一种用于大熊猫源巴贝斯虫检测的引物及其试剂盒和检测方法与流程

本发明属于生物学
技术领域：
，具体涉及一种用于大熊猫源巴贝斯虫检测的引物及其试剂盒和检测方法。
背景技术：
：巴贝斯虫(babesia)是寄生于脊椎动物红细胞内的顶复门原虫，蜱是主要的传播媒介，红细胞是唯一可感染的宿主细胞。由巴贝斯虫感染引起的巴贝斯虫病，是世界范围性血液原虫病，其主要临床症状为高热、贫血、黄疸和血红蛋白尿等。目前已经有100种以上的巴贝斯虫得到鉴定。该病不仅给畜牧业和国民经济造成巨大损失，同时也严重危害了野生动物健康与种群保护，可危害犬科、猫科、浣熊科、鹿科和灵长类等动物，个别种类还有人感染的报告。大熊猫源巴贝斯虫(genbank:mt256300.1)是在大熊猫血液中发现的一种巴贝斯虫，是首次报告大熊猫感染巴贝斯虫并引起巴贝斯虫病，该巴贝斯虫从亲缘关系树的分析，显著区别于牛巴贝斯虫、犬巴贝斯虫和田鼠巴贝斯虫等中国主要流行的巴贝斯虫病原，其引物并不适用于大熊猫源巴贝斯虫的检测。因此，缺乏针对大熊猫源巴贝斯虫的特异性引物，显著影响大熊猫源巴贝斯虫检出率，目前，急需探索一种用于检测大熊猫源巴贝斯虫的特异性引物和检测方法。针对该病，最基础的检测方法为血液涂片显微镜镜检法，该方法检出率低，也无法辨别虫种，无法做到早期诊断，目前用作急性发病期的辅助检测手段；临床上常使用血清学检测进行巴贝斯虫流行病学研究，但由于市面上没有针对大熊猫的抗体，在检测中使用的抗体存在较大的种属差异性，不能准确的反应出大熊猫感染巴贝斯虫血清学检测的结果；因此在实验室诊断中，最常使用的是分子诊断技术，其中最常用的为普通pcr检测技术，但该方法检测大熊猫巴贝斯虫时会出现低灵敏性的问题，大熊猫带虫量低时会出现漏检等问题，不利于大熊猫源巴贝斯虫的早期诊断。技术实现要素：针对现有技术中的上述不足，本发明提供一种用于大熊猫源巴贝斯虫检测的引物及其试剂盒和检测方法，本发明针对大熊猫源巴贝斯虫的18srrna为靶基因的特异性区域，设计4条特异性引物，提供了一种针对大熊猫源巴贝斯虫的套式pcr检测方法，解决了缺乏针对大熊猫源巴贝斯虫的分子检测方法，实现对大熊猫巴贝斯虫特异且灵敏的早期诊断方法。为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种用于大熊猫源巴贝斯虫检测的引物，包括如seqidno.1和seqidno.2所示的外引物，以及seqidno.3和seqidno.4所示的内引物。一种用于大熊猫源巴贝斯虫检测的试剂盒，包括上述引物、pcr反应预混液、阳性对照以及阴性对照。进一步地，pcr反应预混液包括taq酶、dtnp、mg2+离子、缓冲液等成分。进一步地，阴性对照为ddh2o。进一步地，阳性质粒中含有大熊猫源巴贝斯虫18srrna基因。进一步地，阳性质粒的构建方法为：将扩增产物克隆至puc19载体，然后与e.colitop10感受态细胞混匀后冰浴30min，42℃水浴中热击90s，再迅速置冰上2min，加入700μllb液体培养基中培养40min，将菌液涂布于含100μg/ml氨苄青霉素的lb琼脂平板上，37℃培养过夜，收集含有18srrna阳性质粒的大肠杆菌菌株，并用质粒提取试剂盒提取细菌质粒，用bamhi/sali限制性内切酶剪切质粒，经凝胶电泳鉴定及测序后获得的阳性重组质粒dna；该阳性质粒中所含有的特异性序列如seqidno.5所示。采用上述引物，或试剂盒对大熊猫源巴贝斯虫进行检测的方法，包括以下步骤：(1)提取大熊猫血液dna，备用；(2)以步骤(1)所得dna为模板，采用外引物对进行第一轮pcr；(3)以第一轮pcr产物为模板，采用内引物对进行第二轮pcr，然后凝胶电泳并判断是否含有巴贝斯虫。进一步地，第一轮pcr的反应体系包括：2μl模板dna、1μl上游外引物、1μl下游外引物、12.5μlpcr预混液，再用ddh2o补足至25μl。进一步地，第一轮pcr的反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性45s；58℃退火45s；72℃延伸1min，共30个循环，末次延伸72℃保持10min，最后4℃保存。进一步地，第二轮pcr的反应体系包括：2μl第一轮pcr产物、1μl上游内引物、1μl下游内引物、12.5μlpcr预混液，再用ddh2o补足至25μl。进一步地，第二轮pcr的反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s；62℃退火30s；72℃延伸1min，共30个循环，末次延伸72℃保持10min，最后4℃保存。进一步地，步骤(3)中的判断标准为：当阳性对照泳道有385bp大小的条带，且阴性对照泳道没有条带时，表明检测结果有效，含有巴贝斯虫；否则检测结果无效。本发明的有益效果：1、本发明试剂盒采用自主设计的pcr反应引物对2对，人工合成的阳性质粒作为阳性对照，自主筛选出的适合的反应体系和pcr两轮的反应条件，提供了一种巢式pcr检测方法来检测大熊猫源巴贝斯虫。2、本发明试剂盒通过对大熊猫的临床样品进行检测，能够有效检测出大熊猫源的巴贝斯虫，该临床样本的检测也对试剂盒的有效性和临床使用提供了保障。3、本发明提供了一种大熊猫源巴贝斯虫18srnra阳性质粒及构建方法，该阳性质粒作为阳性对照或阳性质控品，可实现在检测部门和各个饲养单位对大熊猫巴贝斯虫的pcr检测工作。4、该方法与血液涂片显微镜镜检法相比，显著降低漏检率，显著提高大熊猫源巴贝斯虫检测灵敏度和准确性；与血清学检测相比，克服了缺乏大熊猫特异性抗体，显著提高准确性并能即时反映是否携带虫体的情况；与普通pcr检测相比，该方法显著提高检测灵敏度，提高至少1000倍以上；实现了微量大熊猫血液检测，也能获得高检测率的优势，解决了大熊猫血液珍贵，仅用微量血液也能获得优越检测效果，具有显著的灵敏性和实用性，适用于大熊猫血液巴贝斯虫的检测，因此，该方法是最为适用于大熊猫源巴贝斯虫的检测方法之一。5、目前报道的大熊猫会感染的血液寄生虫主要有肝簇虫、弓形虫和巴贝斯虫这三种，排除该检测方法会检测到肝簇虫和弓形虫的可能性才能有效说明本方法的特异性，本发明中的检测方法对这三种寄生虫的18srrna片段进行了pcr检测，证明了该检测方法仅能检测出巴贝斯虫，无法检测出弓形虫和肝簇虫，证明了本检测方法的特异性，排除其他大熊猫血液寄生虫对其的干扰。6、大熊猫源的针对套式pcr的检测方法，筛选出不同虫株的特异性片段是尤为重要的一步，也是核心内容之一，但目前报告的巴贝斯虫的检测方法的专利中，缺乏适用于大熊猫源巴贝斯虫的序列片段，本发明是针对大熊猫源巴贝斯虫的18srrna的一段特异性片段，设计特异性引物，能准确有效的进行检测，填补上大熊猫源巴贝斯虫检测的空缺，显著提高敏感性和特异性，实现大熊猫源巴贝斯虫的早期诊断，适用于开展大熊猫巴贝斯虫流行病学调查，对于大熊猫的巴贝斯虫病的控制及预防有重要意义。附图说明图1为本发明方法对18srrna第一轮pcr和第二轮pcr产物的凝胶电泳图，其中m：dl2000marker；1：为gpb18-f1和gpb18-r1第一轮pcr的扩增结果；2：为gpb18-f2和gpb18-r2第二轮pcr的扩增结果；3：为阴性对照；图2为常规pcr敏感性试验结果。其中m：dl2000marker；1：为浓度是1ng/μl巴贝斯虫质粒；2～11：为10倍倍比稀释的浓度依次是0.1ng/μl～0.1ag/μl巴贝斯虫质粒；图3为套式pcr敏感性试验结果。其中m：dl2000marker；1：为浓度是1ng/μl巴贝斯虫质粒；2～11：为10倍倍比稀释的浓度依次是0.1ng/μl～0.1ag/μl巴贝斯虫质粒；图4为该套式pcr对大熊猫血液检测巴贝斯虫的结果，其中m：dl2000marker；1：阳性对照；2：为阴性对照；3～24：为22只大熊猫血液样品；图5为套式pcr特异性试验结果，其中m：dl2000marker；1：为阳性对照；2：为阴性对照；3：为弓形虫18srrna质粒；4：为肝簇虫18srrna质粒；图6为18srrna基因套式pcr产物的测序结果，385bp；图7为巴贝斯虫系统进化树图。具体实施方式下面对本发明的具体实施方式进行描述，以便于本
技术领域：
的技术人员理解本发明，但应该清楚，本发明不限于具体实施方式的范围，对本
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的普通技术人员来讲，只要各种变化在所附的权利要求限定和确定的本发明的精神和范围内，这些变化是显而易见的，一切利用本发明构思的发明创造均在保护之列。实施例1大熊猫源巴贝斯虫套式pcr检测试剂盒制备1、引物设计与合成根据前期研究，该巴贝斯虫从亲缘关系树的分析(图7)，认为是一种巴贝斯虫新种，显著区别于中国主要流行的巴贝斯虫病原，而现有引物并不适用于大熊猫源巴贝斯虫的检测。且大熊猫血液样品较为珍贵，获取量较少，同时，针对大熊猫隐性感染巴贝斯虫的检测情况，有必要进一步提高灵敏度，方可适用于大熊猫巴贝斯虫的检测。因此，本申请在大熊猫源巴贝斯虫18srrna序列高变区中，选取大熊猫源巴贝斯虫的特异性序列，设计针对该虫种的特异性引物2对，并由专业公司按设计要求合成，引物合成后制备冻干粉状，然后用1×tebuffer稀释至100μm的浓度作为保存液。-20℃保存。将保存液通过无酶水稀释10倍后制得工作液，用于常规使用。具体引物名称及引物碱基序列见表1。表1引物序列2、pcr反应预混液本申请中使用的pcr反应预混液包括taq酶、dtnp、mg2+离子、缓冲液等成分。3、阳性对照阳性对照是通过将扩增产物克隆至puc19载体，然后与e.colitop10感受态细胞混匀后冰浴30min，42℃水浴中热击90s，再迅速置冰上2min，加入700μllb液体培养基中培养40min，将菌液涂布于含100μg/ml氨苄青霉素的lb琼脂平板上，37℃培养过夜，收集含有18srrna阳性质粒的大肠杆菌菌株，并用质粒提取试剂盒提取细菌质粒，用bamhi/sali限制性内切酶剪切质粒，经凝胶电泳鉴定及测序后获得的阳性重组质粒dna，此质粒dna是本发明试剂盒中所使用的阳性对照，该阳性对照所含有的特异性序列如下seqidno.5所示。4、阴性对照以去离子水ddh2o为阴性对照。5、以上述构建的引物、pcr反应预混液、阳性对照以及阴性对照组成本申请中使用的可用于对大熊猫源巴贝斯虫检测的试剂盒。实施例2敏感性检测1、用核酸蛋白分析仪(nanodrop2000)测得实施例1中阳性质粒的核酸浓度为1ng/μl，对实施例1所获得的阳性质粒进行10倍倍比稀释，选取各稀释度质粒2μl当作模板，共11个浓度梯度(1ng/μl-0.1ag/μl)，用巴贝斯虫检测常用引物bj1/bj2(bj1：5′-gtcttgtaattggaatgatgg-3′；bj2：5′-tagtttatggttaggactacg-3′)进行常规pcr扩增。图2为大熊猫巴贝斯虫常规pcr敏感性检测扩增结果。在泳道1-8能扩增出(500bp)单一目的的条带，表明该次检测的最低浓度为10ag/μl。2、对阳性质粒(核酸浓度为1ng/μl)进行10倍倍比稀释，直到稀释到第11个浓度(0.1ag/μl)，选取各稀释度质粒2μl当作模板，用引物gpb18-f1和gpb18-r1进行第一轮pcr扩增，以第一轮pcr产物dna的10倍稀释液为模板，采用引物gpb18-f2和gpb18-r2进行第二轮pcr扩增。图3为大熊猫巴贝斯虫套式pcr敏感性检测扩增结果。在泳道1-11均能扩增出385bp单一目的条带，表明该次检测的最低浓度为0.01ag/μl。因此，与常规pcr结果相比，本发明的套式pcr检测灵敏度是常规pcr扩增检测灵敏度的1000倍以上。实施例3特异性检测根据文献报告，目前感染大熊猫的血液寄生虫有肝簇虫、弓形虫和该发明中的巴贝斯虫，本发明中检测样品主要为大熊猫血液样品，为了排除检测方法会检测肝簇虫和弓形虫的可能性，说明该检测方法的特异性，特此开展该方法的特异性试验。采用弓形虫(genbank:l24381.1)和肝簇虫质粒(genbank:ay150067.2)对本发明的引物和试剂盒进行特异性验证。选取各质粒2μl当作模板，用引物gpb18-f1和gpb18-r1进行第一轮pcr扩增，以第一轮pcr产物dna的10倍稀释液为模板，采用引物gpb18-f2和gpb18-r2进行第二轮pcr扩增。图5为套式pcr特异性检测扩增结果。泳道1为大熊猫巴贝斯虫阳性质粒，泳道2为弓形虫质粒，泳道3为肝簇虫质粒，泳道1在出现385bp阳性条带，泳道2和3均无条带，因此本试验说明该检测方法具有较好的特异性，可以用于大熊猫巴贝斯虫的检测，不会受到大熊猫其他血液寄生虫的干扰。实施例4采用实施例1设计引物或试剂盒进行大熊猫源巴贝斯虫检测1、大熊猫血液dna提取圈养大熊猫驯化采集血液或者在麻醉状态下采集大熊猫静脉血，采集数量为20只，置于含有edta抗凝剂的采血管中，混匀，按照血液dna提取试剂盒的步骤，制备待测dna。2、第一轮pcr扩增取步骤1制备的待测dna为模板2μl，gpb18-f1和gpb18-r1引物各加入1μl，在pcr反应预混液以及ddh2o构成的25μl反应体系进行第一轮pcr；反应程序：95℃预变性5min→95℃变性45s，58℃退火45s，72℃延伸1min，该步骤进行30个循环→末次延伸72℃保持10min→4℃保存。3、第二轮pcr扩增取2μl第一轮pcr产物dna的10倍稀释液为模板，加入1μlgpb18-f2和1μlgpb18-r2引物，在pcr反应预混液以及ddh2o构成的25μl反应体系进行第二轮pcr，扩增产物的目标大小为385bp；反应程序：95℃预变性5min→95℃变性30s，62℃退火30s，72℃延伸1min，该步骤进行30个循环→末次延伸72℃保持10min→4℃保存。4、凝胶电泳取第二轮pcr产物5μl，采用质量比1％琼脂糖凝胶电泳检测，150v恒压电泳30min，通过凝胶成像系统观察结果。阳性对照泳道含有1个条带，条带大小为385bp，阴性对照泳道没有条带。阳性和阴性对照不符合上述结果判断检测无效，需重新检测。当阳性和阴性结果正常时，待检样品泳道出现385bp的条带则判断为阳性，无条带则判断为阴性。其结果见表4和图4。表4大熊猫血液检测及阳性率项目大熊猫血液样本例数22阳性2阳性率9.09％根据表4和图4的检测结果可以看出，本发明试剂盒能够成功检测出大熊猫巴贝斯虫，该检测对试剂盒的有效性、大规模使用性提供了保障。序列表<110>成都大熊猫繁育研究基地<120>一种用于大熊猫源巴贝斯虫检测的引物及其试剂盒和检测方法<160>5<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>25<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1gtgacaagaaataacaatacagggc25<210>2<211>19<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2gaccatactccccccagaa19<210>3<211>17<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3agtacattggagggcag17<210>4<211>17<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>4ggttaggactacgacgg17<210>5<211>1604<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>5agcatgcatgtctagtacaaactttttacggtgaaactgcgaatggctcattacaacagt60tatagtttctttggtattcgttttccatggataaccgtgctaattgtagggctaatacaa120gttcgaggccttttggcggcgtttattagttctcaaaccttcccttttggttttcggtga180ttcataataaacttgcgaatcgctttttgcgatggaccattcaagtttctgacccatcag240cttgacggtagggtattggcctaccgaggcagcaacgggtaacggggaattagggttcga300ttccggagagggagcctgagaaacggctaccacatctaaggaaggcagcaggcgcgcaaa360ttacccaatcctgacacagggaggtagtgacaagaaataacaatacagggcaattgtctt420gtaattggaatgatggtgacctaaaccctcaccagagtaacaattggagggcaagtctgg480tgccagcagccgcggtaattccagctccaatagcgtatattaaacttgttgcagttaaaa540agctcgtagttgaatttctgcgttatcgacttcgtcgcttttgcctcgtttcgatttcgc600ttttgggttttccctttttactttgagaaaattagagtgtttcaagcagacttttgtctt660gaatacttcagcatggaataatagagtaggactttggttctattttgttggtttaagagc720cttagtaatggttaataggaacggttgggggcattcgtatttaactgtcagaggtgaaat780tcttagatttgttaaagacgaactactgcgaaagcatttgccaaggacgttttcattaat840caagaacgaaagttaggggatcgaagacgatcagataccgtcgtagtcctaaccataaac900tatgccgactagggattggaggtcgtcatttttccgactccttcagcaccttgagagaaa960tcaaagtctttgggttctggggggagtatggtcgcaaggctgaaacttaaaggaattgac1020ggaagggcaccaccaggcgtggagcctgcggcttaatttgactcaacacggggaaactca1080ccaggtccagacaatgttaggattgacagattgatagctctttcttgattctttgggtgg1140tggtgcatggccgttcttagttggtggagtgatttgtctggttaattccgttaacgaacg1200agaccttaacctgctaactagtgtccgtaaataggttttttccgttacggtttgcttctt1260agagggactttgcggctctaagccgcaaggaagtttaaggcaataacaggtctgtgatgc1320ccttagatgtcctgggctgcacgcgcgctacactgatgcattcatcgagttttatccctg1380tccgaaaggtctgggtaatctttagtatgcatcgtgacggggattgatttttgcaattct1440aaatcatgaacgaggaatgcctagtatgcgcaagtcatcagcttgtgcagattacgtccc1500tgccctttgtacacaccgcccgtcgctcctaccgatcgagtgatccggtgaattattcgg1560accgtggcttttccgattcgtcggtttgcctaggaagtttgacg1604当前第1页12