一种盐藻无损伤循环培养装置

本发明涉及盐藻培养装置技术领域，具体涉及一种盐藻无损伤循环培养装置。

背景技术：

盐藻是具有双鞭毛的单细胞绿藻，其鞭毛长度为细胞长度的1-2倍，且极易受外界机械力损伤。其细胞壁结构主要由糖蛋白复合物组成而缺乏刚性的纤维素组分，这种柔性细胞结构特性也导致了盐藻细胞在产业化养殖过程中极易受外界机械剪切力的损伤而出现生长衰退甚至细胞死亡。此外，盐藻细胞的损伤和死亡会释放大量有机物至培养体系中，促进细菌、甚至敌害生物的繁殖；溶解在体系中的蛋白等有机物在补气装置的作用下会产生大量气泡，进而引起更多盐藻气浮聚集而死亡。

目前，盐藻尚无成功的异养发酵工业化成功案例。因此，盐藻工业化生产全部采用光合自养模式，即通过盐藻细胞的光合作用进行生物质积累和次级代谢产物合成，进而收获富含特定代谢产物的盐藻作为后续产品加工的原料。光合作用依赖盐藻中rubisco酶，但rubisco酶既可以与co2发生反应通过光合作用过程合成有机物供细胞生长；又可以与o2发生反应进行光呼吸作用分解有机物，消耗细胞的物质与能量，进而降低盐藻的产量，因此，在盐藻培养过程中需要尽量降低培养体系中do2（溶解性氧气）同时提高dco2（溶解性二氧化碳）的值，以促进盐藻细胞进行光合作用而抑制其光呼吸作用。

盐藻的的工业化实践和核心装置在设计时必须考虑两大因素：在降低剪切力的同时，保证富含盐藻细胞混合液进行充分的循环以促进细胞进行光合作用。因此，低剪切力甚至无剪切力的循环模块是盐藻产业化化养殖工艺设计的核心与关键。蔡志武的“一种产业化培养微藻的生产装置”（中国专利，cn201245640y）公开了一种气推运行的封闭光生物反应器模型，但是该发明仅适用于水平流动的液体。罗光宏等人的“一种盐藻培养装置”（中国专利，cn209722114u）采用电机驱动搅拌轴和搅拌翅对盐藻培养液进行搅拌以避免细胞贴壁，但是其机械转动依然会引入外源机械剪切力，可能对细胞造成损伤；此外，搅拌也会提高设备的能耗。何雅玲等人的“一种自吸氧式管式光生物反应器”（中国专利，cn107043693b）通过引入燃料电池组吸收反应器中的高浓度溶解氧，但仍需要借助于循环水泵实现藻液的循环。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是提供一种盐藻培养装置，完全不依赖于机械泵、无外界机械剪切力的条件下使盐藻液高效循环，光合氧解析过程和补充二氧化碳过程物理隔离，实现降低溶解性氧气，提高溶解性二氧化碳，进而促进盐藻细胞进行光合固碳，同时抑制其光呼吸过程。

基于上述问题，本发明提出的技术方案是一种盐藻无损伤循环培养装置，包括气升式反应器、与气升式反应器上端与下端均相通的光生物反应器，气升式反应器包括交换柱、连接在交换柱下端的长度可调的竖直管路、竖直管路底部的离心泵、设置在竖直管路上的射流器、底部与射流器下端的所述竖直管路连通的氧气循环管路、连接在氧气循环管路顶部的空气压缩机。

所述气升式反应器上设置旁路循环管路，所述旁路循环管路顶端与交换柱连通，底端与射流器下端的所述竖直管路连通，旁路循环管路上安装液体流量计。

气升式反应器顶部远离光生物反应器的一侧连接负压管路，其中，负压管路末端连接三通，所述三通一端连接在位于其上方的负压抽气机上，另一端连接溢流管路，溢流管路末端连接位于其下端的废液收集箱。

气升式反应器顶部与光生物反应器连接的管路上连接二氧化碳钢瓶。

其中，所述交换柱为底部呈锥形、顶部呈圆柱形的中空容器，其顶部设置进料口，在交换柱内部循环管路上端负压管路下端位置处设置气泡排出口。

进一步的，氧气循环管路上安装第一气体流量计。

进一步的，气升式反应器顶部与光生物反应器相连通的管路上设置补气口，二氧化碳钢瓶设置在所述补气口处，二氧化碳钢瓶与补气口之间的管路上安装第二气体流量计。

进一步的，气升式反应器底部与光生物反应器相连通的管路上设置ph电极。

进一步的，在气升式反应器与光生物反应器相连通的管路上、旁路循环管路上、负压管路上均设置控制流量大小或启闭的阀门。

依赖于该装置的盐藻循环培养方法为：

1）开启机械泵，对交换柱和光生物反应器分别进行消毒、曝气；

2）加入培养液和无菌盐藻藻种液；

3）开启led光源，设置光、暗周期，开启空气压缩机，调节第一气体流量计，开启二氧化碳钢瓶，调节第二气体流量计，系统每连续运转4小时，读取溶氧电极值，及时调整气体流量值至氧气浓度降低至所需阈值，暗周期内关闭二氧化碳钢瓶；

4）启动负压抽气机，废液收集箱收集废液，根据排除液量补加新鲜无菌培养基。

对于步骤2，卤水养殖盐藻过程中，首先依靠外置空气压缩机经由射流器通入压缩空气，压缩空气在混合液中沿竖直管路上浮，带动盐藻细胞与卤水的混合液上升达到h1后在交换柱中循环，使其从低位h0循环至高位h1，气体和盐藻液在上升过程中，发生气体交换。并随气泡的上升而混匀最终到达h3高度。在补气口通入二氧化碳，随盐藻混合液进入光生物反应器进行光合作用,由于盐藻细胞经光合固碳，在光生物反应器中盐藻细胞吸收无机碳，导致溶解性二氧化碳降低；通入气体的二氧化碳浓度大于h0处二氧化碳浓度，在藻液从h0处上升至h1过程中，气相中co2向盐藻液扩散，使得盐藻液中溶解性二氧化碳升高。类似的，由于盐藻细胞经光合放氧，在光生物反应器积累大量氧气，导致溶解性氧气升高；通入消毒压缩气体的氧气浓度小于h0处氧气浓度，在藻液从h0处上升至h1过程中，盐藻液中o2自液相向气相扩散，使得盐藻液中溶解性氧气降低。通过读取溶氧电极，调节液体流量计，直至溶解性氧气降低至所需阈值。至此实现溶氧解析与二氧化碳补充的物理隔离。机械离心泵仅在清洗管路或者平衡不含盐藻细胞的培养液使用。接入盐藻细胞后，机械离心泵将一直处于关闭状态，因此对盐藻细胞不存在任何机械损伤。

对于步骤4，气泡从出口溢出到达负压管路被负压抽气机抽出，部分破碎或者死亡的细胞被气浮带出，从溢流管路流出到达废液收集装置。

本发明的优点和有益效果：

1、本发明采用负压与正压相结合的液位差气升式模块，实现完全不依赖于机械泵、无外界机械剪切力的条件下使盐藻液高效循环，即通过射流器引入消毒压缩空气，提升盐藻液上升实现无损伤循环，离心泵仅在清洗管路或者平衡不含盐藻细胞的培养液使用，接入盐藻细胞后，机械离心泵将一直处于关闭状态，对盐藻细胞不存在任何机械损伤。

2、旁路循环的设置，根据交换柱内溶氧值调整旁路循环流量与循环时间，可以对系统中的溶解氧气进行高效、可控解析，降低盐藻细胞光呼吸效率。

3、二氧化碳补充模块与溶氧解析模块物理隔离，实现降低溶解性氧气，提高溶解性二氧化碳，进而促进盐藻细胞进行光合固碳，同时抑制其光呼吸过程，最终实现卤水养殖盐藻的人工可控性。

4、设置顶部负压模块和废泡溢流管，提升藻液高度，实现盐藻细胞碎片的及时隔离，降低反应器污染物。

5、装置高度可依据所搭配的反应器模块进行调节高度，竖直管路高度可调，针对不同类型的光生物反应器，可根据气升式反应器的垂直高度尺寸h，当光生物反应器的高度大于h，通过延长本装置的竖直管路，以满足本装置高度达到高度h；当光生物反应器的高度低于h，可缩短竖直管路的高度，以适应不同高度尺寸的平板式、管道式、跑道池式光生物反应器。

6、本发明所述的旁路气升模式下培养的盐藻细胞密度较已有技术具有25%-34%效率的提升。

附图说明

图1是本发明的循环培养装置的结构示意图。

图2是不同培养模式下不同运行天数盐藻细胞密度的变化示意图。

其中：1.负压抽气机；2.溢流管路；3.废液收集箱；4.负压管路；5.液体流量计；6.进料口；7.气泡排出口；8.竖直管路；9.离心泵；10.溶氧电极；11.交换柱；12.射流器；13.空气压缩机；14.第一气体流量计；15.ph电极；16.二氧化碳钢瓶；17.第二气体流量计；18.补气口；19.上法兰接口；20.下法兰接口；21.光生物反应器；22.光照区域；23.第五阀门；24.第四阀门；25.第二阀门；26.第三阀门；27.第一阀门；28.第十三阀门；29.第十二阀门；30.第十一阀门；31.第八阀门；32.第九阀门；33.第十阀门；34.第六阀门；35.第七阀门。

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图对本发明的具体实施方式作详细说明。

如图1所示，一种盐藻无损伤循环培养装置，包括气升式反应器、与气升式反应器上端与下端均相通的光生物反应器21，气升式反应器上端与光生物反应器21之间连接的管路末端设置上法兰接口19，气升式反应器下端与光生物反应器21之间连接的管路末端设置下法兰接口20，气升式反应器包括交换柱11、连接在交换柱11下端的长度可调的竖直管路8、竖直管路8底部的离心泵9、设置在竖直管路8上的射流器12、底部与射流器12下端的所述竖直管路8连通的氧气循环管路、连接在氧气循环管路顶部的空气压缩机13，氧气循环管路上安装第一气体流量计14。

交换柱11为底部呈锥形顶部呈圆柱形的中空容器，在交换柱11顶部中心设置进料口6，进料口6处设置第一阀门27，在交换柱11内部循环管路上端负压管路4下端设置气泡排出口7。

所述气升式反应器上设置旁路循环管路，所述旁路循环管路顶端与交换柱11连通，底端与射流器12下端的所述竖直管路8连通，旁路循环管路上安装液体流量计5，在旁路循环管路顶端靠近交换柱11处设置第二阀门25，在旁路循环管路底端靠近竖直管路8处设置第三阀门26。

气升式反应器顶部远离光生物反应器21的一侧连接负压管路4，负压管路4末端连接三通，所述三通一端连接在位于其上方的负压抽气机1上，另一端连接溢流管路2，溢流管路2末端连接在位于下端的废液收集箱3上，水平负压管路4上设置第四阀门24，废液收集箱3的出口处设置第五阀门23。

气升式反应器顶部与光生物反应器21连接的管路上设置二氧化碳钢瓶16。气升式反应器顶部与光生物反应器21相连通的管路上设置补气口18，二氧化碳钢瓶16设置在所述补气口18处，二氧化碳钢瓶16与补气口18之间的管路上安装第二气体流量计17；在气升式反应器与二氧化碳钢瓶16之间连接的管路上安装第六阀门34，二氧化碳钢瓶16与所述光反应器之间的管路上安装第七阀门35。

气升式反应器底部与光生物反应器21相连通的管路上设置ph电极15，ph电极15处安装第八阀门31，气升式反应器底部与光生物反应器21相连通的管路上设置向下延伸的排液口，所述排液口处安装第九阀门32，在ph电极15安装处与光生物反应器21之间的管路上安装第十阀门33，在ph电极15安装处与离心泵9之间的管路上安装第十一阀门30，气升式反应器底部与光生物反应器21相连通的管路与竖直管路8之间设置分流支管，所述分流支管上安装第十二阀门29，分流支管与离心泵9之间的管路上安装第十三阀门28。

加料前，关闭第四阀门24、第五阀门23、第九阀门32、第十三阀门28，打开第一阀门27、第二阀门25、第三阀门26、第十二阀门29、第十一阀门30、第八阀门31、第十阀门33、第六阀门34、第七阀门35，接种量按照1:10~1:50比例范围接种，开启空气压缩机13，读取第一气体流量计14值，调节流量至0.1*v/min，压力设定为ρ*g*（h4-h1），其中ρ为所用培养液密度，g为重力常数；开启二氧化碳钢瓶16，读取第二气体流量计17，调节二氧化碳气体流速为0.001*v/min。至此盐藻混合液开始经由上法兰接口19流向反应器，经过光照区域22完成光合作用后，经由下法兰接口20返回h0。读取ph电极15的值，若ph＞8.5，增加二氧化碳流速至0.01*v/min。读取ph电极15的值，7.5＜ph＜8.5，调节二氧化碳钢瓶16阀门出口气量至0.001*v/min。若ph＜7.5，关闭二氧化碳钢瓶16。细胞密度生长过程中，或其达到指数期后，部分正常死亡细胞及细胞分泌的代谢物会导致交换柱11的液面顶部有气泡形成；此时需打开第四阀门24，启动负压抽气机1，交换柱11中液面上升，带动气泡经由溢流管路2流向废液收集箱3。排气泡结束后，关闭第四阀门24，关闭负压抽气机1。交换柱11液面下降，并根据排除液量补加新鲜无菌培养基。打开第五阀门23，用显微镜检查所排出的废液和气泡中细胞破碎情况，排净废液收集箱3中的废液。

实施例1依赖于本培养装置的培养方法为：清洗封闭的平板式光生物反应器21，总容积为900l。本装置的总容积为100l。将上述装置灌入浓度为200ppm的次氯酸钠溶液，开启离心泵9，充分消毒5小时后排净；使用井水冲洗1遍，开启空气压缩压机13，流量计5调整为10l/min。充分曝气5小时后排净。使用潜水泵抽取900l盐度为30‰的天然海水，加入54kg重量的nacl，充分混匀，测量其盐度为90‰，添加kno3450g，27gkh2po4，1080gmgso4，360gnahco3，加入约18ml浓盐酸溶液调节ph至8.10。将上述培养液充分混合，经过0.22μm孔径滤膜过滤后。关闭负压抽气机11,第二阀门25、第十三阀门28、第九阀门32。从进料口6一次性加入100l无菌盐藻藻种液（藻种细胞浓度约为10万细胞/ml），加入后液面高度为2米。开启光生物反应器21的led光源，光强调至300μe，设置光、暗周期为16小时光照，8小时黑暗。开启空气压缩机13，调节第一气体流量计14总流量为10l/min。开启二氧化碳钢瓶16，调节第二气体流量计17流量为100ml/min。光周期16小时内，系统每连续运转4小时，读取溶氧电极10，超过25mg/l。开启第二阀门25，增加气体流量至20l/min。监测溶氧电极10探头降低至20mg/l后，关闭第二阀门25。暗周期内，关闭二氧化碳钢瓶16。按照上述操作，10天后测定细胞密度，达到270万细胞/ml后完1个培养周期。

运行一定时间后，经由第九阀门32处接出后将样品导入流通池，用可见分光光度计在680nm下测定吸光度，即od680，该吸光度与细胞密度呈现线性正相关。根据经验公式y=159.76x，测算细胞密度（万个细胞/ml）。

传统泵模式下为依靠泵推进藻液循环、传统气升模式为只通入压缩无菌空气；本申请的旁路气升模式为依据体系中的溶解性二氧化碳和溶解性氧气动态调整旁路循环流量。分别测定三种模式在不同运行时间细胞密度，经过5天运行，初始密度od680均为0.2，连续监测数据表明本发明所述的旁路气升模式较已有技术具有25%-34%效率的提升，如图2所示，从中可发现通过旁路气升模式下培养可促进盐藻细胞光合作用而提高生物产量，对卤水养殖盐藻具有了一定的可控性。

以上对本发明的一个实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明申请范围所作的均等变化与改进等，均应仍归属于本发明的专利涵盖范围之内。