鼠重建人免疫系统的程度，需要经过更多的基因修饰。因此，balb/c rag1or2ko il2rγko小鼠在应用上不如nod scid il2rγko小鼠广泛。以上所述重度免疫缺陷小鼠被统称为第一代重度免疫缺陷小鼠。
5.在重度免疫缺陷型小鼠体内重建人源化免疫系统通常是通过向小鼠体内植入人的造血干细胞(cd34+hsc)来实现的。一段时间后，人造血干细胞可在小鼠体内重建出各种免疫细胞，例如人t细胞、人b细胞、人髓系细胞等。人的免疫系统通常需要人细胞因子的支持才能分化成熟。但由于第一代重度免疫缺陷小鼠缺少人mhc分子，而且部分小鼠细胞因子和人细胞因子缺少交叉反应，因此在一代重度免疫缺陷小鼠体内重建的人免疫系统存在功能缺陷，例如髓系细胞比较少，淋巴组织发育不全，t细胞和b细胞功能不完善。
6.因此，不断有人尝试在重症免疫缺陷小鼠体内表达人细胞因子或可发挥与人细胞因子同等作用的工程化细胞因子。然而目前广泛用于重建人免疫系统的nod scid il2rγ
ko小鼠由于遗传背景的特性，其胚胎干细胞(es细胞)不适于进行基因改造。而且这种小鼠的受精卵受孕率低，细胞核发育不成熟，也很难直接用于制作基因敲入或者过表达的转基因小鼠。由于对这种小鼠进行基因修饰的难度大，因此制作转基因重度免疫缺陷小鼠的方法通常是先对c57bl小鼠进行基因修饰，然后和nod scid il2rγko小鼠连续回交10代。经过约两年后，c57bl遗传背景的转基因小鼠可转变为nod scid il2rγko遗传背景的转基因小鼠。
7.例如，近几年来，clea和jackson lab也开发了以nod scid il2rγko为遗传背景的转基因小鼠，如nsg-tg(hu-il-15)、nsg-sgm3、hil2 nog、hil-6nog、hil-15nog、nog-exl等，以获得更加适宜于重建人造血干细胞系统的小鼠。日本的实验动物中央研究所(clea)开发的hil-15nog，利用cmv启动子在nog小鼠过表达了人的il-15，血浆表达量达到80-120pg/ml。但是因为细胞因子表达量略高，亦或细胞因子非特异性表达导致的细胞毒性，小鼠在重建人免疫系统之后容易获得消耗性疾病(waiting disease)，减少实验的窗口期。不过试验证明在hil-15nog小鼠中纯化的人外周nk细胞可以长时间维持生长。为了使人il-15达到生理性表达，美国jackson lab利用bac转基因技术，将完整人il5基因座转入nsg小鼠获得nsg-tg(hu-il-15)。人il-15在血浆表达量为7.1pg/ml。无论nsg-tg(hu-il-15)小鼠或是hil-15nog小鼠，都是利用转基因技术在小鼠表达外源的人il-15，并不能替换nog或nsg小鼠内源的il-15。因此内源的il-15也会对人免疫系统的功能，特别是人nk细胞的功能产生干扰。另外，由于遗传背景的特异性，利用同源重组原理对nod scid il2rγko小鼠的受精卵或es细胞直接进行基因编辑的技术难度高，也没有成功报道。因此这些小鼠都是以经典的受精卵显微注射方式建立c57bl为遗传背景的转基因小鼠，然后和nod scid il2rγko小鼠连续回交10代以上，得到过表达人细胞因子的重度免疫缺陷小鼠。整个回交过程历时约2年。
8.综上所述，现有技术中对nod scid il2rγko小鼠直接进行基因改造的成功率低，难度大，因此需要利用其它遗传背景的小鼠进行多代回交，导致消耗大量的时间和人力成本。并且现有技术中小鼠体内的人源细胞因子过表达，或与小鼠自身细胞因子的互相干扰，对小鼠本身发育成长和寿命产生不良影响，同时也会影响到在小鼠体内构建的人免疫系统的功能。对于与维持小鼠自身健康相关且与人同源细胞因子缺乏交叉活性的细胞因子，在小鼠体内进行人源化替代小鼠原有细胞因子或是使用现有技术进行过表达均会影响小鼠的健康和寿命，以及在其体内构建人免疫系统的功能。


技术实现要素：

9.技术问题
10.为更方便高效地引入人细胞因子或人源化细胞因子，构建更加适宜于重建人造血干细胞系统的小鼠，同时降低时间和人力成本，本技术利用优化的基因工程学方法，同时在一些步骤上进行创造性的改进，直接改造非人动物，例如nod scid il2rγko重度免疫缺陷型小鼠的受精卵细胞以避免回交，得到更加适宜于重建多功能人免疫系统的重度免疫缺陷型小鼠。
11.本技术解决了nod scid il2rγko等重度免疫缺陷小鼠不适于基因改造和/或受精卵受孕率低，细胞核发育不成熟，只能借助其他遗传背景的小鼠进行长时间的多代回交
来获得遗传稳定的基因工程小鼠的问题。
12.技术方案
13.具体来说，本技术涉及如下技术方案：
14.1.一种对非人动物，进行基因改造的方法，其包括：
15.对非人动物细胞的受精卵进行基因改造，
16.基因改造包括利用crispr/cas9对非人动物的受精卵进行基因编辑；
17.优选地，所述受精卵是体外受精的受精卵；
18.进一步优选地，所述受精卵是通过体外受精得到的，并且在体外培养一定时间的受精卵，优选一定时间为6小时以上，进一步优选为8小时以上、10小时以上、12小时以上、14小时以上，最优选16小时以上。
19.2.根据项1所述的方法，其中，对非人动物细胞的受精卵进行基因改造是通过对受精卵的细胞核或细胞质进行注射来完成的；
20.优选地，利用crispr/cas9方法，需要注射用于同源重组的线性dna模板大于等于2.5kb，对非人动物的受精卵进行基因编辑是对非人动物细胞的受精卵的细胞核进行显微注射。
21.3.根据项1或2所述的方法，其中，
22.所述非人动物是以nod为遗传背景的小鼠，
23.所述小鼠优选是敲除了重组激活基因1(rag1)或敲除了重组激活基因2(rag2)或scid突变的、缺失了t细胞和b细胞的免疫缺陷nod小鼠，
24.所述小鼠再进一步优选是进一步敲除了il2受体γ链的缺失了nk细胞的重度免疫缺陷nod小鼠。
25.4.一种对非人动物进行基因改造的方法，其包括：
26.通过对非人动物的受精卵进行基因改造使得细胞因子基因或免疫相关基因在原位进行人源化，而在这些细胞因子基因或免疫相关基因人源化后免疫缺陷型小鼠的健康和繁殖效率不会受到影响；
27.所述细胞因子包括以下任意一种或两种以上：白细胞介素-15(il-15)、白细胞介素-7(il-7)、白细胞介素-6(il-6)、b细胞活化因子(baff)、fms样酪氨酸激酶3配体(flt3l)重组蛋白；
28.所述免疫相关基因包括主要组织相容性复合体(mhc)；
29.优选地，所述细胞因子为白细胞介素-15(il-15)。
30.5.根据项4所述的方法，其中，
31.对非人动物进行基因改造的方法是对非人动物的受精卵进行基因改造，
32.优选利用crispr/cas9对非人动物的受精卵进行基因编辑，
33.进一步优选，对受精卵的细胞核进行显微注射从而利用crispr/cas9对非人动物的受精卵进行基因编辑以实现对细胞因子进行原位人源化。
34.6.根据项5所述的方法，其中，对非人动物的受精卵进行基因改造是在所述非人动物的il-15第四个外显子的后面插入兼并的人il15第五到第八个外显子的编码序列；
35.优选地，对非人动物的受精卵进行基因改造还包括在所述非人动物的il-15第四个外显子后面进一步插入bghpolya(bovine growth hormone polyadenylation)序列；
36.优选地，所述bghpolya序列如seq id no.2所示；
37.优选地，在所述非人动物的il-15第四个外显子后面插入兼并的人il15第五到第八个外显子的编码序列如seq id no.1所示。
38.7.根据项4～6中任一项所述的方法，其中，所述非人动物是以nod为遗传背景的小鼠，
39.所述小鼠优选是敲除了重组激活基因1(rag1)或敲除了重组激活基因2(rag2)或scid突变的、缺失了t细胞和b细胞的免疫缺陷nod小鼠，
40.所述小鼠再进一步优选是进一步敲除了il2受体γ链的缺失了nk细胞的重度免疫缺陷nod小鼠；
41.优选地，所述小鼠的il-15第四个外显子的序列如seq id no.4所示。
42.8.根据项5～7中任一项所述的方法，其中，所述非人动物的受精卵是通过体外受精获得的；
43.优选地，对所述非人动物的受精卵进行基因改造之前对体外受精得到的受精卵在体外培养一定时间，优选一定时间为6小时以上，进一步优选为8小时以上、10小时以上、12小时以上、14小时以上，最优选16小时以上。
44.9.根据项5所述的方法，其中，所述对所述非人动物的受精卵进行基因改造是对受精卵的细胞核进行显微注射，显微注射物质包括：
45.同源重组dna；
46.grna1，
47.grna2，以及
48.mrnacas9；
49.优选地，所述同源重组dna包括如seq id no.3所示的人il-15同源重组dna序列；
50.优选地，所述grna1的识别靶序列为：
51.catagctattatcaagttagtgg(seq id no.5)，
52.所述grna2的识别靶序列为：
53.gaaacacaagtagcacgagatgg(seq id no.6)。
54.10.一种构建重度免疫缺陷的动物模型的方法，该方法包括：
55.通过对非人动物的受精卵进行基因改造使得细胞因子基因或免疫相关基因在原位进行人源化，而这些细胞因子基因或免疫相关基因人源化改造后的不会影响免疫缺陷型小鼠的健康和繁殖效率的人源化；
56.所述细胞因子包括以下任意一种或两种以上：白细胞介素-15(il-15)、白细胞介素-7(il-7)、白细胞介素-6(il-6)、b细胞活化因子(baff)、fms样酪氨酸激酶3配体(flt3l)重组蛋白；
57.所述免疫相关基因包括主要组织相容性复合体(mhc)；
58.优选地，所述细胞因子为白细胞介素-15(il-15)。
59.11.根据项10所述的方法，其中，
60.对非人动物进行基因改造的方法是对非人动物的受精卵进行基因改造，
61.优选利用crispr/cas9对非人动物的受精卵进行基因编辑，
62.进一步优选，对受精卵的细胞核进行显微注射从而利用crispr/cas9对非人动物
的受精卵进行基因编辑以实现对细胞因子进行原位人源化。
63.12.根据项11所述的方法，其中，对非人动物的受精卵进行基因改造是在所述非人动物的il-15第四个外显子的后面插入兼并的人il-15第五到第八个外显子的编码序列；
64.优选地，对非人动物的受精卵进行基因改造还包括在所述非人动物的il-15第四个外显子后面进一步插入bghpolya(bovine growth hormone polyadenylation)序列；
65.优选地，所述bghpolya序列如seq id no.2所示；
66.优选地，在所述非人动物的il-15第四个外显子后面插入兼并的人il第五到第八个外显子的编码序列如seq id no.1所示。
67.13.根据项10～12中任一项所述的方法，其中，所述非人动物是以nod为遗传背景的小鼠，
68.所述小鼠优选是敲除了重组激活基因1(rag1)或敲除了重组激活基因2(rag2)或scid突变的、缺失了t细胞和b细胞的免疫缺陷nod小鼠，
69.所述小鼠再进一步优选是进一步敲除了il2受体γ链的缺失了nk细胞的重度免疫缺陷nod小鼠；
70.优选地，所述小鼠的il-15第四个外显子的序列如seq id no.4所示。
71.14.根据项11～13中任一项所述的方法，其中，所述非人动物的受精卵是通过体外受精获得的；
72.优选地，对所述非人动物的受精卵进行基因改造之前对体外受精得到的受精卵在体外培养一定时间，优选一定时间为6小时以上，进一步优选为8小时以上、10小时以上、12小时以上、14小时以上，最优选16小时以上。
73.15.根据项11所述的方法，其中，所述对所述非人动物的受精卵进行基因改造是对受精卵的细胞核进行显微注射，显微注射物质包括：
74.同源重组dna；
75.grna1，
76.grna2，以及
77.mrnacas9；
78.优选地，所述同源重组dna包括如seq id no.3所示的人il-15同源重组dna序列；
79.优选地，所述grna1的识别靶序列为：
80.catagctattatcaagttagtgg(seq id no.5)，
81.所述grna2的识别靶序列为：
82.gaaacacaagtagcacgagatgg(seq id no.6)。
83.16.线性dna，其包括如seq id no.3所示的人il-15同源重组序列。
84.发明的效果
85.本技术解决了nod scid il2rγko小鼠受精活性低，细胞核发育不成熟，不适于直接进行大片段的基因编辑的问题，可以直接对nod scid il2rγko小鼠受精卵进行基因改造，得到表达人源化细胞因子的nod scid il2rγko小鼠，从而避免多代回交，从而节省时间和人力成本。另外，本技术保留了部分人鼠源同源基因的片段，与截短的人源基因重组，获得嵌合的人源化基因。这样，一方面减小了插入片段的大小，提升了重组效率；另一方面以人源化基因替代了鼠源基因，相较于现有技术中常用的过表达方式，避免了人与小鼠基
因共同存在且互相干扰的情况，减少了在该小鼠体内构建人免疫系统时对人免疫系统分化定植及功能的影响，同时避免了过表达的人细胞因子对小鼠发育及生理功能的影响，延长了小鼠寿命及实验窗口期。
86.综上所述，本技术涉及一种工程化重度免疫缺陷小鼠的方法，所述工程化重度免疫缺陷小鼠可用于更加完整高效地在小鼠体内重建人免疫系统。相较于现有技术，使用本技术所述方法获取工程化小鼠更加省时高效，并且所获得的小鼠具有更长的试验窗口期，利用所述小鼠重建的人免疫系统功能也更加完备。
87.本技术解决了nod scid il2rγko小鼠受精活性低，细胞核发育不成熟不适于直接进行大片段的基因编辑的问题，实现了直接对nod scid il2rγko小鼠受精卵进行基因改造，得到表达人源化细胞因子的nod scid il2rγko小鼠，避免多代回交，从而节省时间和人力成本。另外，对于与维持小鼠自身健康相关且与人同源细胞因子缺乏交叉活性的细胞因子，本技术做到了适时适度的表达，一方面减少了在该小鼠体内构建人免疫系统时对人免疫系统分化定植及功能的影响，另一方面又避免了过度表达的人细胞因子对小鼠发育及生理功能的影响，从而维持了小鼠的健康，延长了小鼠寿命及实验窗口期。
88.综上所述，本技术涉及一种工程化重度免疫缺陷小鼠的方法，所述工程化重度免疫缺陷小鼠可用于更加完整高效地在小鼠体内重建人免疫系统。相较于现有技术，使用本技术所述方法获取工程化小鼠更加省时高效，并且所获得的小鼠健康状况更好，具有更长的试验窗口期，利用所述小鼠重建的人免疫系统功能也更加完备。
附图说明
89.图1小鼠il-15基因座人源化设计示意图；
90.图2小鼠il-15基因人源化后的cdna序列和蛋白质氨基酸序列。图2a为il-15人源化后的cdna序列(5
’‑3’
，5’utl\鼠源4+\人源5-8\)；图2b为il-15人源化后的氨基酸序列和鼠源il-15氨基酸序列比较；
91.图3hil-15同源重组质粒图谱；
92.图4通过elisa方法检测到的nvg小鼠和nvg-hil15小鼠血浆内人il-15的平均表达浓度；
93.图5(a)～(d)分别为注射人pbmc后，人cd45细胞、人t细胞、人nk细胞、表达cd16的细胞毒性的人nk细胞在小鼠血液中的频率；
94.图6小鼠注射人pbmc后的存活率；
95.图7小鼠先注射人pbmc再注射k562-luc后的k562-luc的ivis成像结果图；
96.图8向小鼠体内先后注射人外周血分离的nk细胞和k562-luc，并进行体内荷瘤试验的流程图；
97.图9注射人外周血分离的nk细胞后，小鼠活体内nk细胞百分比随时间的变化情况；
98.图10小鼠先注射人外周血分离的nk细胞再注射k562-luc后的k562-luc的ivis成像结果图；
99.图11向小鼠体内先后注射mia paca-2和car-nk92，并进行体内荷瘤试验的流程图；
100.图12小鼠先注射mia paca-2再注射car-nk92后的mia paca-2的ivis成像结果图；
101.图13小鼠先注射mia paca-2，再注射car-nk92后，体内平均荧光素酶含量变化图。
具体实施方案
102.定义
103.如本文中使用的术语“后代”包括子孙后代，并且包括自亲本细胞衍生的分化的或未分化的后代细胞。在一种用法中，术语后代包括与亲本遗传相同的后代细胞。在另一种使用中，术语后代包括与亲本遗传且表型相同的后代细胞。在又一种用法中，术语后代包括已经自亲本细胞分化的后代细胞。
104.如本文中使用的术语“启动子”包括与要转录的核酸序列(诸如编码期望分子的核酸序列)可操作连接的dna序列。启动子一般位于要转录的核酸序列的上游，并且提供rna聚合酶和其它转录因子特异性结合的位点。在特定的实施方案中，启动子一般位于转录的核酸序列的上游以生成期望的分子，并且提供rna聚合酶和其它转录因子特异性结合的位点。
105.如本文中使用的术语“免疫缺陷的”意指非人动物在其天然免疫系统的一个或多个方面是缺陷的，例如动物在一种或多种类型的发挥功能的宿主免疫细胞方面是缺陷的，例如在非人b细胞数目和/或功能、非人t细胞数目和/或功能、非人nk细胞数目和/或功能等方面是缺陷的。
106.在本文中使用的术语“非人动物”例如实验室动物、家畜、牲畜等，例如诸如鼠、啮齿类、犬、猫、猪、马、牛、绵羊、非人灵长类等物种；例如小鼠、大鼠、家兔、仓鼠、豚鼠、牛、猪、绵羊、山羊、和其它转基因动物物种，特别是哺乳动物物种，如本领域中已知的。在某些实施方案中，主题经遗传修饰的动物是小鼠、大鼠或家兔。
107.在一个实施方案中，非人动物是哺乳动物。在一些此类实施方案中，非人动物是小型哺乳动物，例如跳鼠总科(dipodoidea)或鼠总科(muroidea)的。在一个实施方案中，经遗传修饰的动物是啮齿类。在一个实施方案中，啮齿类选自小鼠、大鼠、和仓鼠。在一个实施方案中，啮齿类选自鼠总科。在一个实施方案中，经遗传修饰的动物来自选自下述的科：丽仓鼠科(calomyscidae)(例如小鼠样仓鼠)、仓鼠科(cricetidae)(例如仓鼠、新世界(newworld)大鼠和小鼠、田鼠)、鼠科(muridae)(真小鼠和大鼠、沙鼠、多刺小鼠(spiny mice)、鬃毛大鼠(crested rats))、马岛鼠科(nesomyidae)(攀爬小鼠(climbing mice)、岩石小鼠(rock mice)、有尾大鼠(with-tailed rat)、马达加斯加(malagasy)大鼠和小鼠)、刺山鼠科(platacanthomyidae)(例如多刺睡鼠(spiny dormice))、和鼢鼠科(spalacidae)(例如鼹鼠(mole rates)、竹鼠(bamboo rat)、和鼢鼠(zokors))。在一个具体的实施方案中，经遗传修饰的啮齿类选自真小鼠或大鼠(鼠科)、沙鼠、多刺小鼠、和鬃毛大鼠。在一个实施方案中，经遗传修饰的小鼠来自鼠科的成员。
108.如本文中使用的术语，nod小鼠是指no obesity diabetes即非肥胖糖尿病小鼠。nod小鼠有很多衍生品系，包括nod/scid nod/ltj小鼠等。
109.如本文中使用的术语“免疫缺陷小鼠”是指先天性遗传突变或用人工方法造成一种或多种免疫系统组成成分缺陷的小鼠，其常见突变基因型是，scid突变，rag1敲除，rag2敲除，主要表型是缺少t细胞和b细胞。
110.如本文中使用的术语“重度免疫缺陷鼠”通常是指进一步敲除了il2rγ基因功能的免疫缺陷型小鼠。il2rγ为很多细胞因子的共有受体。il2rγ的敲除可进一步降低小鼠
免疫系统的功能。重度免疫缺陷鼠主要表型是缺少t细胞，b细胞，nk细胞功能，而且巨噬细胞、树突状细胞的数量也大量减少。重度免疫缺陷鼠的主要用途是在小鼠重建人的免疫系统。
111.如本文中使用的术语“免疫系统人源化小鼠”通常是指在重度免疫缺陷型小鼠植入了人外周血白细胞(hpbmc)或人造血干细胞(cd34+hsc)以后，在小鼠体内重建一种或几种人免疫细胞的小鼠。
112.如本文中使用的术语“crispr/cas9”是细菌和古细菌在长期演化过程中形成的一种适应性免疫防御，可用来对抗入侵的病毒及外源dna。crispr/cas9基因编辑技术，则是对靶向基因进行特定dna修饰的技术。以crispr/cas9基础的基因编辑技术在一系列基因治疗的应用领域都展现出极大的应用前景，例如血液病、肿瘤和其他遗传疾病。该技术成果已应用于人类细胞、斑马鱼、小鼠以及细菌的基因组精确修饰。
113.在本文中使用的术语“白细胞介素”是由多种细胞产生并作用于多种细胞的一类细胞因子。指一类分子结构和生物学功能已基本明确，具有重要调节作用而统一命名的细胞因子，它和血细胞生长因子同属细胞因子。两者相互协调，相互作用，共同完成造血和免疫调节功能。白细胞介素在传递信息，激活与调节免疫细胞，介导t、b细胞活化、增殖与分化及在炎症反应中起重要作用。白细胞介素interleukin缩写为il，功能关系免疫反应的表达和调节，这种调节有来源于淋巴细胞或巨噬细胞等的许多因子参与。来源于淋巴细胞的有淋巴细胞活素，来源于巨噬细胞的总称为monokine，其中的各个因子的生物活性各有不同(例如巨噬细胞活化，促进t细胞繁殖等)，因子自身的物理化学性质多不清楚。
114.白细胞介素-15(il-15)可由活化的单核-巨噬细胞、表皮细胞和成纤维细胞等多种细胞产生。il-15的分子结构与il-2有许多相似之外，因此可以利用il-2受体的β链和γ链与靶细胞结合，发挥类似il-2的生物学活性。il-15可诱导b细胞增殖和分化，是唯一能部分取代il-2诱导初期抗体产生的细胞因子；il-15能够刺激t细胞和nk细胞增殖，诱导lak细胞活性，还能与il-12协同刺激nk细胞产生ifn-γ。
115.白细胞介素-7(il-7)是由骨髓基质细胞分泌的糖蛋白，分子量为25kd；其基因位于第8号染色体。il-7的靶细胞主要为淋巴细胞，对来自人或小鼠骨髓的b祖细胞、胸腺细胞及外周成熟的t细胞等均有促生长活性。
116.白细胞介素-6(il-6)的作用的靶细胞很多，包括巨噬细胞、肝细胞、静止的t细胞、活化的b细胞和浆细胞等；其生物效应也十分复杂，曾称为b细胞刺激因子2(bsf-2)、26kd蛋白、b细胞分化因子(bcdf)、肝细胞刺激因子(hsf)等。il-6不能刺激相应细胞分泌其它细胞因子，在生理浓度下对免疫细胞的自分泌作用亦比较弱，提示其主要免疫学功能是加强其它细胞因子的效果。il-6可由多种细胞合成，包括活化的t细胞和b细胞、单核-巨噬细胞、内皮细胞、上皮细胞以及成纤维细胞等。人类il-6基因位于第7号染色体上；il-6分子量在21～30kd之间，其差异是由于肽链的糖基化和磷酸程度不同所致。il-6由2条糖蛋白链组成；1条为α链，分子量80kd；另1条为β链，分子量130kd。α链缺少胞内区，只能以低亲合性与il-6结合，所形成的复合物迅即与高亲和性的β链结合，通过β链向细胞内传递信息。
117.细胞活化因子(baff)属肿瘤坏死因子超家族成员(tnfsf13b)，主要由单核细胞、树突状细胞及t细胞产生，可促进b细胞成熟和分化，在免疫应答中起重要作用，并与自身免疫密切相关。膜型baff主要表达于抗原提呈细胞，蛋白酶可使之水解而转变为可溶性baff。
118.fms样酪氨酸激酶3配体(flt3l)是一种能够调节早期造血的关键性细胞因子，与il-3、il-6、g-csf和scf等细胞因子联用对原始造血干/祖细胞产生强烈的增殖效应，flt3l是主要表达于造血干细胞/祖细胞上的iii型酪氨酸激酶受体fms样酪氨酸激酶3(flt3)的配体，是一种与早起造血调控有关的生长因子。flt3l联合其它细胞因子，能够在体内外显著地扩增dc，刺激t细胞核nk细胞增殖，为肿瘤免疫治疗提供了良好的基础。
119.fms样酪氨酸激酶3配体(flt3l)重组蛋白是指fms样酪氨酸激酶3配体在宿主细胞中进行重组表达的蛋白质。
120.白细胞抗原(hla)是一群存在于细胞表面的糖蛋白分子，曾认为引起器官移植排斥反应的主要抗原。检测hla有助于对某些疾病的诊断、分型、推测预后，可采用血清法测定a、b、c位点抗原，以混合淋巴细胞培养法测定d、dr抗原。
121.组织相容性复合体(major histocompatibility complex，mhc)是一组编码动物主要组织相容性抗原的基因群的统称。人类的mhc被称为hla(human leukocyte antigen，hla)，即人白细胞抗原；小鼠mhc则被称为h-2。hla位于人的6号染色体短臂上，h-2位于小鼠的17号染色体上。根据基因的位置和功能，主要组织相容性复合体分为三类，分别为mhc class i、mhc class ii、mhc class iii。
122.mhc class i(mhc i)：位于一般细胞表面上，可以提供一般细胞内的一些状况，比如该细胞遭受病毒感染，则将病外膜碎片之氨基酸链(peptide)透过mhc提示在细胞外侧，可以供杀手cd8+t细胞等辨识，以进行扑杀。
123.mhc class ii(mhc ii)：大多位于抗原提呈细胞(apc)上，如巨噬细胞等。这类提供则是细胞外部的情况，像是组织中有细菌侵入，则巨噬细胞进行吞食后，把细菌碎片利用mhc提示给辅助t细胞，启动免疫反应。
124.为了使在小鼠体内重建的人类免疫系统更加完善，需要在小鼠体内过表达人细胞因子或者将小鼠细胞因子人源化。本技术一种对非人动物，尤其是小鼠，尤其是以nod为遗传背景的小鼠进行基因改造的方法，其包括：对非人动物细胞的受精卵进行基因改造，基因改造包括利用crispr/cas9对非人动物的受精卵进行基因编辑。
125.更具体来说，小鼠是敲除了重组激活基因1(rag1)或敲除了重组激活基因2(rag2)或scid突变的、缺失了t细胞和b细胞的免疫缺陷nod、敲除了il2受体γ链的缺失了nk细胞的重度免疫缺陷nod小鼠。
126.在本技术一个具体实施方式中，所述非人动物的受精卵是上述重度免疫缺陷nod小鼠的受精卵，尤其是体外受精的受精卵。本技术的结果显示跟b6小鼠比较，nod小鼠体内受精的成胎率差。而体外受精的受精卵比体内受精的受精卵活性强。所以对于nod遗传背景的小鼠体外受精制备受精卵是首选。
127.在本技术一个具体方式中，进行基因改造的受精卵是对体外受精得到的，并且在体外培养一定时间的受精卵，优选一定时间为6小时以上，进一步优选为8小时以上、10小时以上、12小时以上、14小时以上，最优选16小时以上得到的受精卵。有文献报道，crispr技术可以在nod小鼠进行基因敲除和基因突变，但是对于大片段基因的定点整合没有成功案例。其差别在于这类小鼠的细胞核不成熟，小片段dna或grna可以通过注射细胞质然后计入细胞核，而大片段线性dna从细胞质进入细胞核的效率低，只有通过细胞核注射才可以。研究发现，在体外培养一定时间可以等待细胞核的成熟，有助于对于小鼠的基因改造。
128.在本技术一个具体方式中，对非人动物细胞的受精卵进行基因改造是通过对受精卵的细胞核或细胞质进行注射来完成的。这猜测是由于nod小鼠细胞核不成熟，对于染色体随机整合大片段dna，很难进行要细胞核注射，几率也比较低。具体来说，利用crispr/cas9方法，需要进行基因编辑的基因片段为长度在500bp以上的线性dna，对非人动物的受精卵进行基因编辑是对非人动物细胞的受精卵的细胞核进行显微注射。本技术将超过500bpcdna和polya定点插入基因组，而两侧的同源序列总共超过2.5kb。因此，在本技术具体的实施方式中，对体外受精得到的，并且在体外培养一定时间的受精卵，优选一定时间为6小时以上，进一步优选为8小时以上、10小时以上、12小时以上、14小时以上，最优选16小时以上得到的受精卵进行细胞核显微注射来完成的。
129.本技术还涉及一种对非人动物进行基因改造的方法，其包括：通过对非人动物的受精卵进行基因改造，使得细胞因子基因或免疫相关基因原位人源化，而原位人源化改造后的细胞因子基因或免疫相关基因不会影响免疫缺陷型小鼠的健康和繁殖效率的人源化。这些细胞因子基因或免疫相关基因人源化后不会影响免疫缺陷型小鼠的健康和繁殖效率。例如人和小鼠的同源性较高的细胞因子基因或免疫相关基因，即使将这些细胞因子基因或免疫相关基因同源化也不会改变其功能，因此不会显著改变免疫缺陷型小鼠的健康和繁殖效率。例如人和小鼠的同源性在50％以上的细胞因子基因或免疫相关基因，优选同源性在60％以上的细胞因子基因或免疫相关基因，进一步优选同源性在70％以上的细胞因子基因或免疫相关基因，进一步优选同源性在80％以上的细胞因子基因或免疫相关基因，进一步优选同源性在90％以上的细胞因子基因或免疫相关基因，进一步优选同源性在95％以上的细胞因子基因或免疫相关基因。
130.在本文中，原位人源化是指将小鼠基因或基因的一部分在同一基因位置替换成同源的人的基因或者人的基因一部分，例如在本文中在所述非人动物的il-15第四个外显子的后面，原本是非人动物的il-15的第五到第八个外显子及其内含子位置，替换为兼并的人il第五到第八个外显子的编码序列，这样的人源化即为原位人源化。
131.在本技术一个具体方式中，细胞因子包括但不限于：白细胞介素-15(il-15)、白细胞介素-7(il-7)、白细胞介素-6(il-6)、b细胞活化因子(baff)、fms样酪氨酸激酶3配体(flt3l)重组蛋白和白细胞抗原(hla)。在本技术一个具体方式中，所述细胞因子为白细胞介素-15(il-15)。
132.在本技术一个具体方式中，免疫相关基因是组织相容性复合体(mhc)。
133.在本技术一个具体方式中，对非人动物进行基因改造的方法是对非人动物的受精卵进行基因改造。具体来说，利用crispr/cas9对非人动物的受精卵进行基因编辑，对受精卵的细胞核进行显微注射从而利用crispr/cas9对非人动物的受精卵进行基因编辑以实现对细胞因子进行原位人源化。具体来说，对体外受精的、在体外培养一定时间的受精卵，优选一定时间为6小时以上，进一步优选为8小时以上、10小时以上、12小时以上、14小时以上，最优选16小时以上得到的受精卵的细胞核进行显微注射从而利用crispr/cas9对非人动物的受精卵进行基因编辑以实现对细胞因子进行原位人源化。
134.在一个具体的实施方式中，对非人动物的受精卵进行基因改造是在所述非人动物的il-15第四个外显子的后面插入兼并的人il第五到第八个外显子的编码序列。在本文中，在所述非人动物的il-15第四个外显子的后面是指非人动物的il-15第四个外显子的下一
个核苷酸的位置，即紧挨着第四个外显子的后面。在一个具体的实施方式中，非人动物是小鼠，小鼠的il-15第四个外显子的序列如seq id no.4所示，在小鼠的il-15第四个外显子即在seq id no.4的最后一个核苷酸位置后面插入兼并的人il第五到第八个外显子的编码序列。
135.具体来说，对非人动物的受精卵进行基因改造还包括在所述非人动物的il-15第四个外显子后面进一步插入bghpolya(bovine growth hormone polyadenylation)序列。具体来说，bghpolya序列如seq id no.2所示。
136.在具体的实施方式中，在所述非人动物的il-15第四个外显子后面插入兼并的人il第五到第八个外显子的编码序列如seq id no.1所示。
137.在具体的实施方式中，非人动物是以nod为遗传背景的小鼠。具体来说，小鼠是敲除了重组激活基因1(rag1)或敲除了重组激活基因2(rag2)或scid突变的、缺失了t细胞和b细胞的免疫缺陷nod、且敲除了il2受体γ链的缺失了nk细胞的重度免疫缺陷nod小鼠。如上所述的小鼠的il-15第四个外显子后面用于插入兼并的人il第五到第八个外显子的编码序列的靶序列如seq id no.4所示。
138.在具体的实施方式中，对所述非人动物的受精卵进行基因改造是对受精卵的细胞核进行显微注射，显微注射物质包括：同源重组dna；grna1，grna2，以及mrnacas9。具体来说，同源重组dna包括如seq id no.3所示的人il-15同源重组dna序列。所述grna1的识别靶序列为catagctattatcaagttagtgg(seq id no.5)，所述grna2的识别靶序列为gaaacacaagtagcacgagatgg(seq id no.6)。
139.在本技术中，还涉及一种构建重度免疫缺陷的动物模型的方法，通过对非人动物的受精卵进行基因改造从而使得非人动物中表达不会影响免疫缺陷型小鼠的健康和繁殖效率的细胞因子的基因人源化。具体来说，其中涉及的内容可以上述针对本技术所描述的全部内容。
140.在有些情况下，人和小鼠细胞因子序列相似功能相近或该鼠源细胞因子的缺失并不影响重度免疫缺陷小鼠的健康。因此这些小鼠细胞因子在人源化后，在有利于人免疫系统重建的同时又不会对小鼠已有免疫系统带来损害。例如il-15可以促进t细胞和nk细胞的发育和成熟。但是重度免疫缺陷小鼠没有内源的t细胞和nk细胞。在这类小鼠人源化il-15可以促进人t细胞和nk细胞的重建，但又不会影响重度免疫缺陷小鼠的健康。
141.本技术尝试利用优化的crispr/cas9依赖的受精卵显微注射技术直接将nod scid il2rγko小鼠的il-15人源化。
142.本技术通过优化的显微注射方法直接对nod scid il2rγko小鼠的受精卵进行基因修饰，得到原位人源化il-15的重度免疫缺陷型小鼠。这样的人源化方法可以同样适用于改造被动免疫相关的细胞因子，如il-6、il-7、baff、hla等。
143.本技术涉及一种线性dna，其包括如seq id no.3所示的人il-15同源重组序列。
144.对重度免疫缺陷小鼠，特别是nod scid il2rγko遗传背景的小鼠，进行基因修饰一直是世界性技术难题。主要是因为这种小鼠的受精卵成活率低，数量少。在本技术中，发明人利用了体外受精(ivf)的方法，提高了受精卵的胚胎成活率。此外，本技术的发明人保留了小鼠il-15的前4个外显子和前3个内含子，在其后插入了合并的人第5到第8个外显子。这种设计不仅可以减少基因敲入的长度，还可以保留小鼠的表达调控元件，包括启动子和
部分内含子，和小鼠的信号肽。因此il-15基因人源化的nod scid il2rγko小鼠血清表达水平为90pg/ml，近似于生理水平。本技术的方法也同样适用于在nod scid il2rγko小鼠定点敲入其他人基因，如il-7，il-6，baff和hla等被动免疫相关的细胞因子。
145.实施例
146.实施例1在nod scid il2rγko小鼠中人源化细胞因子il-15
147.为了加快转基因的nod scid il2rγko小鼠的开发，省去回交过程，本技术的发明人尝试联合使用优化的受精卵体外受精技术和基因编辑工具依赖的同源重组技术对nod scid il2rγko小鼠的受精卵进行基因编辑。本实施例的nod scid il2rγko小鼠为购自上海南方模型的m-nsg小鼠，其为应用crispr/cas9技术，敲除nodscid小鼠的il2rγ基因，得到的重度免疫缺陷小鼠。
148.以人源化小鼠il-15基因为例，人il-15有8个外显子，长度达96kb。在本实施例中，发明人使用了crispr/cas9依赖的同源重组技术进行小鼠il-15基因的人源化。为克服crispr/cas9依赖的同源重组技术对基因长度依赖的局限性，在基因设计上，发明人在小鼠il-15第四个外显子处定点插入兼并的人il-15第五到第八个外显子，见图1。新生成的基因不仅去除了鼠源il-15的干扰，还利用了小鼠il-15的全部启动子、部分内含子调控序列和鼠源il-15的分泌信号肽，这种基因设计很大程度上实现了细胞因子生理性水平表达，又缩小了敲入基因的长度提高了基因敲入的成功率。为了优化nod scid il2rγko小鼠的基因编辑流程，发明人以c57bl小鼠的受精卵作为对照。具体步骤如下。
149.1.人源化il-15同源重组质粒的构建
150.根据小鼠il-15-mgp_nodshiltj_t0089152.1转录本的信息进行分析：该转录本内含子、外显子信息均被ncbi收录，是唯一的转录本。该转录本结构内有8个外显子(exons)，蛋白翻译起始于外显子3，终止于外显子8。小鼠il-15-mgp_nodshiltj_t0089152.1转录本信息见以下链接：http://useast.ensembl.org/mus_musculus_nod_shiltj/transcript/exons？db＝core；g＝mgp_nodshiltj_g0033628；r＝8:91916329-91999766；t＝mgp_nodshiltj_t0089 152。
151.人il-15-202转录本(il-15-202)同样含有8个exons，蛋白翻译起始于外显子3，终止于外显子8。人il-15-202转录本的信息见以下链接：http://useast.ensembl.org/homo_sapiens/transcript/exons？db＝core；g＝ensg00000164136；r＝4:141636583-141733987；t＝enst00000320650。
152.根据上述信息，在小鼠il-15-mgp_nodshiltj_t0089152.1转录本第四个外显子3’端插入兼并的人il-15-202转录本的第五到第八个外显子的编码序列(seq id no.1)和pghpolya(seq id no.2)。人源化后的il-15核酸序列及蛋白序列与小鼠同源序列比较结果如图2a，2b所示。小鼠il-15基因座第四个外显子末端上游约500bp的基因组dna为5’同源臂，下游约500bp的基因组dna为3’同源臂。按照本领域技术人员所熟知的分子生物学克隆方法，将上述同源臂序列和人il-15部分外显子(合称为同源重组序列)重组到pbr322载体(sigma，cata:10481238001)(重组完成后称人il-15同源重组质粒)。人il-15同源重组质粒见图3。同源重组序列如seq id no.3所示。
153.2.针对鼠il-15基因外显子4的crispr grna序列设计
154.使用crispr.mit.edu来设计指导rna(grna)，所述grna的靶向位点位于小鼠il-15
转录本第四个外显子。所述grna的靶向位点的序列如下：
[0155][0156]
纯化的cas9 mrna购自origene，商品编号为ge100054。
[0157]
3.小鼠受精卵的制备和显微注射
[0158]
nod scid il2rγko小鼠(实验组)和c57bl小鼠(对照组)作为精子及卵子的供体。cd1小鼠为假孕母鼠。nod scid il2rγko小鼠源自nod scid小鼠，利用crispr/cas9技术敲除了il2rγ基因第四到第八个外显子。以上小鼠购自上海模式生物公司。
[0159]
3.1受精
[0160]
自然受精(nature mating)制备受精卵:选择雌鼠注射孕马血清促性腺激素(pmsg)(sigma chemical inc.，cat.no.g4877-2000iu)，46h～48h后注射人绒毛膜促性腺激素(hcg)(sigma chemical inc.，cat.no.cg10-1vl)，注射后即与正常雄鼠按照1:1合笼。第2天，断颈处死成栓受精卵供体鼠，手术取出整个输卵管，放入透明质酸酶～0.3mg/m2液中。显微镜下，仔细观察放在透明质酸酶m2液(sigma chemical，cata:m 7167)中的受精卵，当受精卵周围的颗粒细胞脱离时，将受精卵吸出，放入m2液中洗涤，最后放在m16液(sigma chemical，cat.no.m7292)中放入5％co2，37℃培养箱培养。在显微镜下观察，挑选细胞饱满，透明带清晰，细胞核清晰可见的受精卵待用。
[0161]
体外受精(ivf)制备受精卵:按照常规操作促排卵，选择适龄雌鼠(6周)注射孕马血清促性腺激素(pmsg)，46h～48h后注射hcg，第二天检验阴道成栓。收集精子：将符合要求的性成熟(8周以上)的雄鼠颈椎脱臼处死，取出附睾上体尾部，去除脂肪与血迹后，置于htf液(millipore，cata:mr-070-d)内。利用眼科剪在液滴内横断附睾尾，当精子充分游离出附睾尾后，将组织从液滴内取出，将培养皿置于培养箱。处死超排后的雌鼠，取出两侧的输卵管，用显微镊将卵母细胞团拨到受精滴中。用10μl移液器从精子滴吸取精子，加到卵子滴中，根据卵团大小情况以及精子的活力每滴加8μl左右的精子。将精卵混合后，最后放在m16液中放入5％co2，37℃培养箱培养。
[0162]
3.2受精卵活性测定
[0163]
制备假孕鼠:将正常雌鼠与结扎雄鼠合笼(3:1)，第2天见栓的雌鼠为假孕鼠。每只假孕鼠的输卵管被植入20个左右的受精卵。3周后，小鼠出生。以出生小鼠的数量和植入受精卵的比例衡量受精卵的活性。
[0164]
3.3显微注射
[0165]
在受精卵在m16培养一段时间后开始显微注射。在组织培养载玻片中央滴一滴m2培养液，用矿物油将液滴覆盖。用持卵针吸住受精卵，每次将含有线性化的同源重组质粒dna(100ng)，上述grna(50ng each)，mrnacas9(100ng)注射针刺入受精卵的细胞核(pronucleus)或者细胞质(cytosol)中。注射使其细胞膨胀，退出注射针，再吸取下一枚受精卵注射。
[0166]
4.胚胎移植
[0167]
注射受精卵同一天，用移卵针吸取约20枚受精卵植入见栓假孕雌鼠的输卵管壶腹部。然后将卵巢和输卵管送回假孕鼠体内，缝合伤口。
[0168]
5.转基因小鼠基因型和表型的测定
[0169]
5.1小鼠基因型分析
[0170]
手术后19～21天仔鼠分娩，待仔鼠3周后，剪耳，编号，剪尾。通过pcr扩增及测序对其进行基因型鉴定。设计pcr引物序列如下。
[0171]5’
端同源臂重组克隆鉴定引物信息：
[0172]
引物序列5'
‑‑
》3'引物类型itctgatgggaactggatga(seq id no.7)正向iiagcctgacttactgttgtg(seq id no.8)反向
[0173]3’
端同源臂重组克隆鉴定引物信息：
[0174][0175]
按照经典分子生物学方法利用pcr鉴定子代小鼠的基因组dna。pcr阳性克隆鉴定结果显示，5’臂同源重组阳性基因组应扩增出4.1kb片段，阴性基因组应扩增出6.9kb片段；3’臂同源重组阳性基因组应扩增出3.6kb片段，阴性基因组应扩增出6.9kb片段。测序结果与pcr结果一致。具体结果如表1中f1代所示。
[0176]
由于受精卵早期卵裂速度很快，因此得到的f0代小鼠为嵌合体，不一定具备稳定遗传的能力，需要进行传代以获得可稳定遗传的f1代小鼠。按照如上方法，从5个f0小鼠的子代中鉴定了3个阳性的f1代小鼠。结果见表1和表2。
[0177]
表1.f1代阳性小鼠编号和基本信息
[0178][0179]
[0180]
表1中的he表示杂合子
[0181]
表2 crispr/cas9介导的在nod-scid il2rγko小鼠进行基因定点敲入的优化
[0182][0183]
根据以上结果可知，使用体外受精、胞质内注射重组、及注射前培养等优化条件，nod-scid il2rγko重度免疫缺陷小鼠的成胎率及重组成功率均得到大幅提升，达到了与对照组c57bl小鼠相当的水平。
[0184]
表型测定(人il-15在转基因小鼠表达量)
[0185]
从小鼠眼眶静脉取抗凝血，离心制备血清。使用human il-15quantikine elisa kit(r&d systems，catalog#d1500)检测f1代小鼠血清中人il-15细胞因子的表达水平。非转基因nod scid il2rγko小鼠的血清作为阴性对照。elisa结果见图4。结果显示本技术所述方法可使nod scid il2rγko小鼠稳定表达人源化il-15，并且其血清表达水平为90pg/ml，非转基因nod scidil2rγko小鼠体内，人il-15的平均血浆表达浓度为0。将上述成功构建的可稳定表达人源化il-15的nod scid il2rγko小鼠命名为nvg-hil15小鼠非转基因nod scid il2rγko小鼠命名为nvg小鼠。
[0186]
对重度免疫缺陷小鼠，特别是nod scid il2rγko遗传背景的小鼠，进行基因修饰一直是世界性技术难题。主要是因为这种小鼠的受精卵成活率低，数量少。如表2示自然受精的受精卵胚胎成活率只有9.8％，远低于c57bl小鼠的48.9％。所以大多数转基因的nod scid il2rγko小鼠是通经转基因的c57bl小鼠与nod scid il2rγko小鼠连续回交得到的。因此育种周期长。在本技术中，发明人利用了体外受精(ivf)的方法，提高了受精卵的胚胎成活率。如表2所示，对体外受精后受精卵的细胞核进行显微注射后，也很难得到定点敲入il-15基因的转基因小鼠。这有可能是由于nod scid il2rγko小鼠的受精卵细胞核发育迟缓。在对细胞核进行经典的显微注射后，受精卵的生殖活性容易受到影响。利用最新的基因编辑技术，如crispr技术，也可以实现在受精卵水平敲除小鼠内源基因。但是，未见报道利用crispr技术将大片段的外源dna，如人il-15，定点敲入nod scid il2rγko的受精卵并得到可遗传的转基因小鼠的案例。这主要区别在于利用crispr技术敲除基因的时候，只需要向受精卵的细胞质导入grna和cas9 mrna。这些小分子很容易进入细胞核。而定点敲入大片段dna的时候，需要提供大片段的dna作为同源重组修复的模板。而大片段很难从细胞质进入细胞核。从实验对比中还发现，体外受精后6小时对细胞核进行显微注射的时候无阳性重组小鼠出生。而经过延长受精卵培养时间，体外受精16小时以后进行受精卵细胞核显微
注射，则有5个阳性f0代小鼠出生。其中3个f0代小鼠得到阳性子代。以上结果显示nod scid il2rγko小鼠受精卵的细胞核似乎发育比较慢，延长细胞培养时间可以促进受精卵细胞核在显微注射后的成活率。通过不同实验条件的比对，本技术优化了对nod scid il2rγko小鼠受精卵进行基因修饰，例如对crispr介导的基因定点插入的方法。该实验方法还适用于其他基因编辑方法，例如zfns，talens等技术同样适用于对nod scid il2rγko小鼠受精卵的基因定点整合。
[0187]
虽然利用基因编辑的方法进行受精卵基因定点敲入比较高效和简洁。但是插入片段大小会受限。如果基因超过2kb，定点插入效率会大大降低。例如本实施例中的人il-15基因，其完整的基因座有95kb。因此在基因设计的时候，本技术的发明人保留了小鼠il-15的前4个外显子和前3个内含子，在其后插入了合并的人第5到第8个外显子。这种设计不仅可以减少基因敲入的长度，还可以保留小鼠的表达调控元件，包括启动子和部分内含子，和小鼠的信号肽。因此il-15基因人源化的nod scid il2rγko小鼠血清表达水平为18pg/ml，近似于生理水平。本技术的方法也同样适用于在nod scid il2rγko小鼠定点敲入其他人基因，如il-7，il-6，baff和hla等被动免疫相关的细胞因子。
[0188]
综上所述，本技术的优点是可直接对nod scid il2rγko小鼠受精卵进行基因改造，得到表达人源化细胞因子的nod scid il2rγko小鼠，避免多代回交，从而节省时间和人力成本。另外，本技术保留了鼠源同源基因的部分片段，与截短的人源基因重组，获得人源化基因。例如人源化il-15，利用了包含小鼠本身il-15基因utr在内的部分，减少了定点插入片段的大小，提高了同源重组的效率。同时，这一设计中，小鼠本身的il-15由人源化的il-15替代，避免了现有技术中常常出现的人与小鼠il-15共同存在且互相干扰的情况，减少了对人nk细胞等人免疫细胞功能的影响。此外，由于人源化il-15使用的是小鼠本身的启动子，因此避免了现有技术中经常出现的人il-15过表达的情况，从而更大程度地避免了人il-15对小鼠本身发育的影响。人源化il-15后，nod scid il2rγko小鼠将支持人的nk细胞的生长和成熟，可以用于检测car-nk的活性和抗体的adcc效应。
[0189]
实施例2应用实施例1构建的人源化il-15免疫缺陷小鼠(nvg-hil15)评估nk细胞相关的免疫疗法
[0190]
由于nk细胞拥有的天然杀伤肿瘤的细胞毒性，所以以嵌合抗原受体nk细胞治(car-nk)和抗体依赖细胞介导的细胞毒性作用(adcc)为代表的免疫治疗策略逐步引起了人们的开发兴趣。携带人类免疫系统的免疫缺陷小鼠已经被广泛用于评估新型人体免疫疗法。但是这些模型缺乏功能性自然杀伤细胞(nk细胞)限制了其在这方面的应用。因此，开发基于nk细胞介导的免疫疗法迫切需要一种改进型临床前动物模型用于临床转化研究。
[0191]
1.nvg小鼠和实施例1构建的nvg-hil15小鼠
[0192]
nvg小鼠为购自上海南方模型的m-nsg小鼠，其为应用crispr/cas9技术，敲除nodscid小鼠的il2rγ基因，得到的nod scid il2rγko小鼠，即重度免疫缺陷小鼠，我们将其命名为nvg小鼠，作为对照组。
[0193]
nvg-il15小鼠及其它转基因小鼠皆是在nvg小鼠这个品系上的基因修饰。由于人il-15是天然杀伤细胞(nk细胞)体内稳态和成熟的关键细胞因子，如图1所示，我们通过人源化nvg小鼠的il-15，得到表达人il-15的nvg-hil15小鼠，作为实验组。
[0194]
通过elisa方法测定nvg小鼠和nvg-hil15小鼠体内人il-15的平均血浆表达浓度，
测定结果如图5所示，在nvg-hil15小鼠体内，人il-15的平均血浆表达浓度为90pg/ml，在nvg小鼠体内，人il-15的平均血浆表达浓度为0。
[0195]
2.比较人pbmc在nvg小鼠和nvg-hil15小鼠的移植效率和体内对k562-luc细胞的生长抑制
[0196]
分别向nvg小鼠和nvg-hil15小鼠中注射500万个人pbmc，检测人pbmc中各细胞在nvg小鼠和nvg-hil15小鼠血液中的频率，测定结果如图5(a)～(d)所示，在注射人pbmc后，人cd45细胞、人nk细胞、表达cd16的细胞毒性的人nk细胞在nvg-hil15小鼠血液中的频率显著高于其在对照组nvg小鼠血液中的频率。因高表达cd16的人nk细胞具有抗体依赖性细胞毒性(adcc)的功能，这使人pbmc移植的nvg-hil15小鼠有望应用于adcc相关的免疫治疗的转化研究。
[0197]
由于高度人源化的免疫系统可能导致nvg-hil15小鼠在6周后表现移植物抗宿主病(gvhd)，如图6所示，nvg-hil15小鼠在注射500万个人的pbmc约6周后存活率骤降，约8周后其存活率为0，nvg小鼠在注射人pbmc约10周后存活率开始逐渐降低(因为有了区别，10周以后没有再检测)。
[0198]
向nvg小鼠和nvg-hil15小鼠中注射人pbmc后，再注射人白血病荧光素酶标记细胞k562-luc，高度人源化的免疫系统也使得nvg-hil15小鼠展现抑制k562-luc细胞生长的特性，如图7所示，注射k562-luc 6周后，与nvg小鼠相比，nvg-hil15小鼠体内k562-luc细胞的生长受到明显的抑制。
[0199]
3.外周血来源-nk细胞在人源化小鼠模型中的增殖和细胞毒性
[0200]
如图8所示，向nvg小鼠和nvg-hil15小鼠体内分别注射107个来自健康供体的人外周血分离的nk细胞，3天后再注射5
×
106个k562-luc，最后利用ivis活体成像系统检测肿瘤细胞溶解情况。
[0201]
注射来自健康供体的人外周血分离的nk细胞后，测定体内nk细胞的百分比，结果如图9所示，来自健康供体的人外周血分离的nk细胞可以在nvg-il15小鼠持续生长6周，而其在nvg小鼠中只能维持2周生长。
[0202]
利用ivis活体成像系统进行的体内荷瘤试验结果如图10所示，人nk细胞可明显抑制k562-luc细胞在nvg-il15小鼠体内的生长。以上结果表明，nvg-hil15小鼠也可以用于nk细胞相关免疫治疗的转化研究。
[0203]
4.car-nk92细胞在小鼠体内对肿瘤细胞的杀伤毒性
[0204]
如图11所示，用环磷酰胺(ctx)分别预处理nvg小鼠和nvg-hil15小鼠，然后原位注射mia paca-2(一种人类胰腺癌细胞系)，注射量为100万个细胞，注射mia paca-2两周后，再每周注射107个经辐照过的car-nk92细胞直到对照组小鼠死亡，最后利用ivis活体成像系统检测肿瘤细胞溶解情况。
[0205]
利用ivis活体成像系统进行的体内荷瘤试验结果如图12所示，表明经辐照过的car-nk92细胞可以明显抑制在nvg-hil15小鼠体内原位移植的mia paca-2的生长。以上结果表明，nvg-hil15小鼠在研究基于nk疗法方面具有明显的优越性。
[0206]
每周注射107个经辐照过的car-nk92细胞系后，再向小鼠注射荧光素酶底物荧光素(luciferin)，用高灵敏ccd相机检测nvg小鼠和nvg-hil15小鼠体内荧光素酶含量变化情况，结果如图13所示，nvg-hil15小鼠体内的荧光素酶含量骤降，而nvg小鼠体内的荧光素酶
含量变化不大。结果显示在nvg-hil15小鼠，car-nk92细胞可以杀死活肿瘤mia paca-2细胞。
[0207]
工业实用性
[0208]
利用本技术所述方法可以更高效便捷地构建表达人细胞因子的重度免疫缺陷小鼠，节省人力物力成本。并且，利用本技术所述方法构建的小鼠更加利于人类免疫系统及其组成部分的定植和发挥功能，为免疫学相关动物试验提供更加优质的实验材料。例如，用于检测人类造血干细胞及基于人类造血干细胞的治疗细胞的分化和定植功能；模拟人类免疫系统及肿瘤免疫微环境，在抗体药物、细胞免疫药物等的开发，传染性疾病、自身免疫病以及肿瘤学研究等多个领域发挥重要作用另外，本工作得到表达人源化il15的重度免疫缺陷型小鼠(nvghil5),可以用于nk细胞相关免疫疗法(adcc,car-nk等)的评估。
[0209]
序列表
[0210]
人il第五到第八个外显子的编码序列(seq id no.1)
[0211]
ggcattcatgtcttcattttgggctgtttcagtgcagggcttcctaaaacagaagccaactgggtgaatgtaataagtgatttgaaaaaaattgaagatcttattcaatctatgcatattgatgctactttatatacggaaagtgatgttcaccccagttgcaaagtaacagcaatgaagtgctttctcttggagttacaagttatttcacttgagtccggagatgcaagtattcatgatacagtagaaaatctgatcatcctagcaaacaacagtttgtcttctaatgggaatgtaacagaatctggatgcaaagaatgtgaggaactggaggaaaaaaatattaaagaatttttgcagagttttgtacatattgtccaaatgttcatcaacacttcttga
[0212]
bghpolya序列(seq id no.2)
[0213]
ctagagctcgctgatcagcctcgactgtgccttctagttgccagccatctgttgtttgcccctcccccgtgccttccttgaccctggaaggtgccactcccactgtcctttcctaataaaatgaggaaattgcatcgcattgtctgagtaggtgtcattctattctggggggtggggtggggcaggacagcaagggggaggattgggaagacaatagcaggcatgctgggga
[0214]
人il-15同源重组dna序列(seq id no.3)
[0215]
其包括5’同源臂(小写)，鼠外显子4(大写无下划线)，人源化序列(大写有下划线)，bghpolya(大写斜体无下划线)和3’同源臂(小写)
[0216]
seq id no.3：
[0217][0218][0219]
小鼠的il-15第四个外显子的序列(seq id no.4)
[0220]
aaaccatatatgaggaatacatccatctcgtgctacttgtgtttccttctaaacagtcactttttaactgaggct
[0221]
grna1的识别靶序列(seq id no.5)
[0222]
catagctattatcaagttagtgg
[0223]
grna2的识别靶序列(seq id no.6)
[0224]
gaaacacaagtagcacgagatgg
[0225]
引物i(seq id no.7)
[0226]
tctgatgggaactggatga
[0227]
引物ii(seq id no.8)
[0228]
agcctgacttactgttgtg
[0229]
引物iii(seq id no.9)
[0230]
tgcagccccattcatcatc
[0231]
引物iv(seq id no.10)
[0232]
ggcagctccattttccatcat