复方干细胞与抗癌组合物制作方法及工艺与流程

1.本发明涉及到复方(干细胞)与抗癌组合物制备技术领域，尤其涉及复方干细胞与抗癌组合物制作方法及工艺。


背景技术：

2.作为生物工程学技术中的植物干细胞培养方法被世界生物界评价为不会诱发环境问题，且作为可稳定的供给植物来源有用的物质最理想的技术。从各种植物细胞系培养有价值的物质与从植物中直接提取生产方法相比之下有许多的优点，尤其是与以往的提取方法不同，它不受外部环境的影响，可持续大量的培育和生产，被认为是可解决如生态系统被破坏的问题最好的方法。尤其是那些具有较强抗癌活性而较稀缺植物资源的细胞培育与大量扩增更不为多见。这是因为，在多种复杂的细胞培养中，离体材料的褐化、细胞增殖与生产过程中细胞变异仍是失败的主要原因。
3.在植物全息、全能表达系统中和在利用植物细胞中，诸多的植物细胞分化组织，例如枝叶、茎、种子、根系等都是以丧失分裂能力的永久组织，所以，为将转变为具有分裂能力的细胞系必需先进行脱分化过程。所述脱分化过程是指用植物体的一种组织或某器官培养时，解决组织或细胞已经施行特定功能而分化的状态，即使这样的脱分化过程中由染色体变异还会出现细胞系的严重变异坏象，尤其是通过植物细胞培养生产过程中，只要能保证在长期培养期间稳定的维持较快细胞增殖与高的代谢物质时，其生产能力方可产业化，能够克服变异问题，在通过植物细胞培养有较高应用价值的物质生产中，获得遗传稳定的细胞系最佳工艺及方案是切实可行的。
4.对此，本发明中参考了只利用植物的茎采集的形成层而诱导愈伤组织的方法的形成层诱导了愈伤组织，愈伤组织是脱分化发生后形成的组织，对此所述方法仍存有由脱分化的细胞产生变异的问题。
5.但是，属于百合科的虎眼万年青植物的球茎进行离体培养其细胞系也仍然要去解决其脱分化的变异问题，以获取可稳定增殖的遗传稳定性高的细胞系。目前我国仅南方几省区的花卉苗园有零星小量栽培，要作为大量的制药和应用于临床，还存在着原料难求的局面。


技术实现要素：

6.本发明的目的就在于为了解决上述问题而提供复方干细胞与抗癌组合物制作方法及工艺。
7.本发明通过以下技术方案来实现上述目的：
8.复方干细胞与抗癌组合物制作方法及工艺，它包括以下步骤：
9.步骤1：离体材料的制备
10.优选生长4年的虎眼万年青球茎，水冲洗球茎表面的附着物及泥土等杂质，放入110mg、l抗坏血酸和1％l的苯菌灵混合溶液中杀菌处理10分钟，然后用无菌磁化水洗涤10
分钟，在放入75％的乙醇液中杀菌1分钟，在放入30％的过氧化氢液中杀菌20分钟，然后再用无菌蒸馏水冲洗10分钟；
11.步骤2：固态培养基的制备
12.(1)准备硝酸钾2510mg，硫酸胺136mg，硫酸镁123mg，硫酸锰10mg，硫酸锌2.5mg，硫酸铜0.026mg，氯化钙114mg，碘化钾0.7mg，氯化钴0.026mg，磷酸二氢钠131mg，硼酸2.8mg，钼酸钠0.26mg，乙二胺四乙酸铁钠盐37mg，肌醇210mg，硫胺素21mg，烟酸2.2mg，吡哆醇2.2mg，l
‑
抗坏血酸52mg，柠檬酸74mg，l
‑
天冬氨酸135mg，l
‑
精氨酸176mg，甘氨酸76mg，脯氨酸116mg，a
‑
萘乙酸2.2mg，蔗糖10.100mg，活性炭200mg，琼脂3.100mg，磁化水0.63升，备用；
13.(2)将无机盐类各养分分别用20ml磁化水稀释，将维生素类合并放入50ml无菌磁化水中稀释，将氨基酸类合并放入50ml无菌磁化水中稀释，将生长素放入10ml无菌磁化水中稀释，然后将稀释后的无机盐类分别注入烧瓶磁化水中，边注入边搅拌，在将糖类、固化剂、活性炭放入，全部溶解后，封口，进行高压灭菌30分钟，降温取出后，在将稀释的维生素和氨基酸溶液、生长素溶液分别放入搅匀后，冷凝；
14.步骤3：离体材料诱导及形成层分离培养的制备
15.(1)将灭菌的虎眼万年青球茎用接种刀切成4段，去掉最外层，取第二层和第三层的内包层，分别切成1
‑
2cm的小方块，移入培养基中，在受控的暗室内避光培养28天，培养温度25
±
1℃，培养28天后，将形成层细胞群体用接种勺或接种铲轻轻将其移入另一同样培养基烧瓶内，再放大培养23天；
16.(2)然后在将其放大培养的细胞系群体移入液态培养基中，在暗室中，用旋转摇床以100rpm，25
±
1℃培养，传代时间为20天；
17.步骤4：液态培养基的制备
18.(1)准备硫酸镁181mg，硫酸锰23mg,硫酸锌8.9mg，硫酸铜0.23mg，硝酸钙473mg，硝酸胺400mg，氯化钙60mg，碘化钾995mg，钼酸钠0.24mg，硼酸6mg，磷酸氢钠170mg，乙二胺四乙酸铁钠盐37mg，肌醇210mg，硫胺素21mg，烟酸2.2mg，吡哆醇2.2mg，l
‑
抗坏血酸60mg，柠檬酸75mg，l天冬氨酸135mg，l
‑
精氨酸178mg，甘氨酸75mg，脯氨酸116mg，a
‑
萘乙酸2mg，蔗糖30.100mg，麦饭石颗粒50000mg，锗石50000mg，磁化水1升，备用；
19.(2)将无机盐类各养分分别用20m1磁化水稀释，将维生素类合并放入50m1无菌水中稀释，将生长素放入10ml无菌水中稀释，然后将稀释后的无机盐分别注入烧瓶磁化水中，边注入边搅拌，在将糖类，固化剂、活性炭放入，全部溶解后，进行高压灭菌30分钟，降温取出后，在将稀释的维生素溶液、氨基酸溶液、生长素溶液分别放入搅匀后，冷凝；
20.步骤5：生物反应器内的培养
21.将来自虎眼万年青球茎离体材料形成层细胞系在烧瓶的干细胞移入10升的气升式生物反应器内放大培养，培养基用表2中的液态培养基放大培养10天后，再向内加入蔗糖10g和甲基茉莉酮酸酯1mg，无菌磁化水0.5升的混合液再继续培养10天；
22.步骤6：细胞系的提取分离
23.(1)将培养液用1um的过滤器过滤，滤去培养液，收集截留的细胞系黏液质，放入一不锈钢容器内封口，放入35℃冰箱内预冻2小时后，在放进液氮罐内冷冻3小时，取出，在室温下维持30分钟后，在依次预冻、冷冻2次，共计冷冻3次；
24.(2)将冷冻3次的容器取出，室温下维持10分钟后，快速粉碎成60目粗冻粉，之后放
入80％的500ml乙醇中间接加热20℃搅拌48小时，然后放入离心机内以3.000rpm离心20分钟，取上清液；
25.(3)将离心机内乙醇不溶物取出，在加入100ml乙醇液，放进40hz超声波清洗机内，超声振荡10分钟，在依次离心20分钟，取上清液；
26.(4)将两次的离心上清液合并,通过旋转式低温36℃真空蒸发器内蒸发浓缩至原体积十分之四左右时，取出，进行低温冷冻真空干燥，即得所述的虎眼万年青干细胞乙醇提取物；
27.步骤7：复方中草药干细胞与抗癌组合物的制备
28.(1)将所述的中草药干细胞乙醇提取物1g，含量为45％的樟芝多糖6g，含量为45％的姬松茸多糖6g，蜂胶60g，l
‑
抗坏血酸0.3g，苯甲酸钠0.05g，无菌磁化水27ml，混溶后，放进一玻璃容器内，经40hz超声波清洗机内，超声振荡20分钟，然后将其按常规法制成口服液剂包方可饮用；
29.(2)将所述的中草药干细胞乙醇提取物0.1g溶解于60ml无菌磁化水中之后，加l
‑
抗坏血酸0.2g，柠檬酸1g，甘露糖醇6g，苯甲酸钠0.05g之后，再加无菌磁化水适量，将其制成100ml的功能性饮料剂包，方可饮用。
30.进一步的，本发明无机盐类包括植物细胞生长所需的氮、磷、钙、镁、硫大中量元素及铁、锰、锌、铜、硼、铝、钴等微量元素，大中量元素几乎在任何培养基中都是不可缺少的，它们是植物细胞生长所需的最基本的矿物质营养；本发明培养基中有机物质，在培养中所应用的有机物质，有维生素和氨基酸两大类，维生素能够直接参与植物细胞生命活动最重要的过程，如醇的合成，细胞蛋白质和脂肪的代谢等，植物离体材料或细胞系的培养的自身虽有合成维生素的能力，但还不能满足其细胞快速生长的需要，因此，在培养基中常添加一些维生素能够促进培养物形成层的细胞快速生长和一些器官的分化。
31.进一步的，本发明中的氨基酸是植物离体材料的形成层及细胞营养的补充氮源，能够促进细胞蛋白质及细胞核的合成，本发明中的肌醇(环乙六醇)本身虽没有什么直接的生长促进作用，但能协助其它活性物质发挥出许多作用，并能参与糖代谢，有间接促进不定胚细胞生长的作用。
32.进一步的，本发明中的糖类作为碳源在植物离体材料及形成层细胞系培养中是不可缺少的，常用的糖类有蔗糖、葡萄糖、果糖等，在本发明的培养基中采用蔗糖为好，它对虎眼万年青细胞系的生长和促进一些化合物的转化合成要好于其它糖种，本发明中植物细胞生长素a
‑
萘乙酸，是本发明中培养基内促进植物细胞生长至关重要的激进元素，尤其对细胞形态健成起着极其重要而明显的作用。
33.进一步的，本发明中将活性炭放入固态培养基内可有效的吸附酚及其它有害物质，能够保住所培养材料不褐化，同时也促使了形成层细胞系细胞的生长。
34.进一步的，本发明采用的固化剂
‑
琼脂，是一种从海藻中提取出来的一种凝胶剂，植物与细胞生长并不能利用它，但由于具有无毒、可塑、遇热溶化、冷却后固型化等特性，可使培养基中各种养分均匀地扩散分布。
35.进一步的，本发明中的离体材料灭菌之后，仅用于离体材料形成层细胞系的优选固态培养基成分如下表1所示：
[0036][0037][0038]
进一步的，所述步骤3中离体材料在诱导及形成层分离培养过程中，形成层细胞系移入烧瓶优选液态培养基按表1培养基制备方法的组成成分如表2所示：
[0039][0040][0041]
通过液态培养基表2中烧瓶内的形成层细胞系观查，用生物显微镜观查其细胞聚集的程度，结果如下表3所示，可以观查到悬浮培养基为存在大量的液泡，处在分化前的尚未分化状态。
[0042]
表3：悬浮培养的细胞聚集状
[0043][0044]
结果，从表3中可以看出，烧瓶内悬浮培养液中的细胞系细胞没有出现大细胞群和中等细胞群团块连接现象，仅有小量的小细胞群聚集，而绝大部分细胞均呈单个细胞状态下存在培养液中，说明虎眼万年青球茎离体材料形成层细胞系的细胞为干细胞，而且培养状态及活力良好。
[0045]
进一步的，为了实施规模化培养的可能性，将来自虎眼万年青球茎离体材料形成层细胞系在烧瓶的干细胞移入10升的气升式生物反应器内放大培养。
[0046]
培养液使用表2中的优选液态培养基，在受控暗室中25
±
℃下不间断搅拌，结果，看到细胞培养物在10升气升式生物反应器中细胞增量时间为3天，这与在烧瓶中悬浮培养增量时间12天提前了9天，而且细胞系显示了大约6
‑
7倍的生长速度，这与生长环境放大，加之在培养基使用的小分子磁化活性水和矿石颗粒经液流不间断的冲击而冲刷下来的诸多矿物质溶于培养液中，使培养基中细胞群得到天然、安全和足够利用的微量元素补充，同时，植物细胞群的聚集降低也与生物反应器内钢壁对剪切细胞应力的敏感性而使细胞聚集结连下降有直接关联。
[0047]
在10升气升式生物反应器内培养第10天后，再向内加入蔗糖10g和甲基茉莉酮酸酯1mg、无菌磁化水0.5升的混合液，继续培养10天，加入上述混合液的目的是补充营养并促使虎眼万年青形成层细胞在最后培养期内，加速其皂甙等化合物的形成。
[0048]
进一步的，本发明的功能性实验如下：
[0049]
(1)功能性口服液食品对人肝癌细胞凋亡及端粒酶活性的影响
[0050]
将5m1、10m1两个剂量单位的口服液分别处理肝癌细胞(hepg2)和乳腺癌细胞(mcf
‑‑
7)、白血病细胞hl
‑
60这三个癌细胞，用mtt法测定其各癌细胞生长与抑制率，通过形态学观查及流式细胞术检测各癌细胞的凋亡率。
[0051]
结果，两个剂量的一种中草药干细胞与抗癌组合物口服剂包对肝癌细胞、乳腺癌细胞、白血病细胞具有极为强烈的抑制作用，且呈时间依赖及剂量依赖性。分别用光镜及流式细胞术分析表明，5ml、10ml两个剂量的口服液分别处理24小时后观查，各癌细胞即出现极为明显的凋亡峰。对端粒酶活性的同步检测其后观查显示，两种不同剂量的一种中草药干细胞与抗癌组合物口服剂包随着剂量浓度增加，抑癌作用也就随之增大。当处理12小时时对端粒酶活性抑制率为肝癌细胞71
‑
83％、乳腺癌细胞73
‑
79、白血病细胞为69
‑
74％,处理24小时为79
‑
86％，74
‑
83％，处理72小时为(hep.g2)84
‑
98％,(mcf
‑
7)86
‑
95％,(hl
‑
60)为82
‑
98％即起变为阴性。
[0052]
本发明实验显示，只要时间延长其抑制作用就会逐渐增强，只要时间足够，即使偏小剂量或小含量的一种中草药干细胞与抗癌组合物口服剂包仍能对肝癌细胞、乳腺癌细胞、白血病细胞的增殖产生显著的抑制效果。
[0053]
本发明经患者口服试验其结果与如上所述的测试结果基本相同
[0054]
(2)患者口服试验
[0055]
通过50多例患有肺癌、小细胞性肺癌、鳞肺癌、乳腺癌、肝癌、胃癌、直肠癌、结肠癌、大肠癌、胆管癌、胰腺癌、皮肤癌、脑胶质瘤、骨癌、急性淋巴细胞性白血病、慢粒白血病、鼻咽癌、子宫内膜癌。自愿服用虎眼万年青干细胞口服液，每天2次，每次10m1，儿童每天2次，每次0.5m1，连服30天，其抑癌效果特别显著，50多例93％以上的患者都已达到治愈、近愈和好转的程度。
[0056]
本发明复方中草药干细胞与抗癌组合物口服细胞因子，作为实体瘤和非实体瘤综合治疗中的一种辅助疗法，是目前治疗各种癌症的一种新策略之一，这种方法有别于直接针对肿瘤相关抗原(taa)的抗体被动免疫治疗，抗体被动免疫治疗是利用抗体的天然效应机制来杀伤肿瘤细胞，一个重要特点就是提供一个主动的肿瘤免疫治疗工具，使细胞因子在肿瘤微环境中的浓度其活性增加，以加强肿瘤的免疫原性，使t细胞活化、增生，并发生免疫记忆，免疫细胞因子不受病人个体差异taa异质性的限制,因为只有相对较少的几个抗原位点是它们结合所必需的，肿瘤微环境中的免疫细胞因子能够激发和扩大t淋巴细胞、nk细胞，巨噬细胞以及粒细胞的免疫效应，这样就能够清除肿瘤细胞，并阻止其增生与转移。使肿瘤细胞能够有效地清除并且使机体产生长期的保护性免疫。
[0057]
本发明的有益效果在于：
[0058]
本发明通过分离虎眼万年青植物的形成层作为干细胞的来源，并在培养时采用先进工艺，严格避免干细胞在培养过程中出现变异，使得最终制备的功能性食品的组合物具有较强的抗癌活性，大大提高了组合物的药用价值以及药用效果，同时采用本发明制备方法来制备功能性食品组合物，能够实现组合物的量产，便于组合物的大规模推广应用。
具体实施方式
[0059]
复方干细胞与抗癌组合物制作方法及工艺，它包括以下步骤：
[0060]
步骤1：离体材料的制备
[0061]
优选生长4年的虎眼万年青球茎，水冲洗球茎表面的附着物及泥土等杂质，放入110mg、l抗坏血酸和1％l的苯菌灵混合溶液中杀菌处理10分钟，然后用无菌磁化水洗涤10分钟，在放入75％的乙醇液中杀菌1分钟，在放入30％的过氧化氢液中杀菌20分钟，然后再用无菌蒸馏水冲洗10分钟；
[0062]
步骤2：固态培养基的制备
[0063]
(1)准备硝酸钾2510mg，硫酸胺136mg，硫酸镁123mg，硫酸锰10mg，硫酸锌2.5mg，硫酸铜0.026mg，氯化钙114mg，碘化钾0.7mg，氯化钴0.026mg，磷酸二氢钠131mg，硼酸2.8mg，钼酸钠0.26mg，乙二胺四乙酸铁钠盐37mg，肌醇210mg，硫胺素21mg，烟酸2.2mg，吡哆醇2.2mg，l
‑
抗坏血酸52mg，柠檬酸74mg，l
‑
天冬氨酸135mg，l
‑
精氨酸176mg，甘氨酸76mg，脯氨酸116mg，a
‑
萘乙酸2.2mg，蔗糖10.100mg，活性炭200mg，琼脂3.100mg，磁化水0.63升，备用；
[0064]
(2)将无机盐类各养分分别用20ml磁化水稀释，将维生素类合并放入50ml无菌磁化水中稀释，将氨基酸类合并放入50ml无菌磁化水中稀释，将生长素放入10ml无菌磁化水中稀释，然后将稀释后的无机盐类分别注入烧瓶磁化水中，边注入边搅拌，在将糖类、固化剂、活性炭放入，全部溶解后，封口，进行高压灭菌30分钟，降温取出后，在将稀释的维生素和氨基酸溶液、生长素溶液分别放入搅匀后，冷凝；
[0065]
步骤3：离体材料诱导及形成层分离培养的制备
[0066]
(1)将灭菌的虎眼万年青球茎用接种刀切成4段，去掉最外层，取第二层和第三层的内包层，分别切成1
‑
2cm的小方块，移入培养基中，在受控的暗室内避光培养28天，培养温度25
±
1℃，培养28天后，将形成层细胞群体用接种勺或接种铲轻轻将其移入另一同样培养基烧瓶内，再放大培养23天；
[0067]
(2)然后在将其放大培养的细胞系群体移入液态培养基中，在暗室中，用旋转摇床以100rpm，25
±
1℃培养，传代时间为20天；
[0068]
步骤4：液态培养基的制备
[0069]
(1)准备硫酸镁181mg，硫酸锰23mg,硫酸锌8.9mg，硫酸铜0.23mg，硝酸钙473mg，硝酸胺400mg，氯化钙60mg，碘化钾995mg，钼酸钠0.24mg，硼酸6mg，磷酸氢钠170mg，乙二胺四乙酸铁钠盐37mg，肌醇210mg，硫胺素21mg，烟酸2.2mg，吡哆醇2.2mg，l
‑
抗坏血酸60mg，柠檬酸75mg，l天冬氨酸135mg，l
‑
精氨酸178mg，甘氨酸75mg，脯氨酸116mg，a
‑
萘乙酸2mg，蔗糖30.100mg，麦饭石颗粒50000mg，锗石50000mg，磁化水1升，备用；
[0070]
(2)将无机盐类各养分分别用20m1磁化水稀释，将维生素类合并放入50m1无菌水中稀释，将生长素放入10ml无菌水中稀释，然后将稀释后的无机盐分别注入烧瓶磁化水中，边注入边搅拌，在将糖类，固化剂、活性炭放入，全部溶解后，进行高压灭菌30分钟，降温取出后，在将稀释的维生素溶液、氨基酸溶液、生长素溶液分别放入搅匀后，冷凝；
[0071]
步骤5：生物反应器内的培养
[0072]
将来自虎眼万年青球茎离体材料形成层细胞系在烧瓶的干细胞移入10升的气升式生物反应器内放大培养，培养基用表2中的液态培养基放大培养10天后，再向内加入蔗糖10g和甲基茉莉酮酸酯1mg，无菌磁化水0.5升的混合液再继续培养10天；
[0073]
步骤6：细胞系的提取分离
[0074]
(1)将培养液用1um的过滤器过滤，滤去培养液，收集截留的细胞系黏液质，放入一不锈钢容器内封口，放入35℃冰箱内预冻2小时后，在放进液氮罐内冷冻3小时，取出，在室温下维持30分钟后，在依次预冻、冷冻2次，共计冷冻3次；
[0075]
(2)将冷冻3次的容器取出，室温下维持10分钟后，快速粉碎成60目粗冻粉，之后放入80％的500ml乙醇中间接加热20℃搅拌48小时，然后放入离心机内以3.000rpm离心20分钟，取上清液；
[0076]
(3)将离心机内乙醇不溶物取出，在加入100ml乙醇液，放进40hz超声波清洗机内，超声振荡10分钟，在依次离心20分钟，取上清液；
[0077]
(4)将两次的离心上清液合并,通过旋转式低温36℃真空蒸发器内蒸发浓缩至原体积十分之四左右时，取出，进行低温冷冻真空干燥，即得所述的虎眼万年青干细胞乙醇提取物；
[0078]
步骤7：复方中草药干细胞与抗癌组合物的制备
[0079]
(1)将所述的中草药干细胞乙醇提取物1g，含量为45％的樟芝多糖6g，含量为45％的姬松茸多糖6g，蜂胶60g，l
‑
抗坏血酸0.3g，苯甲酸钠0.05g，无菌磁化水27ml，混溶后，放进一玻璃容器内，经40hz超声波清洗机内，超声振荡20分钟，然后将其按常规法制成口服液剂包方可饮用；
[0080]
(2)将所述的中草药干细胞乙醇提取物0.1g溶解于60ml无菌磁化水中之后，加l
‑
抗坏血酸0.2g，柠檬酸1g，甘露糖醇6g，苯甲酸钠0.05g之后，再加无菌磁化水适量，将其制
成100ml的功能性饮料剂包，方可饮用。
[0081]
本实施例中，本发明无机盐类包括植物细胞生长所需的氮、磷、钙、镁、硫大中量元素及铁、锰、锌、铜、硼、铝、钴等微量元素，大中量元素几乎在任何培养基中都是不可缺少的，它们是植物细胞生长所需的最基本的矿物质营养；本发明培养基中有机物质，在培养中所应用的有机物质，有维生素和氨基酸两大类，维生素能够直接参与植物细胞生命活动最重要的过程，如醇的合成，细胞蛋白质和脂肪的代谢等，植物离体材料或细胞系的培养的自身虽有合成维生素的能力，但还不能满足其细胞快速生长的需要，因此，在培养基中常添加一些维生素能够促进培养物形成层的细胞快速生长和一些器官的分化。
[0082]
本实施例中，本发明中的氨基酸是植物离体材料的形成层及细胞营养的补充氮源，能够促进细胞蛋白质及细胞核的合成，本发明中的肌醇(环乙六醇)本身虽没有什么直接的生长促进作用，但能协助其它活性物质发挥出许多作用，并能参与糖代谢，有间接促进不定胚细胞生长的作用。
[0083]
本实施例中，本发明中的糖类作为碳源在植物离体材料及形成层细胞系培养中是不可缺少的，常用的糖类有蔗糖、葡萄糖、果糖等，在本发明的培养基中采用蔗糖为好，它对虎眼万年青细胞系的生长和促进一些化合物的转化合成要好于其它糖种，本发明中植物细胞生长素a
‑
萘乙酸，是本发明中培养基内促进植物细胞生长至关重要的激进元素，尤其对细胞形态健成起着极其重要而明显的作用。
[0084]
本实施例中，本发明中将活性炭放入固态培养基内可有效的吸附酚及其它有害物质，能够保住所培养材料不褐化，同时也促使了形成层细胞系细胞的生长。
[0085]
本实施例中，本发明采用的固化剂
‑
琼脂，是一种从海藻中提取出来的一种凝胶剂，植物与细胞生长并不能利用它，但由于具有无毒、可塑、遇热溶化、冷却后固型化等特性，可使培养基中各种养分均匀地扩散分布。
[0086]
本实施例中，本发明中的离体材料灭菌之后，仅用于离体材料形成层细胞系的优选固态培养基成分如下表1所示：
[0087][0088]
本实施例中，所述步骤3中离体材料在诱导及形成层分离培养过程中，形成层细胞系移入烧瓶优选液态培养基按表1培养基制备方法的组成成分如表2所示：
[0089][0090]
通过液态培养基表2中烧瓶内的形成层细胞系观查，用生物显微镜观查其细胞聚集的程度，结果如下表3所示，可以观查到悬浮培养基为存在大量的液泡，处在分化前的尚未分化状态。
[0091]
表3：悬浮培养的细胞聚集状
[0092][0093]
结果，从表3中可以看出，烧瓶内悬浮培养液中的细胞系细胞没有出现大细胞群和中等细胞群团块连接现象，仅有小量的小细胞群聚集，而绝大部分细胞均呈单个细胞状态下存在培养液中，说明虎眼万年青球茎离体材料形成层细胞系的细胞为干细胞，而且培养状态及活力良好。
[0094]
本实施例中，为了实施规模化培养的可能性，将来自虎眼万年青球茎离体材料形成层细胞系在烧瓶的干细胞移入10升的气升式生物反应器内放大培养。
[0095]
培养液使用表2中的优选液态培养基，在受控暗室中25
±
℃下不间断搅拌，结果，看到细胞培养物在10升气升式生物反应器中细胞增量时间为3天，这与在烧瓶中悬浮培养增量时间12天提前了9天，而且细胞系显示了大约6
‑
7倍的生长速度，这与生长环境放大，加之在培养基使用的小分子磁化活性水和矿石颗粒经液流不间断的冲击而冲刷下来的诸多矿物质溶于培养液中，使培养基中细胞群得到天然、安全和足够利用的微量元素补充，同时，植物细胞群的聚集降低也与生物反应器内钢壁对剪切细胞应力的敏感性而使细胞聚集结连下降有直接关联。
[0096]
在10升气升式生物反应器内培养第10天后，再向内加入蔗糖10g和甲基茉莉酮酸酯1mg、无菌磁化水0.5升的混合液，继续培养10天，加入上述混合液的目的是补充营养并促使虎眼万年青形成层细胞在最后培养期内，加速其皂甙等化合物的形成。
[0097]
本实施例中，本发明的功能性实验如下：
[0098]
(1)功能性口服液食品对人肝癌细胞凋亡及端粒酶活性的影响
[0099]
将5m1、10m1两个剂量单位的口服液分别处理肝癌细胞(hepg2)和乳腺癌细胞(mcf
‑‑
7)、白血病细胞hl
‑
60这三个癌细胞，用mtt法测定其各癌细胞生长与抑制率，通过形态学观查及流式细胞术检测各癌细胞的凋亡率。
[0100]
结果，两个剂量的一种中草药干细胞与抗癌组合物口服剂包对肝癌细胞、乳腺癌细胞、白血病细胞具有极为强烈的抑制作用，且呈时间依赖及剂量依赖性。分别用光镜及流式细胞术分析表明，5ml、10ml两个剂量的口服液分别处理24小时后观查，各癌细胞即出现极为明显的凋亡峰。对端粒酶活性的同步检测其后观查显示，两种不同剂量的一种中草药干细胞与抗癌组合物口服剂包随着剂量浓度增加，抑癌作用也就随之增大。当处理12小时时对端粒酶活性抑制率为肝癌细胞71
‑
83％、乳腺癌细胞73
‑
79、白血病细胞为69
‑
74％,处理24小时为79
‑
86％，74
‑
83％，处理72小时为(hep.g2)84
‑
98％,(mcf
‑
7)86
‑
95％,(hl
‑
60)为82
‑
98％即起变为阴性。
[0101]
本发明实验显示，只要时间延长其抑制作用就会逐渐增强，只要时间足够，即使偏小剂量或小含量的一种中草药干细胞与抗癌组合物口服剂包仍能对肝癌细胞、乳腺癌细胞、白血病细胞的增殖产生显著的抑制效果。
[0102]
本发明经患者口服试验其结果与如上所述的测试结果基本相同
[0103]
(2)患者口服试验
[0104]
通过50多例患有肺癌、小细胞性肺癌、鳞肺癌、乳腺癌、肝癌、胃癌、直肠癌、结肠癌、大肠癌、胆管癌、胰腺癌、皮肤癌、脑胶质瘤、骨癌、急性淋巴细胞性白血病、慢粒白血病、鼻咽癌、子宫内膜癌。自愿服用虎眼万年青干细胞口服液，每天2次，每次10m1，儿童每天2次，每次0.5m1，连服30天，其抑癌效果特别显著，50多例93％以上的患者都已达到治愈、近愈和好转的程度。
[0105]
本发明复方中草药干细胞与抗癌组合物口服细胞因子，作为实体瘤和非实体瘤综合治疗中的一种辅助疗法，是目前治疗各种癌症的一种新策略之一，这种方法有别于直接针对肿瘤相关抗原(taa)的抗体被动免疫治疗，抗体被动免疫治疗是利用抗体的天然效应机制来杀伤肿瘤细胞，一个重要特点就是提供一个主动的肿瘤免疫治疗工具，使细胞因子在肿瘤微环境中的浓度其活性增加，以加强肿瘤的免疫原性，使t细胞活化、增生，并发生免疫记忆，免疫细胞因子不受病人个体差异taa异质性的限制,因为只有相对较少的几个抗原位点是它们结合所必需的，肿瘤微环境中的免疫细胞因子能够激发和扩大t淋巴细胞、nk细胞，巨噬细胞以及粒细胞的免疫效应，这样就能够清除肿瘤细胞，并阻止其增生与转移。使肿瘤细胞能够有效地清除并且使机体产生长期的保护性免疫。
[0106]
本发明复方中草药干细胞与抗癌组合物的制备及工艺已具备了工厂化批量生产的技术条件，其提取物制备的口服液显示出了极高的免疫抗癌活性。
[0107]
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。