一种与花生分枝角度紧密连锁的分子标记AhyBA1及其应用

本发明涉及农业生物技术领域，特别是涉及一种与花生分枝角度紧密连锁的分子标记ahyba1及其应用。

背景技术：

花生是我国重要的油料和经济作物，年种植面积7000万亩左右，产量约1700万吨。提高花生产量和实现机械化生产是花生育种和栽培的主要目标。花生是“地上开花、地下结果”作物，分枝角度直接影响果针入土、膨大及荚果产量，也与种植密度、栽培方式及机械化收获密切相关。因此，分枝角度对于提高花生产量和实现机械化均具有重要意义。

根据分枝与主茎的夹角及分枝与主茎长度的比例，国内将花生分为直立型、匍匐型和半匍匐型三类(万书波，2003)。匍匐型花生的机械化程度高，平均亩产也要高于直立型(张新友，2018，中国油料作物学会年会报告)。匍匐型花生的果针距离地面更近，入土结荚率更高。另外，匍匐型花生具有用种量少等优点，而且在机械收获的过程中，匍匐型花生出土后可以直接翻过来在田间进行晾晒，由于分枝的支撑，可以避免荚果与地面接触，并有效减少霉菌等滋生，对于防治花生黄曲霉毒素污染非常重要。因此，匍匐型花生将是花生育种的重要方向。

由于花生的分枝角度等决定花生株型的性状容易受到环境因素影响，在田间选择理想株型的花生新材料需要多年的重复性试验，育种效率非常低。另外，调控花生株型的位点与生育期等有很多不利性状连锁，在后代选择过程中，筛选到株型理想且综合性状优良的新材料费时费力。与田间的表型选择相比，分子标记辅助选择以基因型鉴定为主，可以提高后代选择的准确性、缩短育种周期。因此，明确花生株型形成的分子基础，鉴定与花生株型紧密连锁的分子标记，对于培养理想株型的花生新品种具有重要意义。

目前关于花生株型的研究多集中在栽培管理方面，关于花生株型的遗传及分子机理的研究较少。coffelt(1997)的研究认为花生的分枝角度是受两个基因控制的，并且认为匍匐型相对于直立型为显性的。为了更好的统计性状，fonceka等(2012)将分枝与主茎的角度将花生的分枝习性分为了6个等级，进一步定位了6个与花生分枝习性相关的qtl位点，分别位于a03、a07、b04、b05、b06和b10连锁群。galya等(2017)利用集群分离分析法将控制花生分枝角度的qtl位点定位在b05染色体约1.1mb的区间内。这些研究进展，为精细定位花生分枝习性的qtl基因提供了重要的参考。li等(2019)通过构建花生高密度遗传连锁图谱，将控制花生分枝角度的主效qtl位点也定位在b05染色体。最近，张晓军等(2019)鉴定了与花生株型相关的基因lba5，并申请了该基因(专利申请号：cn201910994923.6)及相关的caps分子标记(专利申请号：cn201910988619.0)的专利。以上内容为揭示花生分枝角度形成的分子机制及通过生物技术改良花生的株型奠定了基础。特别是专利(专利申请号：cn201910988619.0)公开的caps分子标记将是花生株型分子改良的重要选择。caps标记是基于酶切的扩增多态性序列标记技术，在实际操作过程中，需要先通过pcr扩增，然后对扩增产物纯化，再对扩增产物进行酶切，然后再进行电泳，过程相对繁琐，而且内切酶的价格较高，会增加分子检测的成本。因此，开发方便、快速、准确的鉴定花生分枝角度的标记具有重要的应用价值。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种与花生分枝角度紧密连锁的分子标记ahyba1及其应用，以解决上述现有技术存在的问题，该分子标记可用于花生分子育种及其品质改良，有利于快速得到新的种质资源。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供一种与花生分枝角度紧密连锁的分子标记ahyba1，所述分子标记ahyba1的特异性引物对包括：

核苷酸序列如seqidno.1所示的引物；

核苷酸序列如seqidno.2所示的引物。

seqidno.1：5'-taatacataaaataatgagtaaatataataaaa-3'；

seqidno.2：5'-ccctcatccattcttactgtcat-3'。

本发明还提供利用上述的与花生分枝角度紧密连锁的分子标记ahyba1鉴定花生分枝角度的方法，包括以下步骤：

(1)提取花生种子或者叶片dna；

(2)采用上述的特异性引物对对所提取的dna进行pcr扩增；

(3)经步骤(2)得到的扩增产物进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，若出现174bp大小的特征条带，则判定待测花生材料下代为匍匐型品种。

进一步地，在步骤(2)中，所述pcr扩增总体积25ul：dna模板20-30ng/ul1ul，特异性引物对0.5pmol/ul各0.5ul，10mmdntpmix0.5ul，10×taqbuffer2.5ul，25mmmgcl22.0ul，taq酶5u/ul0.25ul，加水至25ul。

进一步地，在步骤(2)中，所述pcr扩增反应条件：预变性95℃4min；94℃30s，58℃30s，72℃25s，35个循环；72℃延伸5min。

进一步地，在步骤(3)中，采用8％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。

本发明还提供一种如上述的与花生分枝角度紧密连锁的分子标记ahyba1的应用，所述分子标记ahyba1位于15号染色体157.42-157.58mb的区域内，所述分子标记ahyba1用于花生育种和/或花生品质改良中。

进一步地，用于准确筛选花生的株型。

进一步地，用于辅助筛选和培养匍匐型花生新品种。

本发明公开了以下技术效果：

本发明提供了一种可以鉴定匍匐型品种花生的分子标记ahyba1，花生的株型受主效基因的控制，但也容易受到环境的影响。因此，通过肉眼筛选和培育匍匐或者直立的花生品种存在很大的盲目性，而且需要在花生出苗后才能观察。利用本发明提供的标记，可以在播种之前，从种子上切取少量的子叶，然后通过对子叶dna的检测，提前确定植株的株型，提高育种效率。而且，花生是异源四倍体，a和b亚基因组等位基因高度同源，很多标记难以区分a05和b05染色体，本发明的分子标记是通过多次科学的实验和摸索后筛选出来的，结果可靠，可信度高。

本发明的分子标记是简单的pcr标记，技术要求简单。与caps分子标记相比，不需要经过酶切、纯化、回收等步骤，直接通过pcr扩增和电泳即可实现鉴定，对仪器操作要求也比较低，采用常规实验的常规仪器均可操作，具有快速、高效、低成本的特点。

本发明的分子标记方便、快速、准确且低成本，可以有效的鉴定花生的分枝角度，一方面有助于基因的精细定位、分离与克隆，另一方面对于花生的分子育种和品质改良都具有重要的应用价值。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为花生分枝角度主效基因的精细定位；

图2为在后代材料中对分子标记ahyba1进行验证；

图3为分子标记辅助轮回选择的育种方案快速培育匍匐型花生新品种。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

实施例1：控制花生分枝角度关键基因的定位及与花生分枝角度紧密连锁的分子标记ahyba1的设计

为了定位控制花生分枝角度的关键基因，发明人利用匍匐型花生品种tifrunner作为母本与直立型花生品种伏花生(父本)杂交。表型分析表明，匍匐型花生品种“tifrunner”的分枝紧贴地面生长，与主茎之间的夹角呈80°至90°；直立型花生品种“伏花生”的分枝翘起，与地面完全分离，与主茎之间的夹角呈30°至40°。其后代f1与主茎的夹角角度介于父母本之间，呈50°至70°。总共收获了70个tifrunner×伏花生的杂交f1种子，利用分子标记对f1植株其进行检测，发现了25株真的杂交f1代。f2代自交后总共获得332个f2单株。根据对f2单株的分枝角度的统计结果，分别挑选30株直立型植株和匍匐型植株构建极端池，与亲本一起进行全基因组重测序。通过集群分离分析法bsa-seq(bulkedsegregantanalysis，bsa)将控制分枝角度的qtl定位在chr15：150-160mb的区间内。为了进一步缩小定位区间，在该区间内设计30个indel分子标记和30个kasp分子标记，最终将控制分枝角度的qtl定位在chr15：157.42-157.58mb的区间内，其贡献率为29.84％，lod值为21.49(图1)。在候选区间内，通过序列分析和比对，经过筛选后发现分子标记ahyba1在直立型和匍匐型品种中具有多态性，而且非常稳定(图2)。

实施例2：利用分子标记ahyba1快速培育高产匍匐型花生新品种

通过利用分子标记ahyba1进行选择并结合回交选育的方法可以在3年左右将直立型花生(轮回亲本)改良为匍匐型的花生，并且保留轮回亲本97％以上的遗传背景，可以在保留直立型花生品种原有绝大部分优异性状的前提下，实现株型的定向改良。

以直立型花生海花9号作为轮回亲本，匍匐型花生tifrunner作为供体父本，花生株型快速改良的具体步骤如下：

(1)杂交

以直立型花生海花9号为母本(轮回亲本)，匍匐型花生品种tifrunner为父本，进行杂交。杂交方法如下：在母本海花9号开花后几天开始去雄，一般是每天16：00以后去雄。用左手的拇指和中指捏住花蕾的基部，右手持镊子轻轻将花萼、旗瓣、翼瓣拨开，再用左手的食指和拇指压住已拨开的花瓣，然后用镊子轻压龙骨瓣的弯背处，使花蕊露出，用镊子一次或多次将8个雄蕊的花药摘除去净，不要损伤雌蕊的柱头，再用手指将龙骨瓣推回原来位置。第2天早5:00-9:00对去雄的花朵进行人工授粉。授粉前先采集父本中花9号的花，然后，用镊子将父本花的花粉挤出，授粉时，用左手食指和中指托住去过雄的花朵，右手拇指或用镊子轻轻挤压龙骨瓣，使雌蕊柱头露出，再用镊子尖端蘸取花粉涂在柱头上。

(2)杂交f1真伪的鉴定

利用分子标记ahyba1对收获的杂交f1代的真伪进行鉴定。方法如下：

取样：收获母本植株所有的荚果，晾干后，对收获的所有种子进行编号。然后，利用手术刀去除部分种皮，然后切除部分子叶组织(大约30mg)，放入1.5ml离心管中，同时放入磁珠。剩余的花生种子放到冷库中进行保存，待检测后种到大田中。通过实验，证明花生种子在切除部分组织后，发芽率不受影响。

dna提取：提取待测花生种子的dna，具体方法如下：

(1)对装有花生组织的1.5ml离心管用液氮速冷，然后研磨；

(2)在65℃水浴中预热ctab提取液(2％ctab，1.4mol/lnacl，20mmo/ledta(ph8.0)，100mmol/ltris-hcl(ph8.0)，2％pvp-40)；

(3)估算样品组织的质量，每200mg样品中加700μl预热的ctab提取液，迅速混匀，在65℃温浴10～30min，期间混匀2～5次；

(4)加1倍体积的苯酚/氯仿/异戊醇(体积比12:12:1)，混匀；

(5)12000rpm室温离心10min；

(6)将上清转移至一新的离心管中；

(7)用氯仿/异戊醇(体积比24:1)重复(4)～(6)步；

(8)加0.7倍体积-20℃预冷的异丙醇，颠倒混匀，室温放置10min；

(9)12000rpm室温离心15min；

(10)倒掉上清，用500μl-20℃预冷的70％乙醇洗涤沉淀2～3次；

(11)沉淀干燥后，用50μl去离子水或te溶解dna，置于-20℃备用。

(12)吸取5μl溶解的dna，加入45μl去离子水，混匀制得花生的基因组dna待用。

pcr反应及电泳检测：利用分子标记ahyba1的特异性引物对(如seqidno.1和seqidno.2所示)对亲本及所有的f1杂种进行分子标记检测，根据电泳结果，包含父本和母本特异条带的为真的杂交种。

pcr扩增反应体系如下：

pcr扩增总体积20ul：

dna模板20-30ng/ul1ul，

ahyba1特异引物对0.5pmol/ul各0.5ul，

10mmdntpmix0.5ul，

10×taqbuffer2.0ul，

25mmmgcl22.0ul，

taq酶5u/ul0.20ul，

加水至20ul；

pcr反应条件：预变性95℃4min；94℃30s，58℃30s，72℃25s，35个循环；72℃延伸5min。

pcr扩增产物检测采用8％非变性聚丙烯酰胺凝胶(acr:bis＝39:1)电泳。

其中，配制8％变性聚丙烯酰胺凝胶方法如下；

在10μl扩增产物中加入3μl的指示剂即加样缓冲液(含有50mmtris-hclph8.0，50mmedta，0.25％溴酚蓝，0.25％二甲苯青，50％甘油)；

电泳缓冲体系为1×tbe(90mmtris-borateph8.3,2mmedta)，120v电泳4h左右。

30ml的8％非变性聚丙烯酰胺凝胶配制如表1所示：

表130ml的8％非变性聚丙烯酰胺凝胶配制

银染检测，方法如下：

a.0.1％硝酸银溶液500ml染色15-20min。

b.去离子水快速漂洗15sec左右。

c.显影液(1000ml去离子水+20gnaoh+0.5gna2co3，1.5ml甲醛现用现加)显色，不断摇动，直至dna条带清晰可见。

d.自来水漂洗。

e.扫描照相。

(3)回交和后代的筛选

采用分子标记辅助轮回选择的育种方案，每年两季，整个周期大约需要三年加代(图3)。首先，利用海花9号作为母本(轮回)，真杂种f1作为父本进行杂交，杂交的方法同上，对收获的bc1f1再次利用分子标记ahyba1进行检测，保留具有父本特异条带的后代，dna提取及分子标记检测的方法同上。连续进行4次回交和筛选，得到bc4f1代，然后进行自交，后选择纯和的后代，进行考种和品种登记。

由于花生的株型是数量性状，容易受到环境的影响。因此，通过肉眼筛选和培育匍匐型花生存在很大的盲目性。利用本发明提供的标记结合回交轮回选择的方法，可以提高育种效率，在3年左右时间内实现匍匐型花生的种质创新(图3)。与传统方法相比，效率更高。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

序列表

<110>山东省农业科学院

<120>一种与花生分枝角度紧密连锁的分子标记ahyba1及其应用

<160>2

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>33

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

taatacataaaataatgagtaaatataataaaa33

<210>2

<211>23

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

ccctcatccattcttactgtcat23