非小细胞肺癌患者ERCC1基因表达在利用铂类药物化疗中的应用的制作方法

本发明涉及生物医学领域，特别是涉及非小细胞肺癌患者ercc1基因表达在利用铂类药物化疗中的应用。
背景技术：
：肺癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一。非小细胞型肺癌(non-smallcelllungcancer，nsclc)包括鳞状细胞癌(鳞癌)、腺癌、大细胞癌，与小细胞癌相比其癌细胞生长分裂较慢，扩散转移相对较晚。非小细胞肺癌约占所有肺癌的80％，多数病例在确诊时已属晚期，虽然铂类新药化疗是目前治疗nsclc的基本方案，但有效率亦低，且肿瘤病人存在不同程度的异质性、对化疗的药物敏感性也不一样，所以依据耐药基因及药敏选择药物化疗成为了趋势。铂类抗癌药物与癌细胞dna分子作用，形成药物-dna分子配合物，破坏dna，从而抑制癌细胞分裂。目前，已有研究显示，核苷酸切除修复途径(ner)因具修复dna的作用而与铂类耐药关系密切，其中关于ercc1(excisionrepaircrosscomplementation1，切除修复交叉互补基因1)的研究较多，发现ercc1表达水平的高低与非小细胞肺癌的发病及预后都有紧密的关系。ercc1是重要的核苷酸外切修复酶之一，与xpf形成异源二聚体，在dna单链受损处的5′端进行剪切而发挥功能。ercc1的过表达可使停滞在g2/m期的损伤dna迅速修复，导致其对顺铂耐药，ercc1表达量直接影响dna的修复，因此ercc1可作为肿瘤细胞中药物-dna结合物修复能力的检测标志。另外多项独立临床研究表明ercc1的mrna在肿瘤组织中的表达量可以用来预测nsclc患者铂类药物的化疗疗效。即在早期术后患者中ercc1高表达者生存时间显著延长，预后好。而在接受铂类化疗的nsclc患者中，ercc1阳性表达者反而较阴性者预后差，ercc1阴性者无病生存期及总的生存期较阳性者明显延长，可作为指导预后的独立预测指标。当前，关于基因ercc1表达量检测的研究也在不断进行中，刘辉等曾报道选用了β-actin作为参比基因，得到的表达量以spss统计分析高表达和低表达，并以免疫组化作为金标准与之比较，结果显示采用荧光定量pcr检测ercc1mrna水平，检测结果的特异性和敏感度均显著提高，但是该专利对于pcr结果并未进行深入的截断值(cutoff值)分析等，降低了分析结果的准确性。目前的方法只是局限于检测端，对于结果评价没有很明确，没有数据库排序来确定表达水平。技术实现要素：鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种非小细胞肺癌患者ercc1基因表达在利用铂类药物化疗中的应用，用于解决现有技术中非小细胞肺癌的化疗中问题。本发明的构思：利用实时定量pcr技术检测大量来自目标患者(nsclc)的组织中基因ercc1表达量，并且对获得的数据进行分析，构建评分标准。对待检测患者进行实时定量pcr检测组织中基因ercc1表达量，根据检测获得的-△ct结合评分标准对患者利用铂类药物进行化疗的敏感性进行预判。ercc1靶标基因mrna序列参考genbank:nm_202001.3。本发明的另一方面提供了ercc1基因表达量在利用铂类药物治疗非小细胞型肺癌中的用途。进一步地，所述用途是指利用实时定量pcr的方法检测患者癌症组织中ercc1的表达量，根据检测获得的-△ct对治疗结果进行预判。进一步地，当所述所述-△ct<-8.11，判断为低表达，提示患者预期获益率较高；当所述-△ct为大于等于-8.11、且≤0.76，判断为中表达，提示患者预期获益率中等；当所述-△ct>0.76，判断为低表达，提示患者预期获益率较低。本发明的一方面提供了一种用于检测ercc1基因的试剂盒，所述试剂盒中含有探针和引物，所述探针的核苷酸序列如seqidno.3所示，所述引物包括正向引物和反向引物，所述正向引物的核苷酸序列如seqidno.1所示，所述反向引物的核苷酸序列如seqidno.2所示，所述探针的两端分别标记有荧光报告基团/荧光淬灭基团。进一步地，所述试剂盒中还含有用于检测内参基因的探针和引物。例如，人β-actin内参基因序列参考nm_001101.5。更进一步地，所述用于检测内参基因的探针的核苷酸序列如seqidno.6，所述用于检测内参基因的引物包括正向引物和反向引物，所述用于检测内参基因的正向引物核苷酸序列如seqidno.4所示，所述用于检测内参基因的反向引物核苷酸序列如seqidno.5所示。进一步地，试剂盒中所述荧光报告基团/荧光淬灭基团选自选自fam、vic或hex、rox、ned、cy3或cy5荧光报告基团bhq1、bhq2、bhq3、dabcy1、tamra和quencher基团。进一步地，所述试剂盒还包括以下组分中的任一种或几种：pcr反应液、酶混合液、阳性对照、阴性对照。进一步地，所述pcr反应液包括缓冲液、mgcl2、dutp和dntps；所述酶混合液包括taq酶、反转录酶和ung酶，所述taq酶为热启动taq酶，所述的反转录酶为依赖rna的dna聚合酶，所述的ung酶为尿嘧啶-n-糖基化酶。进一步地，所述阳性对照选自以下以下任一中或几种：含有部分人ercc1靶标基因mrna序列的假病毒。例如，含有人ercc1靶标基因mrna序列的非复制型慢病毒。含有部分人β-actin基因mrna序列的假病毒。例如，含有人β-actin基因mrna序列的非复制型慢病毒。进一步地，所述阴性对照为无菌水。本发明的另一方面提供了上述试剂盒在制备治疗非小细胞型肺癌产品中的用途。如上所述，本发明的非小细胞肺癌患者ercc1基因表达的应用，具有以下有益效果：(1)本发明的试剂盒结果评价明确，数据库排序来确定表达水平，图形化的结果分析，弥补了现有技术的不足。(2)本发明还具有灵敏度高、特异性好、可重复性强、检测通量大、防污染性强、检测结果快速客观、节约成本等优点。附图说明图1显示为试剂盒灵敏度实验结果图。图2显示为试剂盒特异性实验结果图。图3显示为ercc1基因中等表达量检测结果示意图。图4显示为ercc1基因高表达量检测结果示意图。图5显示为ercc1基因低表达量检测结果示意图。图6显示为100例回顾性分析案例观察结果。具体实施方式以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。须知，下列实施例中未具体注明的工艺设备或装置均采用本领域内的常规设备或装置。此外应理解，本发明中提到的一个或多个方法步骤并不排斥在所述组合步骤前后还可以存在其他方法步骤或在这些明确提到的步骤之间还可以插入其他方法步骤，除非另有说明；还应理解，本发明中提到的一个或多个设备/装置之间的组合连接关系并不排斥在所述组合设备/装置前后还可以存在其他设备/装置或在这些明确提到的两个设备/装置之间还可以插入其他设备/装置，除非另有说明。而且，除非另有说明，各方法步骤的编号仅为鉴别各方法步骤的便利工具，而非为限制各方法步骤的排列次序或限定本发明可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容的情况下，当亦视为本发明可实施的范畴。实施例1检测试剂盒及其使用试剂盒包括以下组分：pcr反应液、酶混合液、检测反应液，阳性对照一、阴性对照；pcr反应液包括10×缓冲液、25mmmgcl2、10mmdutp和10mmdntps；酶混合液包括taq酶、反转录酶和ung酶，检测反应液(含seqidno.1、2、3、4、5、6、)上游下游引物、及探针的配比为：4:4:2；上游引物为400nm，下游引物为400nm，探针为200nm。本实施例中使用的引物和探针的核苷酸序列可参见表1。表1检测反应液引物和探针的核苷酸序列表注：x1、x2、x3、为荧光报告基团，y1、y2、y3、为荧光淬灭基团。阳性对照：组分(1)：含有部分人ercc1靶标基因mrna序列的假病毒；即含有人ercc1靶标基因mrna序列的非复制型慢病毒。组分(2)：含有部分人β-actin基因mrna序列的假病毒；即含有人β-actin基因mrna序列的非复制型慢病毒；阴性对照：为无菌水。试剂盒的使用一、先进行样本的采集与保存，要求如下：收集获得非小细胞肺癌临床癌组织,按照金麦格石蜡组织rna提取纯化的方法抽提癌组织和正常组织的总rna，通过核酸蛋白测定仪测定260nm和280nm处光密度值计算rna的纯度和浓度。该样本即为待测样本。样本采集后应及时检测，也可-20℃保存待测，保存期一般不超过7天，长期保存请置于-70℃。样本避免反复冻融，采用干冰或冰袋低温运输。二、检测方法1.试剂准备(试剂准备区)表2反应液配制1(样本检测)：反应液组份加量(μl/反应)pcr反应液5检测反应液5酶混合液5总体积15表3反应液配制2(阴性对照)：反应液组份加量(μl)/每反应pcr反应液5检测反应液5酶混合液5总体积15表4反应液配制3(阳性对照)：反应液组份加量(μl)/每反应pcr反应液5检测反应液5酶混合液5总体积152.样本处理(样本处理区)2.1脱蜡2.1.1切片8μm×10张，置1.5mlep管2.1.2.脱蜡：加二甲苯1200μl，震荡混匀，8600rpm，10min×32.1.3.无水乙醇1200μl，震荡混匀，8600rpm，5min×22.1.4.吸弃乙醇，37℃烤箱干燥30min2.2实验前，从4℃取出蛋白酶k平衡至室温；48人份板：取出1块预封装96深孔板，在第一列和第七列对应数量的样品孔内，每个孔都加入10μl蛋白酶k。96人份板：取出预封装的裂解液板，每个孔都加入10μl蛋白酶k。2.348人份板：将96深孔板移至生物安全柜中，在第一列和第七列对应数量的样品孔内，每个孔加入标本各2000μl。96人份板：每个孔加入标本各2000μl。2.448人份板：加样完成后将96深孔板移至dof-9648仪器中(a1位置在最左上角)，插入磁针套，点击程序，运行核酸提取仪。96人份板：加样完成后按照仪器设置将五块板分别放置在dof-9696pro正确位置，在裂解液板上插上磁针套，点击“校准”，调试完成后点击运行程序进行核酸提取。2.5仪器运行结束后，洗脱液板即为提取好的核酸。核酸提取完成后，立即将提取物进行封膜处理。2.6在生物安全柜内，向pcr扩增管中加入5μl待测核酸样品，终体积为20μl每管，盖紧管盖，瞬时低速离心，在rt-pcr仪上进行检测。3.pcr扩增表5荧光检测通道选择及扩增循环参数设定注：不选rox校正，淬灭基团选none。设置完毕，保存文件，运行反应程序。三、检验结果分析在仪器正常，阴性参考品、阳性参考品曲线，均正常的情况下，将阀值线调整至背景信号及阴性扩展线以上，按照以下公式进行计算：-△ct＝-(ct(内参)-ct(靶基因))实施例2试剂盒的灵敏性试验阳性对照参考品为ercc1基因mrna序列的非复制型慢病毒及部分人β-actin基因序列的非复制型腺病毒，通过专业机构合成；10倍梯度稀释至500拷贝每毫升。阴性参考品为无rna酶水，无rna酶水1000ml，然后在灭菌锅中121℃，20min高温灭菌，做好标记，室温保存。采用本发明试剂盒进行检测。检测结果表明：本发明试剂盒对于ercc1基因mrna序列的检测具有良好的灵敏性，达到500拷贝每毫升，并且ct值随浓度减少呈梯度改变。见图1。实施例3试剂盒的特异性试验为了检测本发明人ercc1基因mrna序列核酸检测试剂盒(荧光pcr法)的特异性，用本发明ercc1基因mrna核酸检测试剂盒(荧光pcr法)检测ercc2基因mrna、胸苷酸合成酶(tyms)mrna、乳腺癌易感基因1(brca1)mrna、野生型人dna样本、非人类基因组mrna、流行性感冒病毒(a及b型)等。检测结果表明：本发明检测试剂盒能特异性扩增ercc1基因mrna序列，而不与常见其它靶标基因的mrna发生交叉反应(内标正常扩增，其他靶标无任何扩增曲线出现)，见图2。以上结果说明本发明的试剂盒在临床上普遍适用，且灵敏度高，特异性好，且操作过程省时省力。实施例4对100例实验数据分析根据实施例1中100例实验结果，分析得到的cut-off值如下：低表达：-△ct<-8.11，判断为低表达。中表达：-8.11≤-△ct≤0.76，判断为中表达。高表达：-△ct>0.76，判断为高表达。检测结果的解释及临床应用建议：低表达：提示以铂类为基础的化疗药物敏感度较高，患者预期获益率较高；中表达：提示以铂类为基础的化疗药物敏感度中等，患者预期获益率中等；高表达：提示以铂类为基础的化疗药物敏感度较低，患者预期获取率较低。较高：预期获益率高于中等表达和高表达组；中等：预期获益率低于低表达组，同时高于高表达组；较低：预期获益率低于低表达组和中等表达组。ercc1表达数据库得出了ercc1基因相对表达量判断标准，试剂具有了一定的灵敏性和特异性，可以作为指导nsclc患者进行铂类化疗是否有耐药性的重要手段，对预测铂类化疗预后的效果具有积极的指导意义，具体判例如图3-5。实施例5检测回顾性分析1.研究对象：选择i-ii期的非小细胞肺癌患者，术后ffpe组织100例。2.患者要求：术后使用铂类为基础的辅助化疗，有近5年内的随访数据，评价的每例标本对应的患者必须有无进展生存率(pfs)的数据，pfs越长，通常表示疗效越好。3.分组：根据实施例1中所描述的方案，对nsclc患者进行分组，共分为低表达、中表达、高表达三组，结合每组的pfs数据进行生存分析。4.数据分析：spss19.0，生存分析，统计方法为logrank(mantel-cox)，p值<0.05被认为差异具有统计学意义。分析结果如表6-8以及图4。5.结论：根据上述描述的方案进行分组后，低、中、高表达组，pfs依次降低，且差异具有显著性(p<0.001)；ercc1低表达、中表达、高表达组，获益可能性依次降低。表6个案处理摘要表7生存表的均值和中位数a.如果估计值已删失，那么它将限制为最长的生存时间。表8整体比较卡方dfsig.logrank(mantel-cox)23.6192.000为分组的不同水平检验生存分布等同性。以上的实施例是为了说明本发明公开的实施方案，并不能理解为对本发明的限制。此外，本文所列出的各种修改以及发明中方法、组合物的变化，在不脱离本发明的范围和精神的前提下对本领域内的技术人员来说是显而易见的。虽然已结合本发明的多种具体优选实施例对本发明进行了具体的描述，但应当理解，本发明不应仅限于这些具体实施例。事实上，各种如上所述的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包括在本发明的范围内。序列表<110>常州国药医学检验实验室有限公司<120>非小细胞肺癌患者ercc1基因表达在利用铂类药物化疗中的应用<160>6<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>19<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1aggtccctcctggagtggc19<210>2<211>22<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2agatggcatattcggcgtaggt22<210>3<211>32<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3caagcccttattccgatctacacagagccttc32<210>4<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>4gcactcttccagccttcctt20<210>5<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>5cggatgtccacgtcacactt20<210>6<211>25<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>6cctgggcatggagtcctgtggcatc25当前第1页12