一种以基因工程水稻表达和制备重组瑞替普酶的方法与流程

1.本发明属于生物技术领域，具体涉及以基因工程水稻为生物反应器，表达和分离纯化重组瑞替普酶的方法。


背景技术：

2.瑞替普酶(reteplase，简称r
‑
pa)为第三代溶栓药物，分子量约39.6kda，355个氨基酸组成，是重组人组织型纤溶酶原激酶(tissue
‑
type plasminogen activator，t
‑
pa)的衍生物，可以使纤维蛋白溶解酶原激活为有活性的纤溶蛋白溶解酶，以降解血栓中的纤维蛋白，发挥溶栓作用。r
‑
pa适用于成人由冠状动脉梗塞引起的急性心肌梗塞的溶栓疗法，能够改善心肌梗塞后的心室功能。
3.心脑血管疾病是危害人类生命和健康的主要疾病之一，其中血栓类疾病的发病率、致残率和死亡率均远远高于其他疾病。据我国卫生部资料显示，我国有超过千万的血栓病患者，每年死于血栓疾病的人数就超过200万，占总死亡人数的50％以上，且血栓疾病在我国已呈现明显上升趋势。目前国内溶栓药物市场以第一代、第二代产品为主，其中阿替普酶(t
‑
pa)、蚓激酶和纤溶酶收入占比分别为30％、29％、26％，排名前三位，均为国家医保乙类产品。第二代的阿替普酶是国外使用最多的溶栓剂，我国市场上的阿替普酶则完全依赖进口，勃林格殷格翰的爱通立占有100％的市场份额。阿替普酶的一个主要劣势是半衰期短，仅为4
‑
6分钟，需要持续静脉给药。第一代溶栓剂已经退出欧美市场，但是由于价格便宜，仍然在我国基层医院广泛使用，占有极大的市场份额。第三代溶栓药物r
‑
pa是应用基因工程技术将天然人组织纤溶酶原激活剂t
‑
pa的fg(指型区)，egf(生长因子区)，k1(环状结构域)区去除，保留了第1～3和176～527位氨基酸的一种非糖基化重组组织纤溶酶原激活剂，也就是t
‑
pa的中间缺失体，删除了与肝内灭活相关的结构区域。因此，具有较长的半衰期(15～18min)，无免疫原性，能拮抗一些抑制剂，溶栓能力强，给药方便，不需要按个体给药，可短时间，小剂量给药，快速溶栓，相比于第二代溶栓药物t
‑
pa具有提高特异性溶栓效率、延长半衰期，减少全身系统性出血，且具有血管再通率高、无过敏反应、无毒副作用等优点，故r
‑
pa具有更大的应用前景。
4.目前已成功在大肠杆菌、酵母菌、哺乳动物细胞以及丝状真菌中进行了r
‑
pa的表达，但是至今未见有关使用水稻胚乳来大规模生产重组瑞替普酶的报道，涉及到的纯化方法：(1)大肠杆菌表达后形成无活性的包涵体，体外需要进行二硫键配对复性，利用刺桐胰蛋白酶抑制剂(eti)能够特异性结合r
‑
pa的特点，用eti
‑
sepharose 4b亲和层析柱，分离得到r
‑
pa；(2)利用转基因兔乳表达r
‑
pa，通过硫酸铵沉淀、酸碱沉淀、超滤、亲和层析(lysine hyperd、blue sepharose 6ff)、离子交换(sp bestarosetm ff)、凝胶过滤(surpdex g75)等方法分离纯化r
‑
pa，未见有关从水稻种子中分离纯化重组瑞替普酶方法的报道。国内市售药派通欣在大肠杆菌中表达，但是大肠杆菌表达后无活性，需要体外复性等操作，而利用水稻胚乳细胞表达系统来高效表达重组r
‑
pa克服了需体外复性等操作，具有绿色、安全、容易规模化等优点。


技术实现要素：

5.本发明的一个目的是提供一种规模化的利用水稻胚乳细胞生物反应器来高效表达重组瑞替普酶，从基因工程水稻种子中提取和分离纯化重组瑞替普酶(osrpa)的方法。
6.为实现水稻胚乳细胞高效表达重组瑞替普酶目的，本发明提供一种从重组瑞替普酶基因工程水稻中提取和分离纯化重组瑞替普酶的方法，包括下述步骤：
7.(1)构建在水稻种子中表达重组瑞替普酶的植物表达载体，所述载体含有经水稻密码子优化的瑞替普酶基因；
8.(2)用步骤(1)所述的表达载体遗传转化水稻，获得基因工程水稻，栽培后获得重组瑞替普酶基因工程水稻种子；
9.(3)从步骤(2)所述的重组瑞替普酶基因工程水稻种子中提取含重组瑞替普酶的粗提取物；
10.(4)将步骤(3)获得的含重组瑞替普酶的粗提取物经阳离子交换层析，得到初级产物i；
11.(5)将步骤(4)获得的初级产物i经疏水层析，得到含重组瑞替普酶的中级产物ii；
12.(6)将步骤(5)获得中级产物ii经苯甲脒亲和层析，得到纯化的重组瑞替普酶。
13.优选的技术方案为：
14.(1)构建包含如seq id no.1所示的经水稻密码子优化的瑞替普酶基因的植物表达载体；
15.(2)用上述植物表达载体遗传转化水稻获得基因工程水稻，栽培后获得重组瑞替普酶基因工程水稻种子；
16.(3)从重组瑞替普酶基因工程水稻种子中提取含有重组瑞替普酶的粗提取物；
17.(4)将含有重组瑞替普酶的粗提取物经阳离子交换层析，得到初级产物i，其中所述阳离子交换层析的介质为nanogel 50sp；
18.(5)采用疏水层析对初级产物i进行中级纯化，获得中级产物ii，其中所述疏水层析的介质为unihr phenyl 30l；
19.(6)采用亲和层析对中级产物ii进行末级纯化，获得纯化的重组瑞替普酶，其中所述的亲和层析介质为博格隆benzamidine bestarose 4ff。
20.根据本发明的一个优选实施方式：
21.步骤(3)中，将重组瑞替普酶基因工程水稻晒干脱壳，加工成半精米，研磨成80～100目的米粉；米粉与提取缓冲液按照1：5(重量/体积，kg/l)的比例混匀，在24～26℃提取2～3小时，获得重组瑞替普酶提取混合物；提取混合物中加入2％
‑
5％的珍珠岩压滤，滤液再经0.22μm滤膜过滤后即为重组瑞替普酶的粗提取物，其中所述提取缓冲液的成分为：20mm磷酸盐缓冲液，500mm氯化钠，ph7.5；
22.步骤(4)中，采用离子交换层析介质进行初级分离纯化，离子交换层析填料包括nanogel 50sp，nanoq 30l，nanogel 50q，unigel 30q，unigel 80q，unigel mmc 50s和unigel mma 50s(苏州纳微科技股份有限公司)，优选使用nanogel 50sp填料进行初级分离纯化。用4
‑
6倍柱体积(cv)的ph为6.5的20mm磷酸盐和130mm氯化钠缓冲液，以200～250cm/h的线性流速平衡层析柱；将上述的重组瑞替普酶粗提取物与ph6.5的20mm磷酸盐缓冲液按照体积比1：2.5混匀稀释，0.22um滤膜过滤后作为上样液，最佳上样液电导为14～16ms/cm，
其中上样液ph为6.4～6.6，上样体积不超过221cv；采用ph为6.5的20mm磷酸盐和180mm氯化钠缓冲液，以200～250cm/h的流速进行40cv杂质蛋白洗脱，最佳洗杂缓冲液电导为20ms/cm；采用ph为6.5的20mm磷酸盐和280mm氯化钠缓冲液，以200～250cm/h的流速进行50cv重组瑞替普酶的洗脱，最佳洗脱缓冲液电导为28～32ms/cm，收集富含重组瑞替普酶的洗脱液，获得含重组瑞替普酶的初级产物i；
23.步骤(5)中，采用疏水层析介质进行中级分离纯化，疏水层析填料包括unihr phenyl 80l ls(苏州纳微科技股份有限公司)，unihr phenyl 30l(苏州纳微科技股份有限公司)，octyl 4ff(博格隆(上海)生物技术有限公司)，phenyl low sub(博格隆(上海)生物技术有限公司)，优选使用unihr phenyl 30l(苏州纳微科技股份有限公司)填料的层析柱进行中级分离纯化。用5～10cv的ph6.5，20mm磷酸盐和0.37m硫酸铵缓冲液，以350～400cm/h的流速平衡层析柱；用3m硫酸铵调节重组瑞替普酶初级产物i的电导为59～61ms/cm，ph调整为6.5，作为上样液，最佳上样液电导为60ms/cm，全部上样；采用ph6.5，含0.5％甘油的20mm磷酸盐和260mm硫酸铵的缓冲液进行20cv杂质蛋白洗脱，最佳洗杂缓冲液电导为45ms/cm；采用ph6.5，含0.5％甘油的20mm磷酸盐和68mm硫酸铵的缓冲液进行20cv重组瑞替普酶的洗脱，最佳洗脱缓冲液电导为15ms/cm，收集富含重组瑞替普酶的洗脱液，获得含重组瑞替普酶的中级产物ii；
24.步骤(6)中，采用亲和层析填料进行末级分离纯化，亲和层析填料包括benzamidine 4ff(072j低配基和191j高配基，苏州纳微科技股份有限公司)及benzamidine bestarose 4ff(博格隆(上海)生物技术有限公司)，优选使用benzamidine bestarose 4ff(博格隆(上海)生物技术有限公司)填料。用5～10cv的ph7.5，20mm磷酸盐和68mm硫酸铵缓冲液，以350～400cm/h的流速平衡层析柱；将中级产物ii的ph调整为7.5，作为上样液，全部上样；采用ph6.0的20mm磷酸盐缓冲液进行10cv杂质蛋白洗脱；采用ph4.8～5.2的20mm磷酸盐和20mm醋酸盐缓冲液进行5cv重组瑞替普酶的洗脱，最佳洗脱缓冲液的ph为5.0，收集富含重组瑞替普酶的洗脱液，获得纯化的重组瑞替普酶。
25.根据本发明的另一方面，提供一种植物表达载体，包括：
26.1)合成如sed id no.1所示的经水稻密码子优化的瑞替普酶基因序列；
27.2)构建水稻胚乳细胞特异性表达的重组瑞替普酶表达载体；
28.3)将步骤2)中获得的载体转化水稻愈伤组织中，经培养，筛选和诱导获得转重组瑞替普酶基因工程水稻植株；
29.其中，所述重组瑞替普酶表达载体优选具有如图2所示的结构。
30.本发明构建了在水稻胚乳细胞中表达的重组瑞替普酶表达载体，在水稻中成功地表达了重组瑞替普酶，建立了提取并纯化该瑞替普酶的方法。本发明的方法无需体外复性，安全性高，容易规模化，所获得的重组瑞替普酶达到98％以上的hplc纯度。
附图说明
31.图1.pospmp773质粒结构示意图。
32.图2.pospmp774质粒结构示意图。
33.图3.pospmp775质粒结构示意图。
34.图4.基因工程水稻部分植株目的基因的pcr检测。其中m为dna标准分子量marker；
1～24分别为t1代转基因材料的不同植株。
35.图5.不同提取条件下重组瑞替普酶粗提物sds
‑
page和wb检测结果。其中m为标准分子量marker；1
‑
15分别表示表1中1～15不同提取条件，lgc为背景植株。
36.图6.不同提取条件下重组瑞替普酶粗提物溶圈活性检测结果。其中纤维蛋白平板1～5中，编号1～6为标曲检测，7～12依次为1～15不同提取条件下提取液进行20倍和40倍稀释检测。
37.图7.不同提取ph，温度和时间对重组瑞替普酶粗提物sds
‑
page和wb检测结果。a中m为标准分子量marker；7.0～10.0分别表示不同提取ph，lgc为背景植株。红色箭头分别对应目的条带和降解带。b中1～6表示提取时间(小时)，过夜表示过夜提取，007表示775
‑
214
‑
49
‑
007批号米粉，006表示775
‑
214
‑
49
‑
006批号米粉。
38.图8.初级纯化离子交换层析介质的选择。a中m为标准分子量marker；load表示上样液，ft表示穿透液，10～80表示不同的电导(ms/cm)，2m表示2m氯化钠；b中上图为含瑞替普酶粗体液1倍稀释后的样品检测，ft1表示上样10cv后的穿透液，ft2表示上样20cv后的穿透液，load表示上样液；下图为含瑞替普酶粗体液4倍稀释后的样品检测，ft1表示上样5cv后的穿透液，ft2表示上样20cv后的穿透液，load表示上样液；c中20，30，50，70和80表示不同的电导(ms/cm)，2m表示2m氯化钠。
39.图9.初级纯化阳离子交换填料nanogel 50sp层析优化。a中l表示上样液，ft表示穿透液，30，40和70表示不同的电导(ms/cm)，2m表示2m氯化钠，e表示洗脱液；b中l表示上样液，ft表示穿透液，20，25和32表示不同的电导(ms/cm)，1m表示1m氯化钠；c中l表示上样液，ft表示穿透液，18，32和40表示不同的电导(ms/cm)，1m表示1m氯化钠，2m表示2m氯化钠。
40.图10.初级纯化阳离子交换填料nanogel 50sp层析载量确认。l表示上样液，ft表示穿透液，w表示洗杂液，e1为25ms/cm的洗脱液，e2为28ms/cm的洗脱液，e3为32ms/cm的洗脱液，e1
‑
托表示e1的拖尾，1m表示1m氯化钠。
41.图11.中级纯化疏水层析介质的选择。l表示上样液，ft表示穿透液，1～8表示梯度洗脱样品编号。
42.图12.中级纯化疏水填料unihr phenyl 30l层析条件优化。a中m为标准分子量marker，l表示上样液，1～6表示梯度洗脱样品编号，elu表示最终洗脱样品；b中m为标准分子量marker，l表示上样液，ft表示穿透液，w表示洗杂液，e1表示含0.5％甘油的15ms/cm洗脱液，e2表示含10％乙醇的16ms/cm洗脱液。
43.图13.末级亲和纯化介质bgl benzamidine 4ff层析优化。a中m为标准分子量marker，6.5，6.0，5.5，3.0为不同的ph值，2，4，10和15为不同的电导(ms/cm)，l为上样液，ft为穿透液，w为洗杂液，e为洗脱液；b中l为上样液，ft为穿透液，w为洗杂液，1～4为分段收集的样品，nak为磷酸氢二钠和磷酸二氢钾缓冲液，naac为醋酸钠缓冲液，e为洗脱液，e浓代表洗脱液浓缩液。
44.图14.3批小试工艺层析图谱。
45.图15.3批小试工艺重组瑞替普酶样品电泳检测结果，其中m为标准分子量marker。
46.图16.3批小试工艺重组瑞替普酶rp
‑
hplc检测结果。
具体实施方式
47.以下将通过实施例和附图以详细说明本发明的技术方案，从而更好地阐述本发明的特点和优势。所提供的实施例应被解释为对本发明方法的举例说明，而不以任何方式限制本发明揭示的技术方案。
48.实施例中使用的试剂和仪器，除特殊说明以外，均为普通市售。
49.【实施例1】高效表达重组瑞替普酶基因工程水稻的制备
50.1.重组瑞替普酶基因表达载体的构建
51.本实施例选用水稻特异性启动子gt13a及其信号肽来介导重组瑞替普酶基因在水稻胚乳细胞中表达。根据瑞替普酶基因序列(genbank登记号：ku053049.1)，委托南京金斯瑞生物科技有限公司根据水稻偏好的遗传密码子合成，具体如seq id no.1所示，经水稻偏好密码子优化后的核苷酸改变了23.2％，密码子改变了32.3％，但其对应的氨基酸序列没有变化，构建的质粒为pospmp773(图1)。将所述合成的经密码子优化的瑞替普酶基因(seq id no.1)用mlyi和xhoi酶切后克隆到经naei和xhoi酶切的pospmp003中，经t4连接酶构建一个中间载体质粒pospmp774(图2)，将长度为2386bp的含gt13a启动子，信号肽序列及密码子优化的瑞替普酶基因和nos终止子的整个表达盒插入到经hindiii和ecori酶切双元表达载体pcl300，构建农杆介导菌质粒，命名为pospmp775(图3)
52.2.基因工程水稻遗传转化
53.将pospmp775质粒转化到根癌农杆菌eha105(美国invitrogen公司)，通过根癌农杆菌介导将pospmp775转化到水稻品种lgc的愈伤组织中，经培养、筛选和诱导后形成完整的植株。具体方法如下：
54.(1)愈伤组织诱导
55.将成熟的水稻种子脱壳后用70％乙醇浸泡灭菌1分钟，20％次氯酸钠再处理30分钟；用无菌水清洗5～7次后，将种子接种到诱导培养基(n6培养基)上，每皿接种6～8粒，在32℃光照处理大约5～7天。
56.(2)农杆菌制备
57.将含有表达载体pospmp775的农杆菌进行扩大培养，在卡拉霉素抗性平皿中涂菌，28℃培养箱中培养2～3天；用接种环取农杆菌单菌落接种到悬浮培养基(aam液体培养基)中，在28℃摇菌培养。
58.(3)农杆菌侵染(共培养)
59.将愈伤组织转移到灭菌的三角瓶中，调整农杆菌悬浮液od
600
值于0.05～0.1；将种子悬浮在aam培养基中，侵染1.5分钟，期间持续摇晃；弃菌液，用无菌滤纸吸干多余的菌液，将愈伤组织取出置于无菌滤纸上沥干30～45分钟；将无菌滤纸放在2n6‑
as培养基上，再将含有as(乙酰丁香酮，250mg/ml)的500μlaam滴在直径9cm的无菌滤纸上，将侵染过的愈伤组织放在滤纸上，25℃黑暗共培养3天。
60.(4)水洗和筛选
61.将共培养的愈伤组织转移到灭菌的三角瓶中，用无菌水清洗愈伤组织5～7次；用含0.5g/l浓度的头孢霉素灭菌水浸泡感染的愈伤组织约30分钟，然后在28℃，180～200rpm摇20～30分钟；倒掉含有抗生素的灭菌水，将三角瓶倒置于含滤纸的灭菌培养基中大约15分钟晾干后，转移愈伤组织到含有hpt抗生素的筛选培养基上培养20～30天。
62.(5)愈伤组织分化
63.将经过20～30天选择后具有hpt抗性的愈伤组织转移到分化培养基(n6培养基)上，在26℃光照培养20～30天。
64.(6)生根
65.从分化培养基中挑选出分化后的小苗，转移到含有1/2的ms培养基上进行生根培养，在28℃光照培养30天后，转移到田间生长。
66.3.基因工程水稻鉴定
67.(1)水稻基因组dna提取
68.取t0代hpt阳性再生苗的叶片约2cm，分别放入离心管中，编号；加入600μl ctab提取缓冲液(2％ctab，1.38m nacl，0.1m tris
‑
hcl，20mm edta，ph8.0)，在震荡破碎机震荡，65℃保温60分钟，期间不时摇动；加入等体积的氯仿/异丙醇，轻缓颠倒离心管混匀，室温下，12000rpm离心10分钟；将上清液转入另一新的1.5ml离心管中，加入等体积的异丙醇，缓慢颠倒离心管混匀，室温下放置60分钟；12000rpm离心10分钟，去上清，70％乙醇漂洗，沉淀风干；风干后的dna加入80μl的te缓冲液溶解dna，
‑
20℃保存备用。
69.(2)目的基因pcr扩增检测
70.取1μl水稻基因组dna作为模板，设置阳性(质粒dna)和阴性(无菌水)对照；利用重组瑞替普酶正向引物gt13a
‑
f(sed id no.2：5
’‑
agctaccagggcaacagcga
‑3’
)和反向引物r
‑
pa
‑
r(sed id no.3：5
’‑
agctgctgatgaggatgccg
‑3’
)进行pcr扩增，产物理论大小为670bp；pcr扩增反应体系(25μl体系)：2.5μl 10x buffer，0.15μl rtaq酶(5u/μl)，4μl dntp(2.5mm)，引物各0.5μl；加ddh2o至25μl；pcr扩增条件：94℃预变性5分钟，94℃变性30秒，59.8℃退火反应30秒，72℃延伸45秒，35个循环，最后72℃延伸10分钟；扩增产物经1％琼脂胶，eb染色后150v，200ma电泳15分钟，凝胶成像仪中观察结果。
71.鉴定结果表明，通过根癌农杆菌介导转化获得87株阳性的重组瑞替普酶转基因水稻，部分基因工程水稻目的基因pcr鉴定结果如图4所示。
72.4.重组瑞替普酶表达量的鉴定
73.将获得的重组瑞替普酶阳性苗移栽到室温中生长至成熟，收种能够正常结实的单株。采用dy7449
‑
05(r&d)试剂盒进行阳性单株的定量检测，捕获抗体包板后，取10μl的蛋白提取液稀释1000倍，加入酶标板中，室温孵育2小时；采用含0.05％吐温20的磷酸钠缓冲液洗板后，加入100μl检测抗体，室温孵育2小时；洗板后加入100μl hrp
‑
链霉亲和素，室温反应20min后洗板，每孔加入100μltmb室温避光显色15～20分钟，加入50μl 2m硫酸终止反应，od450读数。
74.鉴定结果表明，重组瑞替普酶阳性转基因水稻有42个单株表达瑞替普酶蛋白，表达量从1.9μg/g到62.5μg/g，其中有5个表达量较高的单株，表达量范围在41.2～62.5μg/g。
75.seq id no.1：
76.1 agctaccagg gcaacagcga ctgctacttc ggcaacggca gcgcctaccg cggcacccac
77.61 agcctcaccg agagcggcgc cagctgcctc ccgtggaaca gcatgatcct catcggcaag
78.121 gtgtacaccg cccagaaccc gagcgcccag gccctcggcc tcggcaagca caactactgc
79.181 cgcaacccgg acggcgacgc caagccgtgg tgccacgtgc tcaagaaccg ccgcctcacc
80.241 tgggagtact gcgacgtgcc gagctgcagc acctgcggcc tccgccagta cagccagccg
81.301 cagttccgca tcaagggcgg cctcttcgcc gacatcgcca gccacccgtg gcaggccgcc
82.361 atcttcgcca agcaccgccg cagcccgggc gagcgcttcc tctgcggcgg catcctcatc
83.421 agcagctgct ggatcctcag cgccgcccac tgcttccagg agcgcttccc gccgcaccac
84.481 ctcaccgtga tcctcggccg cacctaccgc gtggtgccgg gcgaggagga gcagaagttc
85.541 gaggtggaga agtacatcgt gcacaaggag ttcgacgacg acacctacga caacgacatc
86.601 gccctcctcc agctcaagag cgacagcagc cgctgcgccc aggagagcag cgtggtgcgc
87.661 accgtgtgcc tcccgccggc cgacctccag ctcccggact ggaccgagtg cgagctcagc
88.721 ggctacggca agcacgaggc cctcagcccg ttctacagcg agcgcctcaa ggaggcccac
89.781 gtgcgcctct acccgagcag ccgctgcacc agccagcacc tcctcaaccg caccgtgacc
90.841 gacaacatgc tctgcgccgg cgacacccgc agcggcggcc cgcaggccaa cctccacgac
91.901 gcctgccagg gcgacagcgg cggcccgctc gtgtgcctca acgacggccg catgaccctc
92.961 gtgggcatca tcagctgggg cctcggctgc ggccagaagg acgtgccggg cgtgtacacc
93.1021 aaggtgacca actacctcga ctggatccgc gacaacatgc gcccgtga
94.seq id no.2：
[0095]5’‑
agctaccagggcaacagcga
‑3’
[0096]
seq id no.3：
[0097]5’‑
agctgctgatgaggatgccg
‑3’
[0098]
【实施例2】从基因工程水稻中提取重组瑞替普酶
[0099]
1.重组瑞替普酶提取条件初步筛选
[0100]
将基因工程水稻脱壳后加工成半精米，研磨成80～100目的米粉，利用jmp软件选取提取ph(4
‑
10)、提取盐浓度(0
‑
0.5m)、提取温度(8
‑
37℃)三个因素，以r
‑
pa提取蛋白比活性(iu/mg)为响应值进行响应曲面设计，制表如下：
[0101]
表1不同提取条件设计
[0102]
实验编号提取ph提取盐浓度(mm)提取温度(℃)1102507.627250273425037410500275402767037772502784500279707.610100271142507.61275007.61310250371475003715725027
[0103]
称取15份米粉，每份1g于10ml离心管中，按照上表实验设计进行实验，每管加入5ml提取液，提取1h，10000g离心5min，取上清进行sds
‑
page/wb检测(图5)，elisa表达量检测和溶圈法活性检测(图6)。另称取1g lgc米粉用20mm pb，250mm nacl，ph7.0在27℃提取1h后同上处理，作为阴性对照。结果显示，重组瑞替普酶提取蛋白比活性对提取缓冲液的ph最敏感，其次是提取缓冲液的盐浓度。利用预测刻画器分析，在ph8.4，盐浓度为476mm，提取温度为18℃时，重组瑞替普酶提取的蛋白比活性最高。
[0104]
2.重组瑞替普酶提取条件确定
[0105]
(1)不同提取缓冲液ph对重组瑞替普酶提取的影响
[0106]
称取7份775
‑
214
‑
49
‑
007米粉，每份1g于10ml离心管中，然后向各管中依次加入5ml ph为7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0的磷酸盐提取液，25℃提取2h，10000g离心5min，取上清进行sds
‑
page/wb检测(图7a)，elisa表达量和溶圈活性检测。另称取1g lgc米粉用ph10.0提取液在25℃提取2h后同上处理，结果显示，随着提取ph的升高，r
‑
pa降解带逐渐增多，提取液的ph高于8.5时降解带开始出现，因此可控制提取缓冲液的ph为7.5
‑
8.0，减少降解产生，降低后续纯化工艺难度，elisa表达量和溶圈活性检测结果表明ph7.5时，重组瑞替普酶提取液中蛋白比活性最高，因此，确定重组瑞替普酶的提取ph为7.5。
[0107]
(2)不同提取温度和提取时间对重组瑞替普酶提取的影响
[0108]
称取10份1g 775
‑
214
‑
49
‑
007r
‑
pa米粉和2份1g 775
‑
214
‑
49
‑
006r
‑
pa米粉，按照w/v＝1：5的比例向其中加入5ml 20mm pb，500mm nacl，ph7.5提取液，分别按照25℃提取1h，2h，4h，6h和过夜(21h)，4℃提取1h，2h，4h，6h和过夜(21h)；提取完后，10000g离心10min，取上清进行sds
‑
page/wb检测(图7b)，elisa表达量和溶圈活性检测。结果显示，重组瑞替普酶在4℃下提取的含量和活性都低于25℃提取，过夜提取后，重组瑞替普酶含量和活性都降低，提示不能过夜提取，确定重组瑞替普酶提取温度为25℃，提取时间为2h。因此，确定重组瑞替普酶的提取条件：20mm pb，500mm nacl，ph7.5，25℃，提取2h。
[0109]
【实施例3】重组瑞替普酶的离子交换层析介质初级纯化
[0110]
1.初级纯化离子交换层析介质的选择
[0111]
根据实施例2中确定的提取条件制备含重组瑞替普酶的粗提物，然后采用ep管离心捕获法进行离子交换层析填料的初筛，上述离子交换层析填料包括nanogel 50sp，nanoq 30l，nanogel 50q，unigel 30q，unigel 80q，unigel mmc 50s和unigel mma 50s；通过设计不同的磷酸盐缓冲液上样电导和ph，以及nacl盐浓度梯度洗脱，结果显示，nanogel 50sp填料(ph 6.0和6.5，电导15.56ms/cm)可以结合重组瑞替普酶，wb显示重组瑞替普酶在ph6.0～6.5 30～40ms/cm和ph7.0～7.5 20～30ms/cm可以洗脱(图8a)；阴离子交换填料nanoq 30l，nanogel 50q，unigel 30q，unigel 80q在重组瑞替普酶的粗提物稀释1倍后上样10cv和20cv都穿透，稀释4倍后上样5cv部分穿透，上样20cv大量穿透(图8b)，说明阴离子交换填料对于提取液的载量小于5cv，不适合作为第一步捕获层析填料；unigel mmc 50s在ph6.5 100～500mm nacl上样没有穿透，但是重组瑞替普酶主要在0.5m naoh中洗脱，unigel mma 50s填料在ph7.5和ph8.0含250mm nacl磷酸盐缓冲液上样部分穿透，含100mm nacl磷酸盐缓冲液上样没有穿透，重组瑞替普酶在ph6.5 20mm pb 30～80ms/cm可以洗脱(图8c)。
[0112]
2.初级纯化阳离子交换填料nanogel 50sp层析优化
[0113]
根据实施例2中确定的提取条件制备含重组瑞替普酶的粗提物，利用20mm磷酸盐
缓冲液，加入不同浓度的氯化钠，设计ph为6.5的不同的上样电导16，17和18ms/cm，洗杂电导18，20和25ms/cm及洗脱电导32和40ms/cm，检测结果显示，nanogel 50sp上样电导为18ms/cm时，穿透液检测到微量瑞替普酶(图9a)，电导在16～17ms/cm时瑞替普酶未穿透(图9b)，说明上样电导需要控制在17ms/cm以下；洗杂电导由18ms/cm增加至20ms/cm时，洗杂液检测到轻微瑞替普酶，当洗杂电导增加25ms/cm时，大部分瑞替普酶洗脱下来(图9c)，表明洗杂电导不能超过20ms/cm；瑞替普酶在25ms/cm基本可以完全洗脱，32ms/cm，40ms/cm，1m nacl均能检测到少量的瑞替普酶(图9d)，确定洗脱电导范围为25～40ms/cm。
[0114]
3.初级纯化阳离子交换填料nanogel 50sp层析载量确认
[0115]
根据实施例2中确定的提取条件制备含重组瑞替普酶的粗提物，加入20mm磷酸盐缓冲液，使上样缓冲液的电导为16ms/cm后，分别上样100cv，75cv和60cv(稀释前的体积)，检测结果显示nanogel 50sp上样100cv，穿透液中检测到微量的瑞替普酶，洗杂液中也检测到部分瑞替普酶(图10a)，需降低上样量；上样75cv，穿透液中没有瑞替普酶，但是洗杂液中仍有少量瑞替普酶(图10b)，继续降低上样载量至60cv，无目的蛋白穿透，洗脱液e1(25.3ms/cm)，e2(28.1ms/cm)，e3(32.5ms/cm)中都能检测到瑞替普酶，但e3洗脱组分的杂蛋白(50kd杂带)占主要成分(图10c)，因此，确定nanogel 50sp上样载量为60cv，优化洗脱条件为ph6.5，电导为28～30ms/cm。
[0116]
【实施例4】重组瑞替普酶的疏水层析介质中级纯化
[0117]
1.中级纯化疏水层析介质的选择
[0118]
根据实施例2和3确定的提取和阳离子层析条件制备重组瑞替普酶初级产物i，初级产物i中添加硫酸铵，使上样液的硫酸铵浓度为0.6m，0.7m和0.8m，分别进行5ml unihr phenyl 80l ls，unihr phenyl 30l，bgl octyl 4ff，bgl phenyl low sub填料层析，结果显示bgl phenyl low sub以及octyl 4ff分离效果较差，unihrphenyl 30l分离效果与unihrphenyl 80l ls相当，但unihrphenyl 80l ls和unihrphenyl 30l的naoh洗脱组分均有一点疑似目的蛋白的条带(图11)。
[0119]
2.中级纯化疏水填料unihr phenyl 30l层析条件优化
[0120]
根据实施例2和3确定的提取和阳离子层析条件制备重组瑞替普酶初级产物i，初级产物i中添加硫酸铵，使上样液的硫酸铵浓度为0.4m，在0.5％甘油体系进行盐浓度梯度洗脱，结果显示在0.5％甘油体系下，瑞替普酶的降解带，缺氨基酸蛋白，糖基化蛋白和非糖基化蛋白具有一定的分离度(图12a)，最终确定0.5％甘油体系下，磷酸盐缓冲液电导为40～45ms/cm洗杂效果较好，15ms/cm洗脱效果较好(图12b)。
[0121]
【实施例5】重组瑞替普酶的亲和层析介质末级纯化
[0122]
1.末级亲和纯化层析介质的选择
[0123]
根据实施例2，3和4确定的提取，阳离子交换层析和疏水层析条件制备重组瑞替普酶中级产物ii，将中级产物ii的ph调整为7.5，加入不同浓度的氯化钠(0.1m，0.5m，1m)，分别进行5ml纳微苯甲脒
‑
4ff(072j)低配基，(191j)高配基，bgl benzamidine bestarose 4ff亲和填料层析，结果如下：
[0124] 0.1m nacl0.5m nacl1m nacl纳微苯甲脒
‑
4ff(072j)不结合不结合部分结合纳微苯甲脒
‑
4ff(191j)不结合结合结合
bgl benzamidine bestarose4ff结合结合结合
[0125]
说明bgl benzamidine bestarose 4ff与瑞替普酶结合力最强，选择bgl benzamidine bestarose 4ff进行后续层析优化。
[0126]
2.末级亲和纯化介质bglbenzamidine bestarose 4ff层析条件优化
[0127]
根据实施例2～4确定的提取，阳离子交换层析和疏水层析条件制备重组瑞替普酶中级产物ii，将中级产物ii的ph调整为7.5，作为bgl benzamidine beatarose 4ff的上样液，采用20mm磷酸缓冲液不同的ph(6.5，6.2，6.0)和不同的电导进行洗杂优化，结果显示20mm磷酸缓冲液，ph6.0，电导1.6ms/cm具有较好的洗杂效果(图13a)；采用不同ph(5.5，5.0)的缓冲液和电导进行洗脱优化，结果显示20mm磷酸缓冲液，20mm醋酸盐缓冲液，ph5.0，电导3.0ms/cm具有较好的洗脱效果(图13b)
[0128]
【实施例6】重组瑞替普酶3批小试工艺验证
[0129]
根据实施例2～5确定的最优提取、初级产物i纯化，中级产物ii纯化及末级产物iii纯化条件，进行3批小试工艺验证，验证过程及验证结果如下所述。
[0130]
1.重组瑞替普酶粗提物制备(提取)
[0131]
称取350g重组瑞替普酶米粉(775
‑
214
‑
17
‑
3)，加入1.75l 20mm pb，500mm nacl，ph 7.5提取液后，25℃提取2h；提取完成后，加入2％～5％(w/v)助滤剂，采用正压过滤的方式进行压滤。滤液加入2.5倍体积的20mm pb ph6.5样品稀释液，调整ph为6.5，0.22μm滤膜过滤后即为重组瑞替普酶粗提物(nanogel50sp层析上样液)。
[0132]
2.重组瑞替普酶初级产物i纯化
[0133]
采用4
‑
6倍柱体积(cv)的ph为6.5的20mm磷酸盐和130mm氯化钠缓冲液，以200～250cm/h的线性流速平衡填充有nanogel 50sp，装柱高度10cm的xk16/20层析柱，以上述重组瑞替普酶粗提物作为上样液进行上样，上样体积为221cv；采用ph为6.5的20mm磷酸盐和180mm氯化钠缓冲液，以200～250cm/h的流速进行40cv杂质蛋白洗脱；采用ph为6.5的20mm磷酸盐和280mm氯化钠缓冲液，以200～250cm/h的流速进行50cv重组瑞替普酶的洗脱，收集富含重组瑞替普酶的洗脱液，获得含重组瑞替普酶的初级产物i；
[0134]
3.重组瑞替普酶中级产物ii纯化
[0135]
采用5～10cv的ph6.5，20mm磷酸盐和0.37m硫酸铵缓冲液，以350～400cm/h的流速平衡填充有unihr phenyl 30l，装柱高度20cm的xk16/40层析柱；用3m硫酸铵调节重组瑞替普酶初级产物i的电导为59～61ms/cm，ph调整为6.5，作为上样液，全部上样；采用ph6.5，含0.5％甘油的20mm磷酸盐和260mm硫酸铵的缓冲液进行20cv杂质蛋白洗脱；采用ph6.5，含0.5％甘油的20mm磷酸盐和68mm硫酸铵的缓冲液进行20cv重组瑞替普酶的洗脱，收集富含重组瑞替普酶的洗脱液，获得含重组瑞替普酶的中级产物ii；
[0136]
4.重组瑞替普酶末级产物iii纯化
[0137]
采用5～10cv的ph7.5，20mm磷酸盐和68mm硫酸铵缓冲液，以350～400cm/h的流速平衡填充有bgl benzamidine 4ff，装柱高度20cm的c10/40层析柱；将中级产物ii的ph调整为7.5，作为上样液，全部上样；采用ph6.0的20mm磷酸盐缓冲液进行10cv杂质蛋白洗脱；采用ph5.0的20mm磷酸盐和20mm醋酸盐缓冲液进行5cv重组瑞替普酶的洗脱，收集富含重组瑞替普酶的洗脱液，获得纯化的重组瑞替普酶(末级产物iii)。
[0138]
结果显示，层析图谱如图14所示，3批小试层析图谱基本一致，sds
‑
page纯度检测
结果如图15所示，非还原样品纯度大于99％，rp
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hplc纯度检测结果如图16所示，纯度大于98％，蛋白平均得率为21.5mg/kg米粉，蛋白平均比活性为4.92x105iu/mg。