一种与牛生长性状相关的SNP分子标记及其应用的制作方法

本发明涉及牛育种技术领域，特别涉及一种与牛生长性状相关的snp分子标记及其应用。

背景技术：

牛的育种工作指的是凡是能从遗传结构上改进牛的品质、提高产品的数量和质量的工作，牛的品种选育就是使优良基因在群体内得到巩固和提高，从而创造出生产性能优越的个体，并使优良个体数量扩大的过程。使牛群的重要经济性状得到遗传改良。传统的育种方法主要依靠于表现型选择，无法了解其遗传背景。

现在，育种学家把对目标性状的改良逐步从表现型选择转变到基因型选择理论，充分利用分子育种手段开展选育工作。目前，分子标记辅助选择在育种工作中应用最为广泛，越来越受到人们的重视，利用分子标记与决定目标性状基因紧密连锁的特点，通过检测分子标记，即可检测到目的基因的存在，达到选择目标性状的目的，具有快速、准确、不受环境条件干扰的优点，借助分子标记对目标性状基因型进行选择。分子标记辅助育种缩短了育种年限，加快了育种进程，提高了育种效率，克服了很多常规育种方法中的困难。

单核苷酸多态性主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的dna序列多态性。它是人类可遗传的变异中最常见的一种，占所有已知多态性的90％以上。snp在人类基因组中广泛存在，snp是基因组中最普遍、频率最高的遗传标记。snp是一种二态的标记，由单个碱基的转换或颠换所引起，也可由碱基的插入或缺失所致。snp既可能在基因序列内，也可能在基因以外的非编码序列上。某些位于基因表达序列内的snp有可能直接影响蛋白质结构和表达水平。snp易于实现自动化分析，被认为是继rflp、微卫星标记之后的第三代分子标记技术，在遗传育种研究中有广阔的应用前景。

公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种与牛生长性状相关的snp分子标记，为牛的遗传育种提供新的分子标记资源。

为实现上述目的，本发明提供了一种与牛生长性状相关的snp分子标记，该分子标记位于水牛dgat2基因nw_005783701.1的第14436个碱基处，所述分子标记的核苷酸序列如seqidno.1所示；seqidno.1中的碱基为a或g。具体序列如下所述：

tgcccctctcatgtctaggaaggcgtctgtggggaggtgggctggtgtggggtactctgcagctgcagggaagggcggacaggctgacatctgtcttctgtctgtcacaggcactggctccagcatcctctctgccctccaggacctgttttctgtcacttggctcaataggtccaaggtagagaagcagctccaagtcatctcggtgctacaatgggtcctgtctttcctcgtgctgggtaagctggggctcagagggtcagggcaggcggggatgttagagagctgaggggtccttcttggtcccctatcaagtgctgtaccccaggcaggcttggggactcagtgagattcagtgggaggtggtggtatggttcccatttcacagatagaaagcccaagtctcagagaaggtgagtaacttgtccaaagtcacacatttgagtccaggtctacaggaccgcccccccgcaccacccccaaagcatgtgctgttcccacatgccaccctgcctcccaacagacattttcctataggcacgttgcattgtcttaggctggt。

二酰甘油酰基转移酶2(diacylglycerolacylt-ransferase，dgat2)是一种完整的内质网细胞微粒体酶，是催化甘油三酸脂合成最后一步反应的酶，也是甘油三酸酯合成过程中的唯一关键酶。

进一步地，第14436个碱基位点在牛生长性状的优势等位基因为g等位基因；优势基因型为gg基因型。

一种上述的分子标记在选育牛生长性状检测中的应用。

一种检测引物，所述引物用于检测上述述的分子标记；所述引物对的核苷酸序列如序列表seqidno.2-seqidno.3所示。引物如下：

正向引物：f5′-tgcccctctcatgtctaggaa-3′，如seqidno.2所示；

反向引物：r5′-gaccagcctaagacaatgcaac-3′，如seqidno.3所示。

进一步地，本发明提供一种试剂盒，该试剂盒含有上述的检测引物，该试剂盒用于检测与牛生长性状相关的分子标记。

进一步地，上述的检测引物在检测dgat2基因中突变位点的应用。

一种选育水牛的方法，通过对待测水牛进行上述的snp标记的检测，评估待测水牛的繁殖性状，选择具有牛生长性状的优势等位基因和基因型个体开展育种工作。

优选地，上述技术方案中，选育水牛的方法，包括以下步骤：

(1)获取待检测水牛的dna，对提取的dna进行检测，得到dna模板；

(2)将所述检测引物和所述dna模板进行pcr扩增，得到pcr扩增产物；

(3)对所述pcr扩增产物进行测序，得到测序基因序列；

(4)将所测序基因序列与水牛群体标准基因序列进行对比，经过分析，得到待检测水牛基因中突变位点，确定基因中突变位点的基因型，选择目标基因型的个体用于培育高繁殖力的优势品种。

优选地，上述技术方案中，用于杂交育种的亲本之一，其snp分子标记含有等位基因g；snp分子标记为gg基因型的个体作为牛生长性状的优势个体。

优选地，上述技术方案中，所述牛生长性状为牛的体高。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)本发明一种与牛生长性状相关的snp分子标记，通过筛选与水牛生长性状相关的分子标记位点，丰富了水牛育种的分子标记遗传资源库。

(2)采用该分子标记对摩拉水牛进行选育，大大增加了对水牛生长性状选择的准确性，在育种中应予以保留携带此优势等位基因的个体，从而有利于提高牛群体的体长性状，作为潜在的遗传标记。

附图说明

图1是摩拉水牛dgat2基因nw_005783701.1pcr扩增产物的电泳图；

图2是摩拉水牛dgat2基因nw_005783701.1aa、gg、ag基因型测序峰图。

具体实施方式

下面结合附图，对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。

除非另有其它明确表示，否则在整个说明书和权利要求书中，术语“包括”或其变换如“包含”或“包括有”等等将被理解为包括所陈述的元件或组成部分，而并未排除其它元件或其它组成部分。

牛dgat2基因snp检测片段的获得及多态性位点检测方法的建立

一、牛血液基因组dna的提取

本发明的试验牛品种是广西水牛研究所的摩拉水牛。牛血液基因组dna的提取采用tiangen血液基因组提取试剂盒，按该试剂盒说明书进行牛基因组dna提取。对提取出的dna进行浓度和质量检测，置于-20℃冰箱保存备用。

二、牛dgat2基因snp遗传标记检测片段的获得

(1)pcr扩增

根据牛dgat2基因的基因组序列(genbankid：nw_005783701.1)中的snp遗传标记检测序列(如seqidno.1所示)设计一对引物，扩增多态性位点的片段。引物如下：

正向引物：f5′-tgcccctctcatgtctaggaa-3′，如seqidno.2所示；

反向引物：r5′-gaccagcctaagacaatgcaac-3′，如seqidno.3所示。

利用上述引物，以牛血液基因组dna作为模板，进行pcr扩增；

pcr反应体系为：

pcr反应条件如下：

pcr产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如附图1所示，其中泳道m为dl600marker，泳道1-4为牛的扩增片段，扩增片段大小为564bp。

dna扩增序列如下：

tgcccctctcatgtctaggaaggcgtctgtggggaggtgggctggtgtggggtactctgcagctgcagggaagggcggacaggctgacatctgtcttctgtctgtcacaggcactggctccagcatcctctctgccctccaggacctgttttctgtcacttggctcaataggtccaaggtagagaagcagctccaagtcatctcggtgctacaatgggtcctgtctttcctcgtgctgggtaagctggggctcagagggtcagggcaggcggggatgttagagagctgaggggtccttcttggtcccctatcaagtgctgtaccccaggcaggcttggggactcagtgagattcagtgggaggtggtggtatggttcccatttcacagatagaaagcccaagtctcagagaaggtgagtaacttgtccaaagtcacacatttgagtccaggtctacaggaccgcccccccgcaccacccccaaagcatgtgctgttcccacatgccaccctgcctcccaacagacattttcctataggcacgttgcattgtcttaggctggt。

(2)pcr产物纯化

用上海生工生物工程有限公司的gelextractionkit试剂盒对上述pcr扩增产物进行纯化，具体步骤见试剂盒说明书。

三、利用pcr产物直接测序法检测分子标记

将上述获得的pcr纯化产物直接送到华大基因进行测序，根据测序结果判定，该位点在检测群体中的基因型。利用chromas软件进行分析，结果如附图2所示，发现在该序列中的第191bp存在一处g>a等位基因突变，上述突变引起dgat2基因的多态性。

dgat2基因的分子标记在摩拉水牛中的多态性分布检测

本分子标记在56头摩拉水牛中检测牛dgat2基因第14436个碱基g>a位点的多态性分布规律，检测结果如表1所示。

表1摩拉水牛dgat2基因基因型频率和等位基因频率

注：表1括号外的为个体数，括号内的为基因型频率。

从表1中可以看出a等位基因频率要明显大于g等位基因频率。

表2摩拉水牛dgat2基因第14436个碱基的多态性与生长性状间的关联分析

数值上标的字母相同表示差异不显著，字母不同时，大写字母表示差异极显著，小写字母表示差异显著。

由表2可以看出，在摩拉水牛中，第14436个碱基g>a位点的gg基因型个体的体高都极显著高于aa和ag基因型个体(p<0.01)，因此g等位基因是优势等位基因，在育种中应予以保留携带此优势等位基因的个体，从而有利于提高牛群体的体长性状，作为潜在的遗传标记。

前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。

序列表

<110>广西壮族自治区水牛研究所

<120>一种与牛生长性状相关的snp分子标记及其应用

<141>2021-06-28

<160>3

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>562

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

tgcccctctcatgtctaggaaggcgtctgtggggaggtgggctggtgtggggtactctgc60

agctgcagggaagggcggacaggctgacatctgtcttctgtctgtcacaggcactggctc120

cagcatcctctctgccctccaggacctgttttctgtcacttggctcaataggtccaaggt180

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<210>2

<211>21

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

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<210>3

<211>22

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

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